Đề cương Phương pháp nghiên cứu cây thuốc | Đại học Dược Hà Nội

lOMoAR cPSD| 47205411 Mục lục
Câu 1: Trình bày cách thu mẫu và phương pháp hiển vi ........................................................................ 1
I. Nguyên tắc chung về thu mẫu .................................................................................................. 1
II. Hướng dẫn thu và xử lý mẫu .................................................................................................. 3
III. Phương pháp hiển vi .............................................................................................................. 4
IV. Các đặc điểm của vi phẫu cần lưu ý ...................................................................................... 5
V. Bảo quản và Lưu trữ Mẫu ....................................................................................................... 8
VI. Mô tả Đặc điểm và Giám định Loài ...................................................................................... 9
Câu 2: Trình bày phương pháp định tính, định lượng ........................................................................... 10
I. Tổng quan về các phương pháp định tính và định lượng trong nghiên cứu cây thuốc .... 11
II. Phương pháp nghiên cứu hiển vi (Có ở trên r) ................................................................... 12
III. Phương pháp sắc ký ............................................................................................................. 12
IV. Định tính, định lượng theo nhóm hợp chất ........................................................................ 15
Câu 3: Trình bày cách chiết xuất và phân lập ....................................................................................... 22
I. Đại cương về Chiết xuất và Phân lập .................................................................................... 22
II. Các Phương pháp Chiết xuất ................................................................................................ 22
III. Các Phương pháp Phân lập và Tinh chế ............................................................................ 25
Câu 4: Trình bày cách đánh giá các tác dụng dược lý .......................................................................... 27
1. Vai trò và mục tiêu của đánh giá tác dụng dược lý trong nghiên cứu cây thuốc .............. 27
2. Các loại thử nghiệm sinh học (Biological Assays) ................................................................ 28
3. Nguyên tắc đánh giá tác dụng sinh học của cây thuốc ........................................................ 30
4. Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu .................................................................... 32
5. Nghiên cứu độc tính (Toxicity Studies) ................................................................................. 32
Câu 1: Trình bày cách thu mẫu và phương pháp hiển vi
Việc thu mẫu dược liệu là một bước cực kỳ quan trọng và có ảnh hưởng lớn đến độ chính xác cũng
như giá trị khoa học của kết quả nghiên cứu cây thuốc. Nếu mẫu thu thập không đúng loài, sai bộ
phận, hoặc không đại diện cho quần thể, toàn bộ kết quả phân tích sẽ phản ánh một đối tượng sai lệch,
không phải đối tượng mục tiêu. Mẫu sai lệch cũng có thể dẫn đến kết quả thành phần hóa học không
đúng hoặc kém chất lượng, làm lãng phí thời gian và tài chính.
I. Nguyên tắc chung về thu mẫu
Việc thu mẫu nghiên cứu phải tuân thủ 5 nguyên tắc chính để đảm bảo chất lượng và độ tin cậy của dữ liệu: 1 lOMoAR cPSD| 47205411
1. Đúng đối tượng nghiên cứu.
2. Đảm bảo tính đại diện cho quần thể.
3. Tính nguyên vẹn vật lý của mẫu.
4. Tính phù hợp mục tiêu nghiên cứu.
5. Ghi nhận đầy đủ thông tin mẫu (metadata).
Giải thích chi tiết các nguyên tắc:
● 1. Đúng đối tượng nghiên cứu:
○ Đúng loài: Mẫu phải được xác định chính xác tên khoa học để tránh nhầm lẫn với các
loài tương tự, điều này có thể thay đổi hoàn toàn kết quả nghiên cứu.
○ Đúng bộ phận dùng: Cần thu đúng bộ phận của cây (lá, rễ, thân, hoa, quả, v.v.) theo
mục tiêu nghiên cứu. Ví dụ, nếu nghiên cứu flavonoid của Cúc hoa, phải lấy đúng
phần hoa đã nở hoàn toàn.
● 2. Đảm bảo tính đại diện của mẫu:
○ Tính đại diện cho quần thể: Mẫu phải thể hiện được đặc trưng trung bình của quần
thể nghiên cứu, tránh lấy các cây dị biệt hoặc cây bệnh, quá non/già.
○ Địa điểm thu hái: Vị trí thu hái ảnh hưởng sâu sắc đến chất lượng dược liệu. Ngay cả
cùng một loài, chất lượng hoạt chất có thể khác nhau đáng kể tùy thuộc vào vùng địa
lý (ví dụ: Hoắc hương ở các vùng khác nhau tại Trung Quốc).
○ Thời điểm thu hái: Hàm lượng hoạt chất trong cây thuốc thay đổi theo bộ phận, giai
đoạn sinh trưởng, điều kiện sinh thái. Thu hái đúng thời điểm khi dược liệu có chất
lượng tốt nhất là rất quan trọng để tối ưu hóa lợi ích.
■ Phần dưới mặt đất (rễ và thân rễ): Tốt nhất là khi cây 2-5 năm tuổi, tích tụ
nhiều chất dinh dưỡng và hoạt chất nhất, thường vào giữa mùa thu (khi các
bộ phận trên mặt đất chưa héo) và đầu mùa xuân (trước khi cây tái sinh). Ví
dụ: Hoàng kỳ, Đảng sâm bắc, Cát cánh.
■ Vỏ: Thu hái tốt nhất vào mùa xuân (tháng 4-5) khi nhựa cây và hoạt chất tối
đa, xylem dễ tách. Một số loại vỏ có thể tốt hơn vào mùa thu. Ví dụ: Hoàng
bá, Đỗ trọng, Hậu phác.
■ Lá: Thu hái khi cây ở giai đoạn sống mạnh nhất, lá dày và xanh. Ví dụ: Liên
diệp, Đại thanh diệp, La bố ma. Có trường hợp ngoại lệ như lá rụng sau
sương giá (Tỳ bà diệp).
■ Hoa: Thu hái ở giai đoạn ra hoa hoặc nở sớm, yêu cầu khắt khe về mùa thu hái.
Ví dụ: Kim ngân hoa, hoa Hòe, Cúc hoa, Hồng hoa.
■ Quả và hạt: Thu hái khi chín hoặc gần chín để đạt tối đa hoạt chất. Quả nứt
nên thu hái trước khi vỡ. Ví dụ: Xuyên tiêu, Sơn thù, Chỉ thực.
■ Toàn cây: Thu hái khi phát triển đầy đủ hoặc đầu giai đoạn phát triển, cân bằng
năng suất và chất lượng. Ví dụ: Thổ hoắc hương, Kinh giới, Mã tiên thảo, Bạc hà. Ngoại lệ:
Thanh hao hoa vàng thu hái trước khi ra hoa. ● 3. Tính nguyên vẹn vật lý: Mẫu phải giữ được
hình thái nguyên vẹn (không gãy nát, dập nát) để đảm bảo độ chính xác khi phân tích vi học và độ
ổn định của thành phần hóa học. Cần kiểm soát chặt chẽ quá trình thu hái, vận chuyển, và bảo
quản để tránh mốc, thối, khô héo bất thường, hoặc nhiễm tạp chất, côn trùng.
● 4. Tính phù hợp mục tiêu nghiên cứu: Mẫu cần đáp ứng yêu cầu đặc thù của từng dạng nghiên cứu. Ví dụ: 2 lOMoAR cPSD| 47205411
○ Nghiên cứu hiển vi: cần mẫu giữ được cấu trúc mô, thường là mẫu tươi.
○ Nghiên cứu chiết xuất: cần mẫu giàu hoạt chất mục tiêu.
