TRƯỜNG ĐẠI HỌC PHENIKAA
KHOA CNSH, HH VÀ KTMT ⸎⸎⸎⸎⸎
BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH DI TRUYỀN HỌC
Họ và tê n sinh viên : Nguyễn Thị Tường Vân
Mã sinh viên : 22010867 Tên
lớp : K16-CNSH
Khoa : Khoa CNSH, HH & KTMT Lớp tín chỉ
: Di truyền học 2-2-23(N01.TH2)
Giảng viên hướng dẫn :
Đinh Thị Ngọc Mai
Hà Nội , Tháng 4 /2024 2024 1
Họ tên sinh viên: Nguyễn Thị Tường Vân Nhóm 6
Lớp: Di truyền học-2-2-23(N01.TH2)
Ngày thực hành: 04/04/2024; 11/04/2024
Phiếu thực hành Học phần: Di truyền học
Bài thực hành số: 4 và 5
Tên bài thực hành: Tách chiết DNA từ mẫu thực hành và iện di mẫu DNA
I. Mục tiêu của bài thực hành: •
Hiểu ược nguyên lý của phương pháp tách chiết DNA từ tế bào thực vật •
Thực hành iện di mẫu DNA từ tế bào thực vật ã tách chiết ược II.
Nội dung của bài thực hành:
1. Tách DNA từ mẫu thực vật
1.1 Lý thuyết
Nguyên tắc của phương pháp dựa trên cơ sở sử dụng kết hợp cơ học là nghiền và các
hóa chất ể phá vỡ vật liệu ban ầu là màng nhân, tạo thành hỗn 5 hợp ựng trong các ống
eppendorf. Đồng thời kết hợp ly tâm ể tách, các hóa chất và loại bỏ những thành phần
không mong muốn, từ ó thu nhận DNA.
1.2. Tiến hành
1.2.1. Chuẩn bị dụng cụ hóa chất • Dụng cụ: 2 - Chày, cối sứ - Dao lam - Ống eppendorf - Pipet tự ộng • Thiết bị: - Máy ly tâm - Tủ lạnh - Máy vortex • Hóa chất: - Mẫu lá - Dịch tách NTE 1X - Dung dịch SDS 20%
- Dung dịch KOAc (Potasium acetate) 5M - Dung dịch isopropanol - Dung dịch EtOH 70%
1.2.2. Tiến hành thí nghiệm
1.2.2.1.Chuẩn bị mẫu -
Lấy úng mẫu, tốt nhất là các mô non,
không bẩn hay bị nhiễm bệnh. Không nên lấy
mẫu là các cơ quan dự trữ nhiều protein,
gluxit hoặc lipid vì khi chiết xuất phải tốn
công loại bỏ các tạp chất này. -
Thu mẫu lá bìm bịp (khoảng 1-2cm), lấy
khoảng 100mg, cắt nhỏ rồi tiến hành nghiền mẫu trong cối sứ
Hình 1: Tiến hành nghiền mẫu lá bìm bịp 3
1.2.2.2.Các bước tiến hành
Bước 1: Nghiền mẫu. Thu sinh khối của lá ã nghiền vào 2 ống eppendorf. Đánh dấu thứ tự là 6.1 và 6.2
Bước 2: Hút 700μl dịch tách NTE 1X cho vào mỗi ống. Đem 2 ống i vortex 10 phút
Bước 3: Hút 35μl SDS 20% vào mỗi ống. Đem 2 ống i vortex 10 phút
Bước 4: Cho 2 ống mẫu vào tủ ấm với nhiệt ộ 65o trong 30 phút
Bước 5: Hút 175μl 5M KOAc (Potasium acetate) vào ống, trộn ều bằng dốc ngược
ống vài lần. Sau ó ể lạnh trong 5 phút ở ngăn á tủ lạnh Bước 6: Tiến hành ly tâm
10.000 rpm 10 phút nhiệt ộ phòng
Bước 7: Hút lấy 400μl dịch trong ống mẫu ã ly tâm + thêm 280μl isopropanol (0.7 thể
tích dịch) ể lạnh -20C từ trước. Sau ó lắc nhẹ
Bước 8: Ly tâm 12.000 rpm 15 phút. Đổ bỏ dịch toàn bộ hết dịch, thu tủa
Bước 9: Rửa tủa bằng cách ngâm 500ul EtOH 70% trong 2-5 phút
Bước 10: Hong khô mẫu khoảng 15 phút
Bước 11: Cho 100μl nước vào mỗi ống, vortex ể hòa tan tủa DNA
Bước 12: Bảo quản 2 ống chứa DNA ã tách chiết trong tủ lạnh ở nhiệt ộ -20oC
1.3. Kết quả
Kết quả tách chiết DNA từ tế bào thực vật có thành công hay không sẽ ược kiểm tra
khi tiến hành iện di DNA ngày 11/04/2024
2. Điện di DNA
2.1. Lý thuyết
Điện di DNA trong gel agarose là kỹ thuật dùng ể kiểm tra chất lượng và hàm lượng DNA.
