Bài thực hành 3: Phân tích vi sinh vật trong thực phẩm | Môn: Công nghệ lạnh đông thực phẩm | Trường: Học viện nông nghiệp Việt Nam

Bài thực hành 3: Xác định chỉ tiêu vi sinh vật trên một số loại thực phẩm I.Khái quát chung 1. Định nghĩa Coliform
- Coliforms là nhóm trực khuẩn Gram(-) không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kɣ khí
tùy tiện, có khả năng lên men lactose sinh axit (sinh hơi) ở 37oC trong 24- 48h.
Trong thực tế phân tích, coliforms được định nghĩa là các vi khuẩn có khả năng lên
men sinh hơi trong khoảng 48h khi được ủ ở 37C trong môi trường canh Lauryl
Sulphat và canh Brilliant Green Lactose Bile Salt. Nhóm coliforms hiện diện rộng
rãi trong tự nhiên, trong ruột người, động vật. Coliforms được xem là nhóm vi sinh
vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước hay các mẫu môi
trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác.
Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng khi số coliforms của thực phẩm cao thì khả năng
hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác cũng cao.
- Nhóm coliforms gồm 4 giống là: Escherichia, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter.
2. Định nghĩa nấm men, nấm mốc
- Nấm men: Vi sinh vật hiếu khí ưa ẩm, ở nhiệt độ 25°C dưới các điều kiện thích
hợp phát triển thành các khuẩn lạc tròn, bóng hoặc mờ trên bề mặt môi trường
thạch nấm, thường có mép viền đều và bề mặt lồi ít hoặc lồi nhiều.
- Nấm mốc: Vi sinh vật dạng sợi nhỏ hiếu khí ưa ấm, ở nhiệt độ 25°C dưới các điều
kiện quy định trong tiêu chuẩn này, phát triển thành các mầm/chồi mọc lan như
lông tơ hoặc dẹt hoặc thành các khuẩn lạc trên bề mặt môi trường thạch nấm,
thường có màu trái cây hoặc có cấu trúc mang bào tử
3. Định nghĩa vi khuẩn hiếu khí
- Vi khuẩn hiếu khí là vi khuẩn tang trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện
có sự hiện diện của oxy phân tử
II. Định lượng Coliform, nấm men, nấm mốc và vi khuẩn hiếu khí bằng phương
pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc VRBL, YGC, PCA 1. Nguyên tắc * Coliform
- Mẫu được đồng nhất được cấy một lượng thích hợp trên môi trường thạch chọn lọc chứa lactose.
- Đếm số khuẩn lạc lên men và sinh axit sau khi nuôi ở 37°C trong 48h. Ngoài
lactose, môi trường chọn lọc cho coliforms có chứa muối mật ức chế vi
khuẩn(G+)và chất chỉ thị PH như neutral red, crystal violet. Trên môi trường này,
khuẩn lạc coliforms có màu đỏ đến màu đỏ đậm, đường kính >0.5mm, xung quanh
khuẩn lạc có vùng tủa của muối mật. * Nấm men, nấm mốc
- Chiết xuất nấm men cung cấp những chất dinh dưỡng cơ bản cần thiết cho sự sinh
trưởng. Glucose là nguồn cung cấp nguyên tố các-bon cho sinh vật phát triển.
Chloramphenicol ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn. Sau khi ủ ở 25°C, khuẩn lạc
được đếm là khuẩn lạc của nấm men được phân biệt với nấm mốc bởi hình thái của
chúng. Nấm men, nấm mốc trong môi trường, nhất là trên bề mặt môi trường phát
triển thành các khuẩn lạc tròn, hình hạt đậu. * Vi khuẩn hiếu khí
- Mẫu được đồng nhất được cấy một lượng thích hợp trên môi trường thạch (dạng
môi trường không chọn lọc)
- Đếm số khuẩn lạc sau khi đĩa được ủ ở 20℃ trong 2 ngày 2. Cách tiến hành
- B1: Pha môi trường VRBL, PCA, YGC
Cân chính xác các thành phần môi trường bao gồm Môi trường VRBL: Thành phần G/L Pepton 7 Yeast Extract (Cao nấm men) 3 Lactose 10 Đỏ trung tính 0,03 Tím tinh thể 0,002 Muối mật bò 1,5 Nacl 5 Agar 20 Môi trường PCA: Thành phần G/L Peptone 5 Yeast Extract (Cao nấm men) 2 Glucose 1 Agar 20 Môi trường YGC: Thành phần G/L Glucose 20 Yeast Extract (Cao nấm men) 5 Chloramphenicol 0,1 Agar 20
Hòa tan các thành phần trên trong nước, để yên vài phút, đặt lên bếp đun sôi và
khuấy đều, để sôi 2- 5 phút. Làm nguội đến 45°C để sử dụng.