○ Nghiên cứu dược lý: cần mẫu đảm bảo hoạt lực ổn định.
● 5. Ghi nhận đầy đủ thông tin mẫu (Metadata): Mỗi mẫu phải có hồ sơ thu thập đầy đủ các
thông tin tối thiểu sau để đảm bảo khả năng lặp lại nghiên cứu và đánh giá ảnh hưởng của điều kiện sinh thái:
○ Tên khoa học (kèm tên địa phương nếu có). ○ Bộ phận thu hái. ○ Ngày tháng thu hái.
○ Địa điểm thu hái (có tọa độ nếu có).
○ Môi trường sống (tự nhiên, trồng trọt).
○ Điều kiện thời tiết lúc thu hái (nếu liên quan).
○ Phương pháp xử lý sơ bộ (rửa sạch, phơi khô...).
II. Hướng dẫn thu và xử lý mẫu
Quy trình thu mẫu và xử lý mẫu bao gồm các bước sau:
1. Bước 1. Xác định Mục đích Nghiên cứu:
○ Xác định rõ loài thực vật và bộ phận cần thu thập.
○ Xác định mục đích cụ thể của nghiên cứu: phân tích ADN, vi học, phân tích hóa học,
nghiên cứu sinh học, bảo tồn, v.v..
2. Bước 2. Lập Kế hoạch và Chuẩn bị:
○ Tìm hiểu về đặc điểm sinh thái và phân bố địa lý của loài cần thu.
○ Lên kế hoạch cụ thể về thời gian, địa điểm, và phương pháp thu thập.
○ Chuẩn bị đầy đủ dụng cụ cần thiết: dao, kéo, túi thu mẫu, nhãn, sổ ghi chép, v.v.. ○
Lập kế hoạch vận chuyển và bảo quản mẫu sau khi thu.
3. Bước 3. Thu Thập Mẫu:
○ Tiến hành thu mẫu tại thời điểm phù hợp nhất cho loài cụ thể.
○ Sử dụng kỹ thuật thu mẫu thích hợp để không làm hại mẫu vật hoặc quần thể cây.
4. Bước 4. Ghi Chép Thông tin:
○ Ghi chép chi tiết thông tin về mẫu vật: tên khoa học, ngày giờ thu thập, địa điểm, môi
trường sống, điều kiện thời tiết và các thông tin liên quan khác.
5. Bước 5. Xử lý tại chỗ và Bảo quản mẫu:
○ Xử lý mẫu phù hợp theo mục đích nghiên cứu: Có thể ngâm mẫu trong dung dịch
cồn hoặc formalin để ngăn chặn sự phân hủy và giữ cấu trúc vi mô (đối với nghiên
cứu vi học). Hoặc sấy khô mẫu để giảm độ ẩm và ngăn chặn sự phát triển của vi
khuẩn và nấm mốc (đối với nghiên cứu hóa học). Đối với nghiên cứu ADN, mẫu tươi
có thể được bảo quản trong dung dịch bảo quản ADN hoặc ở nhiệt độ đông lạnh 20°C
đến -80°C, tránh đóng băng và rã đông liên tục. 3 lOMoAR cPSD| 47205411
○ Bảo quản và vận chuyển: Mẫu có thể được bảo quản trong túi nilon, hộp kín hoặc
trong dung môi. Vận chuyển mẫu đến phòng thí nghiệm một cách cẩn thận để đảm
bảo không làm thay đổi đặc tính của mẫu.
○ Ghi nhãn: Mỗi mẫu cần có nhãn mô tả chi tiết, bao gồm loài, ngày thu thập, địa điểm
và bất kỳ thông tin nào có thể ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu.
Nghiên cứu hiển vi là một phương pháp quan trọng trong nghiên cứu cây thuốc, giúp xác định tên
khoa học chính xác của dược liệu, phát hiện sự pha trộn hoặc giả mạo, mô tả đặc điểm vi học
cho các cây thuốc mới, và cung cấp bằng chứng khoa học ban đầu cho quá trình nghiên cứu
phát triển dược liệu.
III. Phương pháp hiển vi
Phương pháp hiển vi bao gồm nhiều kỹ thuật phân tích khác nhau:
● Phân tích tiêu bản vi phẫu: Mô tả tổng thể cấu trúc mô học của bộ phận cây thuốc.
● Phân tích tiêu bản bột: Quan sát các mô riêng lẻ sau khi dược liệu được nghiền thành bột.
● Phân tích phấn hoa (Palynology): Nghiên cứu các hạt phấn hoa và bào tử, cả còn sống lẫn
hóa thạch, bao gồm cấu trúc hình thái, phân bố, tiến hóa, và ứng dụng trong phân loại thực
vật, môi trường học, và giám định dược liệu (ví dụ: mật ong, chế phẩm thảo dược).
● Phân tích vi hóa: Dùng thuốc thử hóa học nhỏ trực tiếp lên lát cắt vi học hoặc bột để xác
định sự hiện diện của các nhóm chất tiết (tinh bột, lipid, alcaloid, nhầy, tannin, calcium
oxalat, v.v.), hỗ trợ định danh cây thuốc hoặc kiểm tra chất lượng dược liệu.
Nguyên tắc cơ bản trong nghiên cứu đặc điểm hiển vi: Để đảm bảo kết quả chính xác và đáng tin
cậy, nghiên cứu hiển vi cần tuân thủ các nguyên tắc sau:
● Mục tiêu phân tích rõ ràng: Xác định rõ đặc điểm nào cần tìm kiếm.
● Lựa chọn mẫu chuẩn: Mẫu phải đúng bộ phận cần nghiên cứu và là mẫu chuẩn.
● Chuẩn bị tiêu bản đúng kỹ thuật: Các lát cắt phải mỏng đều và nhuộm hợp lý.
● Quan sát hệ thống: Quan sát toàn bộ lát cắt, từ ngoài vào trong, theo một trình tự nhất định
(ví dụ: biểu bì, mô mềm, mô cứng, bó mạch).
● Mô tả khoa học, khách quan: Diễn tả hình thái, màu nhuộm, vị trí mô một cách chính xác.
● Cẩn trọng biến dị tự nhiên: So sánh nhiều tiêu bản để xác nhận đặc điểm, do cây thuốc có
thể có biến dị tự nhiên.
Các bước tiến hành phân tích vi phẫu:
1. Chọn mẫu: Lấy mẫu theo đúng bộ phận dùng của cây, đảm bảo mẫu tươi hoặc được bảo
quản tốt, không bị sâu bệnh. Cụ thể:
○ Thân và rễ nhỏ: Lấy một đoạn có đủ mặt cắt ngang.
○ Thân, rễ to và rễ củ: Lấy một phần có mặt cắt ngang hình quạt, bao gồm cấu tạo từ biểu bì đến tâm.
○ Vỏ thân: Lấy một phần cắt ngang hình chữ nhật, có cấu tạo từ bần đến tầng phát sinh libe-gỗ.
○ Lá: Lấy một đoạn gân giữa có dính mỗi bên một ít phiến lá.
○ Hoa: Bóc biểu bì hoặc cắt ngang từng bộ phận.
○ Quả và hạt nhỏ: Lấy nguyên cả quả và hạt.
○ Quả và hạt to: Lấy một phần, chọn vị trí cắt có đủ các đặc điểm. 4 lOMoAR cPSD| 47205411
2. Cắt tiêu bản: Dùng lưỡi lam hoặc dụng cụ cắt vi phẫu cầm tay để cắt mẫu thành từng lát
mỏng 10-20 µm. Có thể kẹp mẫu trong parafin rắn, củ khoai lang hoặc cà rốt để cắt. Có hai phương pháp cắt chính:
○ Quan sát cấu trúc bên trong: Cắt ngang, cắt dọc tiếp tuyến và cắt dọc xuyên tâm.
○ Quan sát bề mặt ngoài (surface view): Áp dụng cho các cấu trúc có thể phân biệt
được bề mặt như mặt lá, mặt hoa mà ánh sáng có thể xuyên qua. Một số lá, hoa dày;
quả, hạt, rễ và vỏ có thể sử dụng phương pháp cắt lớp ngoài (paradermal section).
3. Tẩy, nhuộm tiêu bản:
○ Ngâm lát cắt vào dung dịch cloramin T 5% hoặc nước Javen cho đến khi lát cắt trắng,
sau đó rửa sạch bằng nước cất. Nếu mẫu chứa nhiều tinh bột, tẩy tiếp bằng cloral
hydrat khoảng 10 phút rồi rửa sạch.
○ Ngâm lát cắt trong dung dịch acid acetic 1% khoảng 2 phút rồi rửa kỹ bằng nước cất.
○ Ngâm lát cắt trong dung dịch lục iod hoặc xanh methylen (1-5 giây), rửa nhanh bằng
ethanol 60% rồi rửa lại bằng nước cất.
○ Ngâm lát cắt trong dung dịch carmin 40 cho đến khi thấy màu đỏ bắt rõ thì rửa bằng nước cất.
○ Thuốc nhuộm và đối tượng bắt màu:
■ Đỏ carmin: Bắt màu các mô còn sống, mô mềm, mô parenchyma, biểu bì, mô
mềm vỏ, mô mềm ruột, tế bào khí khổng, cho màu đỏ.
■ Xanh methylen: Bắt màu các mô hóa gỗ, mô lignin hóa, mô cứng, mạch gỗ, sợi gỗ, cho màu xanh. 4. Chụp ảnh.
5. Mô tả: Mô tả tiêu bản một cách có hệ thống, dùng ngôn ngữ khoa học. Trình tự mô tả gồm 5 bước:
○ Xác định loại mô: Biểu bì, mô mềm, mô cứng, bó mạch, ống tiết, tinh thể, v.v.
○ Hình dạng mô/tế bào: Dài, ngắn, tròn, đa giác, hình kim, hình que, v.v.
○ Kích thước tương đối: Lớn/nhỏ so với các mô xung quanh.
○ Màu nhuộm: Đỏ, xanh (tương ứng với thuốc nhuộm).
○ Vị trí, sự phân bố: Ở ngoài cùng, trong lõi, quanh bó mạch, v.v.
IV. Các đặc điểm của vi phẫu cần lưu ý
Việc quan sát và mô tả các đặc điểm vi phẫu cần được tiến hành chi tiết, từ ngoài vào trong. Dưới đây
là các loại mô và cấu trúc chính cần lưu ý:
1. Mô phân sinh (Meristematic Tissue):
○ Tập hợp các tế bào non, chưa biệt hóa.
○ Mô phân sinh đỉnh: Làm tăng chiều dài cây (cấu tạo cấp 1).
○ Mô phân sinh bên: Làm tăng chiều ngang cây, gồm tầng sinh mạch (ở lõi) và tầng sinh
bần (ở lớp vỏ) tạo nên cấu tạo cấp 2.
○ Sự phân biệt rễ - thân – lá dựa vào phân bố tự nhiên của hệ mô dẫn và hệ mô cơ bản.
2. Hệ mô biểu bì (Epidermal Tissue System):
○ Biểu bì (Epidermis): Các tế bào sống ngoài cùng bao bọc các phần của cây, đa số có lớp cutin bảo vệ. 5 lOMoAR cPSD| 47205411
■ Lỗ khí (Stomata): Các lỗ siêu nhỏ trên bề mặt biểu bì, hình thành bởi hai tế
bào bảo vệ, điều chỉnh trao đổi khí và cân bằng nước. Dưới lỗ khí thường có một khoang trống.
■ Lông che chở (Covering Hairs - Trichomes): Có các tế bào ở đầu nhọn, phân
biệt theo đơn bào/đa bào, đơn chuỗi/song chuỗi/đa chuỗi, mọc thẳng/phân
nhánh, thành tế bào dày/mỏng, họa tiết/vân trên lông.
■ Lông tiết (Glandular Hairs): Các tế bào ở đầu tròn, chứa chất tiết. Phân biệt
rõ chân lông và đầu lông tiết. Rất quan trọng để cất tinh dầu hoặc nhận diện dược liệu.
○ Lớp chu bì (Periderm): Phát triển thứ cấp, thay thế biểu bì ở rễ và thân già, gồm 3 lớp:
■ Vỏ bần (Cork - Phellem): Nhiều lớp tế bào chết, vách tế bào biến thành chất
bần (suberin) không thấm nước và khí, xếp đều thành dãy xuyên tâm và vòng tròn đồng tâm.
■ Tầng sinh bần (Cork Cambium - Phellogen).
■ Lục bì (Phelloderm): Các mô mềm vỏ, có nhiệm vụ dự trữ.
○ Vỏ cây (Bark): Lớp bên ngoài tầng sinh mạch, gồm vỏ trong (sống) và vỏ ngoài (chết).
3. Hệ mô cơ sở (Ground Tissue System):
○ Mô mềm (Parenchyma): Tế bào thành mỏng (có thể dày hơn ở lõi thân cây), hình đa
giác, có nhiều hình thái và sinh lý khác nhau, có các khoảng gian bào. Có thể chuyên
biệt hóa để quang hợp (chlorenchyma) hoặc dự trữ (mô mềm dự trữ). Theo vị trí: mô
mềm vỏ, mô mềm gỗ, mô mềm ruột, nội nhũ.
○ Mô dày (Collenchyma): Tế bào có chức năng hỗ trợ cơ học, thường ở thân cây thân
thảo, lá, hoa, chủ yếu dưới lớp biểu bì. Phân biệt mô dày góc, mô dày phiến, mô dày
khuyết tùy vị trí thành dày lên.
○ Mô cứng (Sclerenchyma): Tế bào có thành thứ cấp dày, cứng, thường hóa gỗ; chức
năng hỗ trợ và bảo vệ. Có 2 loại:
■ Tế bào cứng (Sclereids) và thể cứng: Đường kính đồng đều hoặc ngắn, hình
dạng đa dạng, có các kênh hố phân nhánh. Thường tìm thấy trong vỏ, rễ, vỏ
quả, hạt. Đặc điểm phân bố, đa dạng, kích thước, hình dạng quan trọng để
xác định dược liệu và dễ phát hiện bằng kính hiển vi phân cực.
■ Sợi (Fibers): Tế bào dài, hình trục với thành thứ cấp dày, thường hóa gỗ chứa
các lỗ đơn giản. Được đặt tên theo mô nơi chúng xuất hiện (sợi libe, sợi gỗ,
sợi vỏ). Bó sợi có thể chứa tinh thể.
4. Hệ mô dẫn (Vascular Tissue System):
○ Các mô dẫn gồm tế bào dài xếp nối tiếp thành dãy dọc, vận chuyển dinh dưỡng.
○ Mô gỗ (Xylem): Vận chuyển nước và khoáng chất. Gồm yếu tố mạch, sợi gỗ, và mô mềm gỗ.
■ Thành phần mạch (Tracheary element): Gồm mạch ngăn (tracheids – tế bào
thuôn dài, thành hóa gỗ, lỗ trên thành chung cho nước đi qua) và mạch gỗ
(vessel element – đường kính lớn hơn, ngắn hơn, có lỗ lớn/tấm thủng nơi nối
đầu vào cuối, tạo thành ống dài).
■ Các dạng mạch gỗ: Hóa gỗ ở thành dày lên theo các kiểu mạch vòng, mạch
xoắn, mạch mạng, mạch vạch, mạch điểm (đơn hoặc viền).
○ Mô libe (Phloem): Vận chuyển oligosaccharide và chất dinh dưỡng khác. Gồm yếu tố
rây (sieve-tube, tế bào kèm/tế bào rây), tế bào mô mềm dự trữ, và sợi sclerenchyma. 6 lOMoAR cPSD| 47205411
■ Mạch rây (Sieve-tube): Tế bào sống, dài, vách mỏng bằng cellulose, vách
ngang có nhiều lỗ thủng (sàng).
■ Tế bào kèm (Companion cells): Tế bào sống, dài, vách mỏng, nằm cạnh các mạch rây.
○ Bó mạch (Vascular Bundles): Vị trí tương đối và cách sắp xếp của mô gỗ và libe tạo
thành các kiểu bó mạch khác nhau, có ý nghĩa trong kiểm nghiệm: bó chồng
(collateral), bó chồng kép (bicollateral), bó đồng tâm (concentric), bó xuyên tâm (radial).
5. Cấu trúc tiết (Secretory Structures):
○ Cấu tạo bởi các tế bào sống, vách cellulose, tiết ra các chất được coi là "cặn bã" hoặc
sản phẩm chuyển hóa của cây (tinh dầu, nhựa, gôm, tanin, canxi oxalat, v.v.).
○ Tế bào tiết (Idioblasts): Tế bào riêng lẻ rải rác trong mô mềm, chứa chất tiết do chính
nó tạo ra (tinh dầu, tinh thể canxi oxalat, tanin, chất nhày). Nhận biết bằng phản ứng vi hóa.
○ Ống tiết (Secretory ducts), túi tiết (Secretory cavities): Lỗ hổng hình cầu (túi) hay
hình trụ (ống) bao bọc bởi các tế bào tiết. Phân biệt theo kiểu phân sinh
(schizogenous) hoặc dung sinh (lysigenous).
○ Nhựa mủ (Laticifers): Dạng tế bào biệt hóa chứa dịch dạng sữa, có thể là đơn bào dài
không phân nhánh (không phân đốt) hoặc tập hợp nhiều tế bào xếp nối tiếp (phân đốt).
6. Các chất tiết (Secreted Substances):
○ Tinh bột (Starch): Polysaccharid dự trữ, nằm trong tế bào mô mềm. Quan sát hạt
đơn, hạt kép, hình dạng, kích thước, hình dạng rốn, vân tăng trưởng. Bắt màu xanh tím với Lugol.
○ Tinh thể (Crystals): Tồn tại phổ biến, ở nhiều bộ phận, là đặc điểm quan trọng trong
nhận dạng. Tinh thể canxi oxalat phổ biến nhất, với nhiều hình dạng: cầu gai, khối
lăng trụ, hình kim (raphides), dạng cát (crystal sand). Phát hiện bằng ánh sáng phân cực. 7 lOMoAR cPSD| 47205411 ○
Aleuron: Hạt tinh thể protein, globoid, phổ biến trong hạt (đặc biệt hạt có dầu), hoặc
tạo thành lớp aleurone trong hạt họ Poaceae. Nhuộm màu nâu vàng với Iod.
○ Tinh dầu (Volatile oils): Hỗn hợp terpen và terpenoid, tìm thấy dưới dạng giọt dầu nhỏ
trong tế bào tiết đặc biệt, ống tiết hoặc túi tiết. Tan trong cồn và nhuộm màu đỏ cam với Sudan.
○ Dầu béo (Fixed oils): Este của acid béo, xuất hiện dưới dạng giọt chất lỏng trong tất cả
các mô thực vật, phổ biến nhất trong hạt và quả.
○ Chất nhày (Mucilage): Phức hợp polysaccharide, giúp cây giữ nước. Dưới kính hiển vi
thường thấy sự phân tầng. Có thể nhuộm bằng dung dịch xanh methylen.
Để giám định mẫu trong nghiên cứu cây thuốc, việc bảo quản và lưu trữ mẫu đúng cách cùng với quá
trình mô tả đặc điểm và giám định loài là vô cùng quan trọng, quyết định đến độ chính xác và giá trị
khoa học của toàn bộ kết quả nghiên cứu.
Dưới đây là tổng hợp chi tiết từ các nguồn tài liệu được cung cấp:
V. Bảo quản và Lưu trữ Mẫu
Việc bảo quản và lưu trữ mẫu đúng cách là nền tảng để đảm bảo chất lượng, tính đại diện và nguyên
vẹn vật lý của mẫu, từ đó có được kết quả nghiên cứu đáng tin cậy và có khả năng tái lặp.
1. Yêu cầu chung về mẫu nghiên cứu:
● Tính nguyên vẹn vật lý: Mẫu phải nguyên vẹn về hình thái (không gãy nát, dập nát) để
đảm bảo độ chính xác khi phân tích vi học và độ ổn định thành phần hóa học.
● Kiểm soát quá trình: Cần chú ý quá trình thu hái, vận chuyển và bảo quản để mẫu không bị
mốc, thối, khô héo bất thường, và tránh nhiễm tạp, côn trùng.
● Phù hợp mục tiêu nghiên cứu: Mẫu cần đáp ứng yêu cầu đặc thù theo từng dạng nghiên cứu
(ví dụ: nghiên cứu hiển vi cần mẫu giữ được cấu trúc mô, nghiên cứu chiết xuất cần mẫu giàu
hoạt chất, nghiên cứu dược lý cần mẫu có hoạt lực ổn định).
2. Ghi nhận đầy đủ thông tin mẫu (Metadata): Mỗi mẫu cần kèm theo hồ sơ thu thập mẫu tối
thiểu hoặc nhãn mô tả chi tiết gồm:
● Tên khoa học (kèm tên địa phương nếu có).
● Bộ phận thu hái.
● Ngày tháng thu hái.
● Địa điểm thu hái (tọa độ nếu có).
● Môi trường sống (tự nhiên, trồng trọt).
● Tất cả các thông tin này cần được tư liệu hóa vào máy tính (ví dụ: Excel) với các thông tin
như số hiệu mẫu, mã số ảnh, địa điểm và nơi lấy, ngày lấy mẫu.
3. Phương pháp bảo quản và lưu trữ theo mục đích nghiên cứu:
● Đối với nghiên cứu hiển vi:
○ Mẫu cần được bảo quản trong dung dịch cồn hoặc dung dịch formalin để ngăn chặn
sự phân hủy và giữ cấu trúc vi mô.
○ Lưu trữ lâu dài trong dung dịch bảo quản thích hợp hoặc môi trường paraffin. 8 lOMoAR cPSD| 47205411 ○
Tại thực địa, mẫu có thể được xông cồn để bảo quản và diệt men làm rụng lá, giúp
giữ mẫu trong khoảng 1 tháng trước khi sấy khô.
● Đối với nghiên cứu hóa học:
○ Mẫu cần được sấy khô để giảm độ ẩm và ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn và nấm mốc.
○ Lưu trữ mẫu khô trong điều kiện nhiệt độ và độ ẩm thấp, cách xa ánh sáng.
● Đối với nghiên cứu dược lý:
○ Mẫu được bảo quản trong tủ lạnh hoặc đông lạnh để bảo toàn hoạt tính của các thành phần dược lý.
○ Đối với mẫu cần giữ hoạt tính sinh học, cần lưu trữ ở nhiệt độ -80°C hoặc nhiệt độ nitơ lỏng.
● Đối với nghiên cứu ADN:
○ Bảo quản mẫu tươi trong dung dịch bảo quản ADN hoặc lưu trữ ở nhiệt độ đông
lạnh -20°C đến -80°C.
○ Cần tránh đóng băng và rã đông liên tục, vì điều này có thể làm hỏng ADN.
VI. Mô tả Đặc điểm và Giám định Loài
Giám định loài chính xác là bước đầu tiên và quan trọng nhất để đảm bảo tính hợp lệ của toàn bộ nghiên cứu cây thuốc.
1. Vai trò và tầm quan trọng của giám định loài:
● Xác định tên khoa học đúng: Đây là mục tiêu chính, giúp nhận diện chính xác đối tượng nghiên cứu.
● Phát hiện pha trộn, giả mạo: Giúp kiểm soát chất lượng dược liệu, tránh tình trạng pha trộn
hoặc sử dụng nhầm lẫn các loài.
● Mô tả đặc điểm vi học cho cây thuốc mới: Góp phần tạo ra thông tin cơ bản ban đầu cho
các nghiên cứu tiếp theo.
● Cung cấp bằng chứng khoa học: Đảm bảo độ tin cậy của các kết quả nghiên cứu và phát triển sản phẩm.
● Tránh sai lệch kết quả: Nếu mẫu không đúng loài hoặc sai bộ phận, toàn bộ kết quả phân
tích hóa học, dược lý sẽ bị sai lệch, không phản ánh đúng đối tượng mục tiêu hoặc hàm lượng hoạt chất thực sự.
2. Các bước thực hiện mô tả đặc điểm và giám định tên khoa học:
Quá trình này bao gồm việc thu thập, mô tả chi tiết các đặc điểm hình thái và vi học, sau đó đối chiếu
với các tài liệu và chuyên gia để xác định tên khoa học.
● Bước 1: Thu thập thông tin cơ bản
○ Ghi chép tên khoa học (nếu đã biết sơ bộ), tên địa phương, ngày thu thập, và tên người thu thập.
○ Ghi chú vị trí cụ thể của mẫu, bao gồm địa lý và điều kiện sinh thái (ví dụ: môi
trường sống tự nhiên hay trồng trọt). ● Bước 2: Mô tả hình thái tổng thể 9 lOMoAR cPSD| 47205411 ○
○ Ghi lại kích thước, hình dạng, màu sắc và kết cấu tổng thể của cây.
Mô tả thói quen sinh trưởng (ví dụ: cây lớn, cây bụi, dây leo). ●
Bước 3: Mô tả chi tiết các bộ phận của cây
○ Rễ: Hình dạng, kích thước và các đặc điểm đặc trưng.
○ Thân: Thân gỗ hay thân mềm, hình dạng và cấu trúc vỏ.
○ Lá: Kích thước, hình dạng, màu sắc, loại lá đơn hay kép, cấu trúc gân và cảm giác khi sờ nắn.
○ Hoa: Hình dạng, màu sắc, kích thước, cấu trúc hoa và sự sắp xếp của chúng trên cây. ○
Quả và hạt: Kích thước, hình dạng, đặc điểm bề mặt và màu sắc.
○ Khi thu mẫu tại thực địa, cần đảm bảo mỗi mẫu có đầy đủ các bộ phận như cành, lá,
hoa và quả (nếu có), và ghi chép ngay những đặc điểm dễ nhận biết ngoài thiên nhiên mà có thể
mất đi sau khi khô (màu sắc hoa, quả, mùi vị). ● Bước 4: Mô tả các đặc điểm chi tiết nhỏ
(nghiên cứu hiển vi)
○ Sử dụng kính lúp hoặc kính hiển vi soi nổi để xem xét các đặc điểm vi mô như lông
che chở hoặc cấu trúc biểu bì lá.
○ Nghiên cứu hiển vi bao gồm phân tích tiêu bản vi phẫu (mô tả tổng thể cấu trúc mô
học) và tiêu bản bột (quan sát các mô riêng lẻ), phân tích phấn hoa và vi hóa (dùng
thuốc thử hóa học để xác định nhóm chất).
○ Trong nghiên cứu hiển vi, cần tuân thủ các nguyên tắc như mục tiêu phân tích rõ ràng,
lựa chọn mẫu chuẩn, chuẩn bị tiêu bản đúng kỹ thuật, quan sát hệ thống, phân tích mô học cơ bản,
mô tả khoa học và khách quan, và cẩn trọng với biến dị tự nhiên. ● Bước 5: Chụp ảnh và vẽ minh họa
○ Chụp ảnh rõ ràng từ nhiều góc độ khác nhau và các bộ phận của cây.
○ Vẽ minh họa hoặc sơ đồ cấu trúc để mô tả thêm chi tiết. ●
Bước 6: Giám định và chỉnh lý tên khoa học
○ Dựa theo các khóa phân loại và tài liệu mô tả tham khảo.
○ So sánh với mẫu vật của các Bảo tàng thực vật (ví dụ: Phòng tiêu bản – Trường Đại
học Dược Hà Nội (HNIP); Phòng tiêu bản – Khoa Sinh học – Đại học Khoa học Tự nhiên).
○ Dựa vào hỗ trợ của chuyên gia thực vật.
○ Các mẫu được phân chia theo họ/chi trước khi tiến hành xác định loài.
○ Sau khi mô tả và phân tích các đặc điểm của mẫu, sinh viên cần xác định được tên khoa học đến họ/chi/loài.
Câu 2: Trình bày phương pháp định tính, định lượng.
Dưới đây là trình bày chi tiết về phương pháp định tính và định lượng các chất trong dược liệu, bao
gồm các bước tiến hành, lưu ý, ưu nhược điểm: 10 lOMoAR cPSD| 47205411 ○
I. Tổng quan về các phương pháp định tính và định lượng trong nghiên cứu cây thuốc
Nghiên cứu cây thuốc bao gồm nhiều lĩnh vực, trong đó phân tích hóa thực vật đóng vai trò quan
trọng trong việc xác định thành phần hóa học, kiểm nghiệm và tiêu chuẩn hóa dược liệu. Các phương 11 lOMoAR cPSD| 47205411
pháp định tính và định lượng hợp chất tự nhiên trong dược liệu là nền tảng để đánh giá chất lượng,
hiệu quả và an toàn của dược liệu.
Các phương pháp chính để định tính và định lượng các nhóm chất trong dược liệu bao gồm:
● Định tính bằng phản ứng hóa học.
● Định tính và định lượng bằng sắc ký (Sắc ký lớp mỏng (TLC), Sắc ký lớp mỏng hiệu năng
cao (HPTLC), Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), Sắc ký khí (GC), Sắc ký khí khối phổ (GC-MS)).
● Định tính và định lượng bằng phương pháp phổ (UV-Vis, MS).
● Định lượng bằng phương pháp cân.
● Định lượng bằng phương pháp thể tích.
● Đánh giá bằng phương pháp sinh vật.
● Nghiên cứu hiển vi cũng là một phương pháp quan trọng để định tính dược liệu dựa trên cấu trúc mô học.
II. Phương pháp nghiên cứu hiển vi (Có ở trên r)
Nghiên cứu hiển vi là một phương pháp góp phần xác định tên khoa học của cây thuốc, phát hiện pha
trộn, giả mạo trong dược liệu, mô tả đặc điểm vi học cho cây thuốc mới và cung cấp bằng chứng khoa
học ban đầu cho nghiên cứu phát triển.
Phân tích vi hóa Phân tích vi hóa là kỹ thuật dùng thuốc thử hóa học nhỏ trực tiếp lên lát cắt
vi học hoặc bột vi học để xác định sự hiện diện của các nhóm chất tiết (tinh bột, lipid, alcaloid, nhầy,
tannin, calcium oxalat,...) và giúp nhận dạng thành phần hóa học hỗ trợ trong định danh cây thuốc
hoặc kiểm tra chất lượng dược liệu.
● Các thuốc thử và đối tượng phát hiện:
○ Lugol: Tinh bột (Xanh tím).
○ Dragendorff: Alcaloid (Màu cam).
○ Ruthenium Red: Chất nhầy (Đỏ hồng).
○ FeCl₃: Tannin (Xanh đen).
○ Sudan III/IV: Lipid (Đỏ cam).
○ HCl: Calcium oxalat (Tan mất tinh thể).
○ Tinh dầu + cồn orcanet → đỏ tươi.
○ Tinh dầu + acid osmic → oxyt osmic (tủa đen).
III. Phương pháp sắc ký
Sắc ký là một kỹ thuật phân tách các chất trong hỗn hợp dựa trên sự khác biệt về ái lực của chúng với pha tĩnh và pha động.
1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)
● Nguyên tắc: TLC là kỹ thuật tách các chất phân tích ra khỏi nhau khi chúng di chuyển theo
pha động nhờ lực mao dẫn qua pha tĩnh (bản mỏng tráng các hạt pha tĩnh).
○ Pha tĩnh: Thường là silicagel, nhôm oxyd, được tráng trên nền phẳng (kính, kim loại).
Silica gel trên bề mặt có các nhóm -OH. ○ Pha động: Hệ dung môi khai triển. 12 lOMoAR cPSD| 47205411 ● Định tính:
○ Bước tiến hành:
1. Chuẩn bị bản mỏng: Thường dùng silicagel (pha thuận) cho chất kém phân
cực đến trung bình, hoặc silicagel pha đảo cho hợp chất rất phân cực. Cần
hoạt hóa bản mỏng ở 100-105°C trong 2 giờ.
2. Đưa mẫu phân tích lên bản mỏng: Chấm mẫu dưới dạng điểm hoặc vạch
nhỏ, gọn, với thể tích khoảng 1-10 µL. Vạch xuất phát cách mép dưới bản mỏng 1.0-1.5 cm.
3. Chuẩn bị hệ dung môi khai triển: Lựa chọn hệ dung môi phù hợp với độ
phân cực của nhóm chất cần tách (ví dụ: toluen – ethyl acetat cho chất kém
phân cực, ethyl acetat – methanol – nước cho chất phân cực). Tỷ lệ và pH của
dung môi có thể được điều chỉnh để vết tách rõ hơn. Dung môi phải được pha
trước và không tái sử dụng.
4. Khai triển sắc ký: Đặt bản mỏng vào bình khai triển kín, đã bão hoà dung
môi. Không di chuyển bình trong quá trình khai triển. Sau khi khai triển, lấy
bản mỏng ra, đánh dấu đường chạy của dung môi và để bay hơi hoàn toàn.
5. Hiện sắc đồ/Quan sát vết:
■ Quan sát bằng mắt thường (với chất có màu).
■ Soi dưới đèn tử ngoại (UV 254nm, 366nm).
■ Phun thuốc thử hiện màu chung (acid sulfuric, vanillin-sulfuric,
anisaldehyd-sulfuric, hơi Iod) hoặc đặc hiệu (Dragendorff cho
alcaloid, NP/PEG cho flavonoid, KOH 10%/Ethanol cho coumarin).
○ Đánh giá: Dựa vào giá trị Rf của chất thử so với Rf của chất chuẩn chạy trong cùng điều kiện.
○ Ưu điểm: Đơn giản, dễ thực hiện, chi phí thấp, cần ít mẫu, phân tích đồng thời được
nhiều mẫu, kết quả thu được dưới dạng hình ảnh.
○ Nhược điểm: Kết quả phụ thuộc nhiều yếu tố, độ lặp lại kém (đã phần nào được cải
thiện ở HPTLC), thành phần pha động dễ thay đổi, vết dễ bị kéo đuôi.
2. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC)
● Giới thiệu: Là kỹ thuật tự động, tinh vi được nâng cấp từ TLC, phù hợp cho phân tích định
tính và bán định lượng.
● Nguyên tắc: Cùng nguyên tắc lý thuyết của TLC (sắc ký hấp phụ).
● Khác biệt so với TLC:
○ Sử dụng tấm sắc ký: Máy chấm tự động (thay vì bằng tay).
○ Độ dày bản mỏng: 100-200 µm (TLC là 250 µm).
○ Thể tích mẫu chấm: 0.2-5 µL (TLC là 1-10 µL).
○ Hiệu quả cao, thời gian phân tích giảm đáng kể.
○ Kích cỡ vết nhỏ hơn (0.5-1mm so với 2-4mm).
○ Có thể quét bằng UV/Vis/Fluorescence scanner (densitometer).
● Định lượng: Thường bằng cách đo mật độ vết trên sắc đồ bằng máy quét hoặc khoét vết hòa
tan trong dung môi thích hợp rồi đo quang.
3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 13 lOMoAR cPSD| 47205411 ●
Giới thiệu: HPLC là kỹ thuật phân tích dựa trên sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa
trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao. Đây là phương pháp phổ
biến trong kiểm tra chất lượng thuốc và phân tích sinh dược học.
● Nguyên tắc hoạt động: Dựa vào khả năng hấp thụ quang vùng UV-Vis của chất cần phân
tích để định tính và định lượng.
● Cơ chế tách: Phân bố, hấp phụ, trao đổi ion, rây phân tử. Phổ biến nhất là sắc ký phân bố pha đảo. ● Định tính:
○ So sánh thời gian lưu (tR): tR của chất phân tích trong dung dịch thử được so sánh
với tR của chất chuẩn trong dung dịch chuẩn chạy cùng điều kiện sắc ký.
○ So sánh phổ UV-VIS: của chất phân tích trong mẫu chuẩn và thử (hệ số match ≥ 0.998).
○ Phương pháp "dấu vân tay": Áp dụng cho dược liệu có thành phần hóa học chưa biết
rõ. Phân tích dịch chiết bằng HPLC trong điều kiện sắc ký phù hợp để thể hiện tối đa
thành phần cấu tạo, sau đó so sánh với mẫu đối chiếu.
● Định lượng: HPLC là phương pháp đáng tin cậy và thông dụng nhất hiện nay để định lượng
flavonoid. Có thể định lượng một thành phần hoặc đồng thời nhiều thành phần.
○ Các phương pháp:
■ Phương pháp chuẩn ngoại: Phổ biến nhất. So sánh trực tiếp chiều cao/diện
tích pic của mẫu thử với chất chuẩn có nồng độ đã biết.
■ Ưu điểm: Tiến hành nhanh hơn phương pháp đường chuẩn.
■ Nhược điểm: Mắc sai số do tiêm mẫu không lặp lại hoặc xử lý mẫu phức tạp.
■ Phương pháp chuẩn nội: Thêm vào mẫu chuẩn và mẫu thử một lượng như
nhau của một chất tinh khiết thứ hai (chuẩn nội).
■ Yêu cầu chuẩn nội: Có cấu trúc hóa học tương tự chất thử, nồng độ
xấp xỉ chất thử, không phản ứng với thành phần mẫu thử, tách hoàn
toàn khỏi chất thử (Rs>1.25), có tR gần tR của chất thử.
■ Ưu điểm: Giảm sai số do tiêm mẫu và quá trình xử lý mẫu phức tạp.
■ Nhược điểm: Chọn điều kiện sắc ký để tách khó hơn.
■ Phương pháp thêm chuẩn: Phối hợp chuẩn ngoại và chuẩn nội. Thêm vào
mẫu thử một lượng đã biết của chất chuẩn. Độ chính xác cao do loại trừ được
sai số từ các yếu tố ảnh hưởng, đặc biệt quá trình xử lý mẫu.
■ Phương pháp chuẩn hóa diện tích: Hàm lượng phần trăm của một chất/hỗn
hợp bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic của nó so với tổng diện tích của tất cả
các pic trên sắc ký đồ. Yêu cầu tất cả các thành phần đều rửa giải và có hệ số
đáp ứng như nhau. Hạn chế trong HPLC vì đáp ứng của detector không giống nhau.
○ Ưu điểm của HPLC: Độ chính xác và độ nhạy cao, có tính đặc hiệu, thực hiện tương
đối nhanh và thuận tiện.
○ Nhược điểm của HPLC: Đòi hỏi thiết bị và dung môi đắt tiền, chất chuẩn tinh khiết.
4. Sắc ký khí (GC) 14 lOMoAR cPSD| 47205411 ●
● Nguyên tắc: Là phương pháp tách trong đó pha động là chất khí (khí mang) và pha tĩnh chứa
trong cột là chất rắn hoặc chất lỏng phủ trên chất mang trơ. Dựa trên khả năng bay hơi và độ
bền nhiệt của chất phân tích.
Định tính: Dựa vào giá trị tR (thời gian lưu) của chất thử so với tR của chất chuẩn chạy trong
cùng điều kiện. Có thể kết nối với khối phổ (MS) để khẳng định bản chất mẫu. ● Định lượng:
○ Dựa vào diện tích pic (S) hoặc chiều cao (h) của chất phân tích tỷ lệ thuận với nồng độ chất trong mẫu.
○ Thường dùng kỹ thuật chuẩn nội, chuẩn hóa diện tích và thêm chuẩn. Kỹ thuật chuẩn
nội hay được sử dụng để loại sai số do tiêm mẫu (do không có vòng chứa mẫu).
● Ưu điểm: Phân tích nhanh, hiệu quả cao, độ phân giải lớn, độ nhạy cao (cỡ ppm hoặc ppb), ít
mẫu, độ tin cậy cao, chi phí không quá cao.
● Nhược điểm: Chỉ giới hạn ở mẫu hơi hoặc có thể hóa hơi, khó phân tích chất rất phân cực,
không phù hợp mẫu không bền nhiệt, khó cho sắc ký điều chế. Thường đòi hỏi đầu dò phổ
(MS) để khẳng định định tính.
5. Sắc ký khí khối phổ (GC-MS)
● Là sự kết hợp giữa sắc ký khí và khối phổ. GC giúp tách các thành phần trong hỗn hợp, sau
đó MS sẽ xác định khối lượng phân tử và cấu trúc của từng thành phần dựa trên phổ mảnh.
Chủ yếu dùng trong định tính.
IV. Định tính, định lượng theo nhóm hợp chất 1. Alcaloid ● Định tính:
○ Phản ứng tạo tủa: Chiết xuất alcaloid, loại tạp, sau đó làm phản ứng tạo tủa bằng các
thuốc thử chung như Dragendorff (cho màu cam), Bouchardart (tủa nâu). ○ Phản ứng
màu đặc hiệu: Ví dụ, định tính morphin bằng thuốc thử Marquis (sulfoformol) cho
màu đỏ sẫm, hoặc phản ứng Huseman. Acid meconic (trong nhựa thuốc phiện) cho màu đỏ với FeCl3.
○ Sắc ký lớp mỏng (SKLM):
■ Bản mỏng: Silicagel GF254.
■ Dung môi khai triển: CHCl3 : MeOH : NH4OH (50:9:1) hoặc CHCl3 –
CH3OH (9:1 hoặc 98:2), thường thêm kiềm yếu.
■ Dịch chấm sắc ký: Chiết alcaloid base bằng dung môi hữu cơ trong môi
trường kiềm, bốc hơi dung môi đến khô.
■ Phát hiện vết: UV 254nm hoặc thuốc thử Dragendorff (vết màu cam hoặc đỏ nâu). ● Định lượng:
○ Phương pháp cân:
■ Nguyên tắc: Chiết kiệt alcaloid, loại tạp, bốc hơi dung môi đến khô, sấy cắn ở
nhiệt độ thích hợp đến khối lượng không đổi rồi cân. Áp dụng khi alcaloid
chiếm tỷ lệ lớn, hoặc chưa xác định cấu trúc rõ ràng, hoặc hỗn hợp nhiều alcaloid phức tạp. 15 lOMoAR cPSD| 47205411 ●
■ Ưu điểm: Dễ tiến hành, không đòi hỏi thiết bị đắt tiền.
■ Nhược điểm: Sai số cao (đặc biệt khi hàm lượng alcaloid thấp), thời gian lâu.
○ Phương pháp acid - base: 16 lOMoAR cPSD| 47205411 ■
Nguyên tắc: Dựa vào tính base yếu của alcaloid. Alcaloid dạng base được
chuẩn độ bằng acid chuẩn độ dư (HCl hoặc H2SO4) sau đó định lượng acid
thừa bằng kiềm tương ứng.
■ Điều kiện áp dụng: Alcaloid chiết ra ở dạng base, có độ kiềm rõ rệt, biết khối
lượng phân tử để tính đương lượng.
■ Yêu cầu: Dịch chiết alcaloid phải trong, không lẫn chất kiềm (NH3, amin)
hoặc chất màu, chất béo gây nhiễu chỉ thị.
■ Chỉ thị: Methyl đỏ (pH 4.2-6.3).
○ Phương pháp đo quang (so màu):
■ Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng tạo màu của alcaloid hoặc biến đổi alcaloid
thành dẫn chất có màu (ví dụ: chuyển morphin thành nitrosomorphin màu đỏ
đậm trong môi trường kiềm). ○ HPLC:
■ Nguyên tắc: Hàm lượng alcaloid được tính dựa trên diện tích pic của chất chuẩn và chất thử.
■ Yêu cầu: Có alcaloid tinh khiết làm chuẩn, xây dựng quy trình chiết kiệt và
chương trình sắc ký phù hợp.
■ Ưu điểm: Độ chính xác cao, độ nhạy cao, có tính đặc hiệu, thực hiện nhanh và thuận tiện. 2. Lipid ● Định tính:
○ Cảm quan: Màu sắc (trắng, ngà, vàng), mùi vị (không mùi, vị béo, ngậy), thể chất (lỏng, bán rắn).
○ Hằng số vật lý: Tỷ trọng (nhỏ hơn 1, dầu thầu dầu cao nhất), chỉ số khúc xạ (1.4690-
1.4771), độ nhớt (cao, dầu thầu dầu cao nhất).
○ Vi hóa: Sử dụng thuốc thử Sudan III/IV cho màu đỏ cam. ● Định lượng:
○ Xác định hàm lượng chất béo: Bằng phương pháp cân (thực hành TTDL1).
○ Xác định thành phần acid béo: GC-MS sau khi methyl hóa tạo dẫn chất ester methylic.