Kỹ thuật dựa trên nguyên tắc: dựa vào ặc tính cấu trúc của axít nucleic là ại phân tử tích iện
âm ồng ều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác ộng của một iện trường chúng sẽ di chuyển về
cực dương của iện trường 4
2.2. Tiến hành
2.2.1. Chuẩn bị dụng cụ, thiết bị • Thiết bị:
- Bộ iện di DNA: Nguồn iện di (80 -120V), giá và bể iện di, lược tạo
giếng iện di, khay thăng bằng nhờ giọt nước ổ bản gel. - Lò vi sóng - Máy lắc - Máy soi gen - Máy chụp ảnh • Dụng cụ - Cân iện tử - Cốc ong, ống ong - Pipet tự ộng
- Bình chịu nhiệt ể un agarose - Ống eppendorp
2.2.2. Chuẩn bị hóa chất và cách pha hóa chất
• TAE 1X (200ml): TAE 1X ược pha từ TAE 50X stock bao gồm:
+ Hút 4ml TAE 50X + 196ml nước cất
+ Lắc nhẹ hỗn hợp. Ta thu ược 200ml TAE 1X, cho vào bình trung tính, ậy nắp và dán nhãn 5
• Gel Agarose 1% (25ml)
+ Cân 0,4g bột Agarose + 25ml TAE 1X
+ Hòa tan hỗn hợp. Ta thu ược 25ml gel agarose 1%, cho vào bình chịu nhiệt, ậy nắp và dán nhãn
2.2.3. Các bước tiến hành Đổ gel
- Chuẩn bị gel agarose 1%: Pha 25 mL gel agrose 1% bằng ệm TAE 1X. Đun nóng bằng lo
vi sóng cho agarose tan hoàn toàn
- Lưu ý khi un bằng bình chịu nhiệt có nắp không ược ậy nắp kín, hoặc un bằng cốc thủy
tinh chỉ nên ổ khoảng 2 phần 3 thể tích cốc nhằm tránh tràn khi sôi.
- Sau ó ể nguội ến 40-45℃ (khi có thể dùng tay cầm ược bình ựng agarose là ược) mới tiến hành ổ bản gel.
- Trước khi ổ bản gel cần lau sạch giá ổ bằng giấy thấm mềm dễ hút nước sau ó mới cài
lược. Lược tạo giếng ược ặt ở phía cực âm của bể iện di. Tiến hành cân bằng mặt phẳng
của giá bể bằng giọt nước trên giá
- Đặt khay ổ gel trên bề mặt phẳng, ặt lược vào khay ổ gel.
- Trộn Red safe vào gel (5 µl/100 mL gel).
- Đổ từ từ gel vào khay, tránh tạo bọt và ể yên cho gel ông lại.
- Nhấc lược ra khỏi bản gel. Chạy gel
- Gắn bể iện di với bộ nguồn.
- Đặt bản gel agarose vào trong máy theo úng chiều âm (-) ến dương (+), ổ dung dịch ệm
TAE 1X ngập bản gel.
- Trộn mẫu với loading dye, vẩy nhe ống ể mẫu DNA ược trộn ều và nhỏ vào các giếng. Cần
lưu ý thao tác này nếu không cẩn thận sẽ làm tràn ra ngoài giếng hoặc vỡ miệng giếng
- Đậy nắp máy iện di, cắm iện. Bật công tắc máy iện di 6
- Cài ặt thông số iện di: Thời gian chạy 20 phút, iện thế 90V, 100 mA.
- Nhấn phím Run ể bắt ầu chạy iện di. Kết thúc quá trình iện di
- Khi máy ã chạy hết thời gian cài ặt hoặc quan sát ộ di chuyển của thuốc nhuộm trên gel ể
dừng quá trình iện di.
- Tắt công tắc nguồn.
- Mở nắp buồng iện di, lấy bản gel ra và tiến hành soi Tiến hành soi gel
- Lấy bản gel từ bể iện di ra ưa vào máy tia tử ngoại ể tiến hành soi gel
- Soi bản gel trên máy tia tử ngoại, khi ó các axít nucleic trong gel agarose sẽ hiện hình
dưới tia tử ngoại (UV) có bước sóng λ ≈ 300 nm - Chụp ảnh
2.3. Kết quả Nhận xét:
- Giếng số 1,2,3,13 là có chứa mẫu DNA của nhóm 6 em i iện di
- Giếng số 1,3,13: DNA không hiện có thể do
trong quá trình thao tác làm mất DNA hoặc thao
tác tra mẫu iện di bị sai, chưa úng kĩ thuật
- Giếng số 2: Tách chiết DNA chấp nhận ược ,
tuy nhiên lượng DNA thu ược ít nên vạch không
sáng rõ, còn mờ, ngoài ra vẫn còn tạp chất như
protein, bị lẫn RNA nhiều. Hình 2:
Kết quả iện di mẫu DNA từ tế bào thực vật
2.4. Giải thích kết quả: 7
- Điện di xác ịnh ộ tinh sạch, nguyên vẹn của DNA: Kiểm tra ược mẫu DNA có bị
lẫn tạp protein, RNA, protein iện tích không rõ ràng hay không
- Độ nguyên vẹn hoàn toàn không có nghĩa là toàn bộ oạn DNA mà là các dải ứt
gãy lớn ảm bảo nguyên vẹn ( băng sáng). 8