- B2: Chuẩn bị mẫu trước khi phân tích.
Tiến hành trên 1 mẫu cà phê hòa tan
Chuẩn bị một số ống nghiệm có chứa 9 ml nước cất vô trùng, một số ống hút 1 ml
vô trùng. Hút 1ml dung dịch mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng,
sau đó lắc đều. Sau khi được làm đồng nhất như trên, dung dịch mẫu thu được có
nồng độ là 10-1M. Dung dịch mẫu đồng nhất tiếp tuc pha loãng theo dãy thập phân
bằng cách dùng pipetman với đầu típ vô trùng, chuyển 1 ml dịch mẫu vào ống
nghiệm chứa 9 ml nước cất, lắc đều. Dung dịch mẫu này có nồng độ pha loãng là
10-2M. Sau đó thao tác tương tự để có dịch mẫu với độ pha loãng 10-3M, 10-4M. - B3: Cấy mẫu.
Dùng pipetman với đầu típ vô trùng chuyển 1 ml dịch mẫu pha loãng đã chọn vào
giữa đĩa petri vô trùng. Tương ứng với mỗi độ pha loãng cấy 3 đĩa (tức là thực hiện
3 lần lặp lại). Sau khi cấy đổ vào mỗi đĩa 20 ml môi trường VRBL đã được đun và
ổn định ở 45°C. Trộn đều dịch mẫu với môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petri
xuôi và ngược chiều kim đồng hồ. Đặt các đĩa trên mặt phẳng nằm ngang cho thạch
đông đặc. Lật ngược đĩa và ủ ở 37°C trong 48h. Đếm số khuẩn lạc có đặc điểm của
khuẩn lạc coliforms, nấm men, nấm mốc.
- B4: Đếm khuẩn lạc trên đĩa petri.
Đếm các khuẩn lạc trên các đĩa, kiểm tra các đĩa dưới ánh sáng dịu. Điều quan
trọng là các khuẩn lạc chính phải được đếm; tuy nhiên, điều cần thiết là phải tránh
đếm nhầm các hạt không hòa tan hoặc chất kết tủa trên đĩa với các khuẩn lạc chính.
Kiểm tra cẩn thận các khuẩn lạc nghi ngờ, sử dụng kính lúp có độ khuếch đại lớn
hơn khi cần để phân biệt các khuẩn lạc với tạp chất.
Các khuẩn lạc mọc lan được coi là các khuẩn lạc đơn lẻ. Nếu các khuẩn lạc mọc lan
ít hơn một phần tư đĩa, thì đếm các khuẩn lạc trên phần đĩa còn lại và tính số tương
ứng cho cả đĩa. Nếu khuẩn lạc mọc lan hơn một phần tư đĩa thì không đếm đĩa đó. III, Kết luận
Trên đĩa petri môi trường VRBL, 6 đĩa đều không có khuẩn lạc coliform
Trên đĩa petri môi trường YGC, nồng độ 10-4M có khuẩn lạc nấm men số lượng
trên 250, các đĩa petri nồng độ còn lại không có nấm men
Trên đĩa petri môi trường PCA, không có khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí *Tính kết quả: A ¿ Trong đó:
N: Tổng số khuẩn lạc đếm được
ni: số đĩa có khuẩn lạc được chọn tại mỗi độ pha loãng
v: dung tích mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩa
fi: độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm
R: tỷ lệ khẳng định (R=0.9 đ/v VRBL; R=1 đ/v PCA và YGC) Mật độ của coliforms: A= 0 0,9=0
2 . 20 .10−2+ 2.20. 10−3+2.20 . 10−4
Mật độ của nấm men, nấm mốc: A= 0 1=0
2.20 . 10−2+2.20 . 10−3+2.20 .10−4
Mật độ của vi khuẩn hiếu khí: A= 0 1=0
2.20 . 10−2+2.20 . 10−3+2.20 .10−4