Bài báo cáo Nghiên cứu về gen nosZ của Pseudomonas | Tin sinh học | Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

I. MỞ ĐẦU
Chu trình chuyển hóa nitơ trong tự nhiên đóng vai trò thiết yếu trong hệ sinh thái
đất và nước. Trong đó, vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas được biết đến với khả
năng khử nitrat và khử oxit nitơ, góp phần giảm phát thải khí nhà kính N O. ₂ Một
trong những gen chủ chốt liên quan đến quá trình này là nosZ, mã hóa enzyme
nitrous oxide reductase, xúc tác giai đoạn cuối cùng của phản ứng khử N O ₂ thành N₂.
Việc định danh chính xác vi khuẩn Pseudomonas từ môi trường, kết hợp với phát
hiện sự hiện diện của gen nosZ, mang ý nghĩa sinh thái và ứng dụng lớn, đặc biệt
trong nghiên cứu xử lý nước thải, đất nông nghiệp, và kiểm soát phát thải N₂O.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành phân lập và định danh vi khuẩn
Pseudomonas dựa trên trình tự gen 16S rRNA, đồng thời thiết kế cặp mồi PCR đặc
hiệu cho gen nosZ nhằm phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo về chức năng và
biểu hiện của gen này trong môi trường. II. TỔNG QUAN
Chi Pseudomonas bao gồm nhiều loài vi khuẩn Gram âm, hiếu khí, sống phổ biến
trong đất, nước và môi trường thực vật. Chúng có khả năng thực hiện quá trình khử nitrat đến N , trong
₂ đó nosZ là gen đóng vai trò trung tâm trong việc loại bỏ
N O –₂ một loại khí nhà kính mạnh hơn CO ₂và CH₄ .
Việc định danh Pseudomonas bằng phương pháp sinh học phân tử, đặc biệt là giải
trình tự gen 16S rRNA, cho phép xác định chính xác loài với độ tin cậy cao. Gen
nosZ đã được phân lập và mô tả ở nhiều loài vi khuẩn khử nitrat, tuy nhiên trình tự
có thể biến động giữa các chi khác nhau. Do đó, việc thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho
nosZ của Pseudomonas là cần thiết để phục vụ phát hiện nhanh qua PCR.
Các công cụ tin học như Primer-BLAST hỗ trợ lựa chọn mồi dựa trên các tiêu chí
như nhiệt độ nóng chảy, độ đặc hiệu và tránh hình thành cấu trúc thứ cấp. III.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
1. Mẫu và phân lập vi khuẩn
Nguồn mẫu: Mẫu đất nông nghiệp được thu thập từ [vị trí cụ thể].
Phân lập: Mẫu được pha loãng tuần tự và cấy trên môi trường King's B agar
chọn lọc Pseudomonas. Sau khi ủ ở 30°C trong 48 giờ, các khuẩn lạc phát
huỳnh quang được chọn để tinh sạch. 2. Tách chiết DNA
DNA được tách từ sinh khối vi khuẩn bằng bộ kit [tên kit, ví dụ: DNeasy
Blood & Tissue Kit – Qiagen], theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Nồng độ và độ tinh sạch DNA được đánh giá bằng máy NanoDrop và kiểm
tra bằng điện di trên gel agarose 1%.
3. Khuếch đại gen 16S rRNA và định danh
Cặp mồi sử dụng:
27F: 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’
1492R: 5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’
Thành phần phản ứng PCR (25 µL tổng thể tích): 12.5 µL Master Mix 2X 1 µL primer xuôi (10 µM) 1 µL primer ngược (10 µM) 1 µL DNA khuôn (~50 ng)
9.5 µL nước không có nuclease Chu trình PCR: 95°C 5 phút
30 chu kỳ: 95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 1.5 phút 72°C 10 phút kết thúc
Xử lý và phân tích: Sản phẩm PCR được điện di, tinh sạch và gửi giải
trình tự tại [tên đơn vị]. 4. Phân tích trình tự
Trình tự được xử lý bằng BioEdit và so sánh với cơ sở dữ liệu GenBank
thông qua công cụ BLAST (NCBI).
Vi khuẩn được định danh ở mức loài nếu độ tương đồng ≥99%.
5. Thiết kế mồi cho gen nosZ
Trình tự gen nosZ của Pseudomonas stutzeri và các loài liên quan được thu thập từ NCBI GenBank.
Mồi được thiết kế bằng phần mềm Primer3 và kiểm tra đặc hiệu với Primer-BLAST.
Tiêu chí chọn mồi: Độ dài mồi: 18–22 bp Tm: 58–62°C GC content: 40–60%
Tránh tự bổ sung hoặc dimer hóa
Các cặp mồi được kiểm tra in silico với bộ trình tự Pseudomonas khác nhau
để đảm bảo tính đặc hiệu. IV. KẾT QUẢ V. THẢO LUẬN VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO