Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng kháng viêm In Vitro của lá khế | Đại học Thái Nguyên

lOMoAR cPSD| 46560390
Tạp ch Khoa học Trường Đại học Cần Thơ
Tập 54, Số 7A (2018): 72-76
DOI:10.22144/ctu.jvn.2018.125
BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ
TÁC DỤNG KHÁNG VIÊM In vitro CỦA LÁ KHẾ (Averrhoa carambola L.)
Huỳnh Anh Duy1* và Nguyễn Thị Tuyết Nhi2
1Khoa Khoa học Tự nhiŒn, Trường Đại học Cần Thơ
2Sinh viŒn ng nh HoÆ dược, kh a 40, Trường Đại học Cần Thơ
*Người chịu trÆch nhiệm về b i viết: Huỳnh Anh Duy (email: haduy@ctu.edu.vn)
Th ng tin chung:
sugar, saponin, and tannin. Essential oil of the starfruit leaves was
Ng y nhận b i: 06/03/2018
extracted by steam distillation method. After that, it was analyzed by GC-
Ng y nhận b i sửa: 23/05/2018
MS for the presence of seven components, in which the most abundant
Ng y duyệt ăng: 29/10/2018
components were 9-eicosyne (9.62%) and butylated hydroxytoluene
(3.02%). In addition, the study also investigated the in vitro anti- Title:
inflammatory activity of the various extracts by albumin denaturation
Primary study on chemical
inhibitory assay. Results showed that ethyl acetate fraction had the
components and in vitro
strongest anti-inflammatory activity, followed by dichloromethane
antiinflammatory activity of
fraction, ethanolic extract, and water fraction with IC50 values of 79.89
the leaves of starfruit
μg/mL, 278 μg/mL, 414,64 μg/mL, 695,91 μg/mL, respectively, compared
(Averrhoa carambola L.)
to prednisolone (IC50 = 12.88 μg/mL) and diclofenac (IC50 = 36.88
μg/mL). But n-hexane fraction showed that antiinflammatory effect was
Từ kh a: Averrhoa
weak. The results from this study were first reported from the leaves of
carambola, khÆng viŒm, Averrhoa carambola L.
tinh dầu, 9-eicosyne TÓM TẮT
Keywords: Anti-inflammatory,
Cao ethanol của lÆ khế c chứa alkaloid, flavonoid, triterpene, steroid, Averrhoa carambola L.,
ường khử, saponin v tannin. Tinh dầu lÆ khế sau khi chiết xuất bằng
essential oil, 9eicosyne
phương phÆp cất l i cuốn hơi nước, ược ph n t ch bằng GC-MS cho thấy
hiện diện của 7 cấu tử, trong , cÆc th nh phần chiếm h m lượng lớn gồm ABSTRACT
9-eicosyne (9,62%) v butylated hydroxytoluene (3,02%). BŒn cạnh ,
nghiŒn cứu cũng khảo sÆt tÆc dụng khÆng viŒm in vitro của cÆc cao
Ethanolic extract from the
chiết lÆ khế bằng thử nghiệm ức chế biến t nh albumin bởi nhiệt. Kết quả
leaves of starfruit (Averrhoa
cho thấy cao ph n oạn ethyl acetate c tÆc dụng khÆng viŒm mạnh nhất,
carambola L.) contains the
tiếp theo l cao ph n oạn dichloromethane; cao ethanol tổng v cao ph n oạn phytochemical components
nước với cÆc giÆ trị IC50 lần lượt l 79,89 μg/mL, 278 μg/mL, 414,64
Trích dẫn: Huỳnh Anh Duy và Nguyễn Thị Tuyết Nhi, 2018. Bước ầu nghiên cứu thành phần hóa học và tác
dụng kháng viêm in vitro của lá khế (Averrhoa carambola L.). Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. 54(7A): 72-76. 1 ĐẶT VẤN ĐỀ
phức hợp giữa iều hòa và phản ứng. Quá trình này
Viêm là kết quả có tính quy luật của các tác dẫn ến các hiện tượng thoát huyết tương, xuyên nhân gây viêm
xuất hiện trong cơ thể, là quá trình bạch cầu, tăng sinh tế bào tại ổ viêm và hiện tượng
such as alkaloid, flavonoid,
μg/mL, 695,91 μg/mL khi so sÆnh với 2 chất ối chiếu l prednisolone (IC50
triterpene, steroid, reducing
= 12,88 μg/mL) v diclofenac (IC50 = 36,88 μg/mL). Cao ph n oạn n-hexane 72 lOMoAR cPSD| 46560390
Tạp ch Khoa học Trường Đại học Cần Thơ
Tập 54, Số 7A (2018): 72-76
cho tÆc dụng khÆng viŒm
Ngọc Giàu, Bộ môn Dược liệu, Trường Cao ẳng Y tế Bạc Liêu, có kiểm
yếu nhất. Những kết quả n y
chứng lại bằng tài liệu tham khảo (Đỗ Tất Lợi, 2004).
lần ầu ược bÆo cÆo từ lÆ khế
Hóa chất: Huyết thanh bò (BSA, Himedia - Ấn Độ), chất chuẩn tại Việt Nam.
prednisolone, diclofenac ( ộ tinh khiết 99,8%) ược cung cấp bởi Viện Kiểm
thực bào, gây ra bốn triệu
nghiệm thành phố Hồ Chí Minh và các hóa chất thông dụng khác.
chứng iển hình là sưng, nóng,
ỏ và au. Trong nhiều nghiên
Thiết bị: Bộ chưng cất tinh dầu Clevenger, máy GC-MS Agilent, máy
cứu, phương pháp xác ịnh khả
quang phổ UV-Vis và các dụng cụ hỗ trợ khác.
năng kháng viêm bằng thử
2.2 Phương pháp nghiên cứu
nghiệm khả năng ức chế biến
2.2.1 Điều chế cao ethanol tổng, cÆc cao ph n oạn từ lÆ khế
tính albumin do nhiệt của các
hợp chất từ thiên nhiên ược coi
Bột lá khế khô (5 kg) ược ngâm chiết với ethanol 96% ở nhiệt ộ phòng.
là phương pháp nhanh chóng,
Cô loại dung môi dưới áp suất kém thu ược cao ethanol tổng (46,8 g). Cao
ơn giản và chính xác cao
tổng này ược phân tán trong nước cất và chiết phân bố lỏng-lỏng lần lượt
(Dhingra et al., 2015).
với các dung môi n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate thu ược phân
oạn dịch chiết tương ứng. Loại dung môi thu ược các cao phân oạn tương Cây khế (Averrhoa
ứng n-hexane (14,4 g), dichloromethane (0,48 g), ethyl acetate (5,24 g) và
carambola L.) thuộc họ
phần còn lại là cao nước (11,4 g).
Oxalidaceae, là loại cây a
niên, phân bố ở mọi vùng miền
2.2.2 Định t nh sơ bộ th nh phần h a học của cao ethanol tổng của Việt Nam (Cao Quốc
Tiến hành theo tài liệu hướng dẫn ịnh tính của Nguyễn Kim Phi Phụng
Chánh và Nguyễn Văn Hoan,
(2007), bao gồm ịnh tính các thành phần: alkaloid, flavonoid, tannin,
2006). Lá của loại cây này
triterpene, steroid, ường khử, saponin.
thường ược sử dụng trong các
2.2.3 Khảo sÆt th nh phần h a học của tinh dầu lÆ khế
bài thuốc dân gian chữa nhiều
bệnh như: mề ay, mẩn ngứa,
Mẫu lá khế tươi, rửa sạch, ã loại bỏ lá hỏng (200 g) ược cắt nhỏ cho và
mụn nhọt (Đỗ Tất Lợi, 2004).
bình cầu tiến hành chưng cất lôi cuốn hơi nước (ở 100oC trong 90 phút),
Báo cáo này tập trung nghiên
thu ược hỗn hợp tinh dầu và nước. Đem chiết lỏng-lỏng với diethyl ether,
cứu về thành phần hóa học của
làm khan bằng Na2SO4, cô quay loại diethyl ether thu ược tinh dầu.
tinh dầu lá khế, khảo sát và
Tinh dầu lá khế ược phân tích tại Trung tâm Phân tích Cần Thơ với hệ
sàng lọc hoạt tính kháng viêm
thống sắc ký như sau: Máy GC-MS Agilent. Cột phân tích có ký hiệu DB-
in vitro của cao chiết khác
5 MS (60 m, 250 μm, 0,25 μm), khí mang là khí heli, áp suất 19,121 psi.
nhau từ lá khế với mục ích bổ
Chương trình nhiệt ộ: nhiệt ộ ban ầu là 80oC giữ 2 phút, tăng lên 240oC,
sung nguồn dữ liệu nghiên cứu
4oC/phút, giữ 4 phút. Nguồn ion hóa EI: nhiệt ộ bắn phá ion 230oC, nhiệt
về tác dụng của loài này trong
ộ tứ cực 50oC, chế ộ quét: Fullscan. Tiêm mẫu: chế ộ tiêm mẫu chia dòng,
việc hỗ trợ iều trị bệnh.
tốc ộ dòng: 0,8 mL/phút. 2 NGUYÊN LIỆU VÀ
2.3 Khảo sát tác dụng kháng viêm in vitro bằng thử nghiệm ức PHƯƠNG
chế biến tính albumin do nhiệt PHÁPNGHIÊN CỨU NguyŒn tắc 2.1 Nguyên
Albumin là protein chiếm tỷ lệ rất lớn trong huyết thanh, có khả năng liệu nghiên
liên kết tốt với NSAIDs (non-steroid anti-inflammatory drugs: kháng viêm
cứu Vật liệu
không steroid) và kém bền với nhiệt ộ. Ở nhiệt ộ trên 50oC, albumin bắt
ầu biến tính. Nhưng khi có sự hiện diện của NSAIDs, diễn tiến của quá nghiŒn
trình biến tính này thay ổi do NSAIDs có khả năng ức chế biến tính cứu:
albumin ở nồng ộ thấp. Thuốc kháng viêm corticoid cũng ược ánh giá có
Mẫu lá khế (Averrhoa
khả năng kháng viêm tốt nhưng chưa ược sử dụng trong các thí nghiệm ức
carambola L.) ược thu hái tại
chế biến tính albumin do nhiệt. Do ó, nghiên cứu mở rộng khảo sát khả
huyện Tam Bình, tỉnh Vĩnh
năng kháng viêm của nhóm thuốc này ể so sánh với các NSAIDs về khả
Long vào tháng 06/2017, ược
năng ức chế biến tính albumin do nhiệt. Bên cạnh ó, những hợp chất hay
ịnh danh bởi ThS.DS. Lâm Thị 73 lOMoAR cPSD| 46560390
Tạp ch Khoa học Trường Đại học Cần Thơ
Tập 54, Số 7A (2018): 72-76
dịch chiết từ cây thuốc có khả
methanol thành các dung dịch có nồng ộ giảm dần (800 - 12,5 μg/mL).
năng kháng viêm cũng có hoạt
Tiến h nh th nghiệm
tính này (Grant et al., 1970).
Các mẫu ược pha theo tỷ lệ như sau:
Thử nghiệm ược tiến hành
Mẫu thử (test solution) (0,5 mL): 0,45 mL BSA0,5% + 0,05 mL cao theo phương pháp của
chiết ở các nồng ộ giảm dần (800, 400,... 12,5 μg/mL). Mẫu ối chứng (test
Habibur et al. (2015) có hiệu
control solution) (0,5 mL): 0,45 mL BSA 0,5% + 0,05 mL nước cất. Mẫu
chỉnh cho phù hợp với iều kiện
ối chứng chiết xuất (product control solution) (0,5 mL): 0,45 mL nước cất phòng thí nghiệm.
+ 0,05 mL cao chiết/ chất chuẩn ở các nồng ộ giảm dần (800, 400,… 12,5
Chuẩn bị cÆc dung dịch
μg/mL). Mẫu ối chiếu (standard solution) (0,5 mL): 0,45 mL BSA 0,5% + Huyết thanh bò (Albumin
0,05 mL chất chuẩn ở các nồng ộ giảm dần (800, 400,… 12,5 μg/mL). Các Serum Bovine) (ký hiệu là
mẫu ược ưa về pH 6,3 (bằng dung dịch HCl 1N) rồi ủ ở 37oC trong 20 BSA) 0,5%: Hòa tan 500 mg
phút, sau ó tăng nhiệt ộ lên 57oC giữ trong 3 phút. Sau ó làm lạnh, thêm
BSA với nước cất trong bình
vào 2,5 mL dung dịch ệm phosphate (pH 6,3). Tiến hành o mật ộ ịnh mức 100 mL.
quang (OD) các mẫu ở bước sóng 225 nm. Dung dịch ệm phosphate
Phần trăm ức chế biến tính BSA ược tính theo công thức sau:
pH 6,3: Hòa tan 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4 trong 800 mL nước Trong ó,
cất. Điều chỉnh pH ến 6,3 bằng
HCl 1N. Thêm nước cất ến
ODt: mật ộ quang o ược của mẫu thử; 1000 mL. ODc: mật ộ quang o ược của mẫu
Cao ethanol tổngvà các cao chứng;
phân oạn của lá khế: Pha trong
ODcs: mật ộ quang o ược của mẫu chứng chiết xuất.
methanol thành các dung dịch
3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Bảng 1: Kết quả ịnh tính các nhóm hợp chất trong cao tổng ethanol
Nhóm hợp chất Tên thuốc thử Hiện tượng Kết luận Wagner Mayer + Alkaloid Kết tủa nâu en
Kết tủa trắng, dung dịch vàng nhạt +
Bột magie+HCl ậm ặc Dung dịch màu ỏ + + Flavonoid FeCl3 5% Dung dịch màu xanh en H2SO4 ậm ặc Dung dịch màu ỏ cam + Stiasny Không hiện tượng Kết - Tannin Gelatin mặn tủa bông trắng + Triterpene và Liebermann-Burchard
Tạo vòng màu ỏ chuyển sang xanh en Dung + + Steroid Salkowski dịch màu xanh en Đường khử Fehling Kết tủa màu ỏ gạch + Saponin Tạo bọt với nước
Cột bọt bền trong 15 phút +
có nồng ộ giảm dần từ 800 -
3.1 Kết quả ịnh tính thành phần hóa học cao ethanol tổng 12,5 μg/mL.
Kết quả ịnh tính sơ bộ thành phần hóa học cho thấy trong cao ethanol
Chất ối chiếu (diclofenac
tổng lá khế có sự hiện diện của các nhóm hợp chất: alkaloid, flavonoid, và prednisolone): pha với
tannin, triterpene, steroid, ường khử, saponin (Bảng 1).
3.2 Kết quả khảo sát thành phần hóa học của
Sắc ký ồ GC-MS (Hình 1) cho thấy có sự xuất
tinh dầu lá khế bằng phương pháp GC-MS
hiện của 7 cấu tử, trong ó cấu tử có thời gian lưu là
22,005 phút là peak chính và ược xác ịnh là
Kết quả tóm tắt những thành phần hóa học chính
9eicosyne (9,62%). Chất này cũng ã ược phát hiện
trong tinh dầu lá khế ược trình bày trong Bảng 2.
từ cao chiết methanol của loài Cassia auriculata, có 74 lOMoAR cPSD| 46560390
Tạp ch Khoa học Trường Đại học Cần Thơ
Tập 54, Số 7A (2018): 72-76
thời gian lưu là 24,650 phút chiếm 1,74% bằng
hydroxytoluene (3,02%) có thời gian lưu là 25,039
phương pháp GC-MS (Senthilrani and Renuka Devi,
phút, chất này ược ánh giá có khả năng chống oxy
2014). Ngoài ra, còn thấy sự xuất hiện của butylated
hóa rất tốt (Krasowska et al., 2001).
Bảng 2: Thành phần hóa học chính trong tinh dầu lá khế STT
Thời gian lưu (phút) Thành phần hóa học chính Phần trăm (%) 1
22,005 9-Eicosyne 9,62 2 22,755 Linoleoyl chloride 0,94 3
23,638 trans-2-(2-propynyloxy)-cyclohexanol 0,85 4
25,039 Butylated hydroxytoluene 3,02 5 27,95 β-Ionone 0,15 6
32 ,489 Palmitic acid meth y l este r 0 ,82 7
47 ,781 Dodec y l cis -9, 10-epox y octadecanoate 0, 75
Hình 1: Sắc ký ồ GC-MS của tinh dầu lá khế
3.3 Kết quả khảo sát tác dụng kháng viêm in
93,5%. Cũng ở nồng ộ trên, hai dạng cao chiết lá khế
vitro của cao chiết lá khế bằng thử nghiệm ức chế
cho thấy phần trăm ức chế khá cao là phân oạn cao
biến tính albumin do nhiệt
ethyl acetate (89,2%) và cao dichloromethane
Phân tích kết quả thu ược trong dãy nồng ộ khảo
(75,8%), các phân oạn còn lại thể hiện phần trăm ức
sát cho thấy, prednisolone (thuốc kháng viêm
chế biến tính albumin theo thứ tự là cao ethanol tổng
corticoid) và diclofenac (NSAIDs) là hai chất thể
(69,6%), cao nước (53,4%) và cao n-hexane có phần
hiện khả năng ức chế biến tính albumin cao nhất
trăm ức chế thấp nhất (33,6%).
xét ở nồng ộ 800 μg/mL tương ứng là 97,5% và 75 lOMoAR cPSD| 46560390
Tạp ch Khoa học Trường Đại học Cần Thơ
Tập 54, Số 7A (2018): 72-76
Hình 2: Phần trăm (%) ức chế biến tính albumin theo nồng ộ ( g/mL) của các cao chiết lá khế và chất ối chiếu
Dựa vào các giá trị khảo sát xác ịnh ược giá trị
chế biến tính albumin do nhiệt dựa vào giá trị IC50
IC50 ( g/mL) của cao ethanol tổng, các cao chiết
ược xếp theo thứ tự giảm dần là ethyl acetate >
phân oạn lá khế và chất ối chiếu. Kết quả ược trình
dichloromethane > cao tổng ethanol > cao nước. bày ở Bảng 4.
Kết quả trên ây cho thấy lá khế có khả năng
Bảng 4: Giá trị IC50 của cao chiết lá khế và chất
kháng viêm tốt và a phần những chất có hoạt tính ối chiếu
này tập trung ở phân oạn ethyl acetate. Điều này có
thể lý giải là do phân oạn ethyl acetate thường chứa Mẫu
nhiều những hợp chất như polyphenol, flavonoid, IC50 (μg/mL)
saponin... Các hợp chất này ều ược chứng minh là Cao ethanol tổng 413,64
có khả năng kháng viêm tốt (RiceEvans et al., 1996). Cao n-hexane -
Điều này cho cho thấy kết quả của nghiên cứu cũng Cao dichloromethane 278,00
phù hợp với các nghiên cứu ngoài nước về tác dụng Cao ethyl acetate 79,89
kháng viêm của cao chiết từ lá khế (Cabrini et al., Cao nước 695,91 2011). Diclofenac 36,88 Prednisolone 4 KẾT LUẬN 12,88
Khả năng ức chế biến tính albumin càng cao khi
Nghiên cứu cho thấy lá khế có chứa các hợp chất
IC50 càng thấp. Từ kết quả trên cho thấy
như: alkaloid, flavonoid, triterpene, steroid, tannin,
Prednisolone (IC50=12,88 μg/mL) có khả năng ức ường khử, saponin.
chế biến tính albumin mạnh hơn ba lần diclofenac (IC
Thành phần hóa học chính trong tinh dầu lá khế
50=36,88 μg/mL). Trong các cao chiết, cao phân
oạn ethyl acetate có khả năng ức chế biến tốt nhất so
khi phân tích bằng phương pháp GC-MS là
với các cao phân oạn còn lại với IC
9eicosyne (9,62%), butylated hydroxytoluene 50=79,89 μg/mL,
cụ thể là bằng khoảng 1/2 lần diclofenac. Trong năm
(BHT) (3,02%) và một số thành phần khác chiếm tỷ
phân oạn cao chiết từ cao ethanol tổng, phân oạn n- lệ nhỏ hơn.
hexane có hiệu quả ức chế biến tính albunmin thấp
Đã ánh giá ược tác dụng kháng viêm in vitro của
hơn 50%, do trong khoảng tuyến tính giữa nồng ộ và
các cao chiết phân oạn từ lá khế trên mô hình ức chế
phần trăm ức chế ược khảo sát phân oạn này không
biến tính albumin do nhiệt. Kết quả cho thấy, phân
thể ạt ược giá trị IC50. Các phân oạn có khả năng ức
oạn chiết ethyl acetate (IC50 = 79,89 g/ml) của lá 76 lOMoAR cPSD| 46560390
Tạp ch Khoa học Trường Đại học Cần Thơ
Tập 54, Số 7A (2018): 72-76
khế có tác dụng kháng viêm mạnh hơn so với các
phân oạn còn lại. Kết quả này ịnh hướng tốt cho việc
sử dụng dược liệu cũng như tiền ề cho việc phân lập
các hợp chất tinh khiết từ phân oạn ethyl acetate
trong việc tìm kiếm các hoạt chất, dược liệu có tính kháng viêm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Cabrini, D.A., Moresco, H.H., Imazu, P., et al.,
2011. Analysis of the Potential Topical
AntiInflammatory Activity of Averrhoa
carambola L. in mice. Evidence-Based
Complementary and Alternative Medicine. 2011: 1-7.
Dhingra, A.K., Chopra, B., Dass, R., and Kumar
Mittal, S. 2015. An update on Anti-inflammatory
Compounds: A Review. Anti-Inflammatory &
Anti-Allergy Agents in Medicinal Chemistry. 14(2): 81-97.
Grant, N.H., Alburn, H.E., and Kryzanauskas, C.,
1970. Stabilization of serum albumin by
antiinflammatory drugs. Biochemical Pharmacology. 19(3): 715-722.
Habibur, R., Chinna Eswaraiah, M., and Dutta,
A.M., 2015. In-vitro Anti-inflammatory and
Anti-arthritic Activity of Oryza sativa Var. Joha
Rice (An Aromatic Indigenous Rice of Assam).
American Eurasian Journal Agricultural
Environment Science. 15(1): 115-121.
Cao Quốc Chánh và Nguyễn Văn Hoan, 2006. Cây khế.
NXB Nông nghiệp Hà Nội, 121 trang.
Krasowska, A., Rosiak, D.A.W.I.D., Szkapiak, K.,
Oswiecimska, M., Witek, S., and Lukaszewicz,
M., 2001. The antioxidant activity of BHT and
new phenolic compounds PYA and PPA measured
by chemiluminescence. Cellular & Molecular Biology Letters. 6(1): 71-81.
Đỗ Tất Lợi, 2004. Những cây thuốc và vị thuốc Việt
Nam. NXB Y học. Hà Nội, 1300 trang.
Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007. Phương pháp cô lập
hợp chất hữu cơ. NXB Đại Học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh, 528 trang.
Rice-Evans, C.A., Miller, N.J., and Paganga, G.,
1996. Structure-antioxidant activity relationships
of flavonoids and phenolic acids. Free Radical
Biology and Medicine. 20(7): 933-956.
Senthilrani, S., Renuka Devi, P., 2014. Biological
activities and chemical composition of Cassia
auriculata. Asian Journal of Biochemistry. 9: 195-202. 77