○ Xác định thành phần không xà phòng hóa: Sterol, carotenoid, tocopherol.
○ Chỉ số hóa học: Chỉ số acid, peroxyd, xà phòng, acetyl, iod. 3. Anthranoid ● Định tính:
○ Màu sắc: Các dẫn chất anthraquinon đều có màu từ vàng, vàng cam đến đỏ.
○ Thăng hoa: Dễ thăng hoa, có thể định tính bằng vi thăng hoa anthraquinon trên lam kính.
○ Độ tan: Dạng glycosid tan trong nước, dạng tự do (aglycon) tan trong dung môi hữu cơ.
○ Phản ứng hóa học: 17 lOMoAR cPSD| 47205411 ■
■ Phản ứng Borntraeger: Dẫn chất 1,8-dihydroxyanthraquinon (nhóm nhuận
tẩy) cho màu đỏ trong dung dịch kiềm, dưới UV cho huỳnh quang tím hoặc đỏ nâu.
Dẫn chất oxyanthraquinon (có 1 nhóm OH vị trí α) cho màu với
Mg(CH3COO)2/EtOH (ví dụ 1,2-dihydroxy cho màu tím; 1,4-dihydroxy cho
màu tía; 1,6 và 1,8-dihydroxy cho màu đỏ cam).
○ Sắc ký lớp mỏng (SKLM):
■ Chuẩn bị dịch chiết: Chiết bằng MeOH (dạng tự do và glycosid) hoặc thủy
phân bằng acid (H2SO4 25%), chiết bằng CHCl3 (dạng oxy hóa).
■ Hệ dung môi khai triển: EtOAc : MeOH : H2O (100:13.5:10). ■
Thuốc thử: Hơi NH4OH; KOH/EtOH; Pyridin : MeOH. ● Định lượng:
○ Phương pháp cân:
■ Nguyên tắc: Chiết kiệt anthranoid trong dược liệu, bốc hơi dung môi, sấy khô, đem cân.
○ Phương pháp so màu (Auterhoff):
■ Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng màu Borntraeger. Đường cong chuẩn xây
dựng với istizin (1,8-dihydroanthraquinon) hay acid chrysophanic, dung dịch cobalt chlorid.
○ Phương pháp thể tích (Tschirch-Schmitz):
■ Nguyên tắc: Dùng KOH 0.1N tác dụng với dẫn chất anthraquinon sau đó
chuẩn độ kiềm dư bằng HCl 0.1N. Chuyển màu từ đỏ sang vàng. ○ HPLC. 4. Flavonoid ● Định tính:
○ Phản ứng với kiềm: Dung dịch chiết dược liệu (trong ethanol) khi thêm dung dịch
kiềm loãng (NaOH, KOH, Na2CO3) có thể thay đổi màu sắc. Flavon, flavonol cho
màu vàng hay tủa vàng. Flavanon chuyển từ vàng đậm sang đỏ khi đun nóng.
Chalcon, auron từ vàng cam sang đỏ - tía. Trên giấy lọc, sắc đồ, dùng hơi NH3, flavonoid sẽ tăng màu.
○ Phản ứng tạo phức với ion kim loại (ví dụ FeCl3, AlCl3):
■ FeCl3: Dịch thử chứa flavonoid cho kết tủa màu xanh lá, xanh đen hoặc nâu
với dung dịch sắt III chlorid (đặc biệt với các hợp chất vòng B có 2 nhóm OH ở vị trí ortho).
■ AlCl3/ROH: Dùng để khảo sát cấu trúc flavonoid bằng quang phổ UV, dựa vào
Δλmax để xác định số lượng và vị trí nhóm -OH.
○ Phản ứng Cyanidin (Shinoda): Phản ứng khử nhóm C=O bằng H2 mới sinh. Dương
tính với flavon, flavonol, flavanon. Dịch thử chuyển sang màu hồng hoặc đỏ sau khi
thêm bột magie và HCl đậm đặc. Đun nóng phản ứng nhanh hơn.
○ Phản ứng với thuốc thử Diazo: Các 7-hydroxy flavonoid tạo azoic màu vàng cam đến
đỏ với muối diazoni. Dương tính với flavon, flavonol, flavanon và flavanonol.
Dịch chiết đã kiềm hóa + TT diazo mới pha → màu hồng → đỏ cam. 18 lOMoAR cPSD| 47205411 ■
○ Quang phổ tử ngoại (UV): Chủ yếu dùng để dự đoán cấu trúc của các hợp chất tinh
khiết. Thường có đỉnh hấp thụ cực đại thuộc 2 vùng bước sóng: 300-560 nm và 240285 nm.
○ Sắc ký lớp mỏng (SKLM):
■ Chất hấp phụ: Silicagel G.
■ Hệ dung môi khai triển: Toluen - Ethyl acetat - Acid formic (5:4:1) hoặc
Ethyl acetat-Methanol-Nước (100:17:13).
Dịch chấm sắc ký: Dịch chiết dược liệu (đã loại tạp).
■ Dung dịch đối chiếu: Chất chuẩn/dung dịch chiết dược liệu (mẫu chuẩn).
■ Quan sát vết: Hơi NH3, Dd AlCl3 3%/cồn tuyệt đối, quan sát vết ở ánh sáng
thường hay dưới đèn UV, thuốc thử NP. ● Định lượng:
○ Phương pháp cân: Áp dụng với dược liệu giàu flavonoid, ít tạp chất. Nhược điểm: Sai số cao.
○ Phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis: Dựa trên phản ứng với dung dịch AlCl3.
Tiến hành đơn giản, không đòi hỏi thiết bị và dung môi đắt tiền, cho kết quả nhanh.
○ HPLC: Tính chọn lọc, đặc hiệu cao hơn. Đòi hỏi hệ thống thiết bị, dung môi, chất chuẩn đắt tiền. 5. Saponin ● Định tính:
○ Tính tạo bọt: Quan sát hiện tượng tạo bọt và xác định chỉ số bọt (CSB) - số ml nước
để hòa tan saponin trong 1g nguyên liệu cho một cột bọt cao 1cm sau khi lắc và đọc.
○ Tính phá huyết: Quan sát hiện tượng phá huyết và xác định chỉ số phá huyết (CSPH) -
số ml dung dịch đệm cần thiết để hòa tan saponin có trong 1g nguyên liệu gây phá
huyết đầu tiên và hoàn toàn đối với một loại máu đã chọn.
○ Độ độc với cá: Xác định chỉ số CSC.
○ Khả năng tạo phức với cholesterol: Saponin steroid tạo phức mạnh hơn saponin triterpenoid. ○ Phản ứng màu:
■ Sallkowski (Acid sulfuric đặc): cho màu từ vàng - tím.
■ Rosenthaler (Vanilin 1%/HCl): cho màu tím hoa cà (đặc trưng cho saponin triterpenoid).
■ Phản ứng với các aldehyd thơm (anisaldehyd, vanillin)/acid mạnh (acid
sulphuric, acid phosphoric, acid perchloric): sản phẩm có màu ở ánh sáng thường và UV.
○ Sắc ký lớp mỏng (SKLM): Dùng để định tính saponin. ● Định lượng:
○ Phương pháp cân:
■ Nguyên tắc: Chiết saponin từ dược liệu (đã loại chất béo) bằng MeOH:H2O,
cô cất thu hồi MeOH, lắc với n-BuOH, kết tủa bằng aceton/ether và cân tủa saponin.
■ Điều kiện áp dụng: Saponin chiếm tỷ lệ lớn, chưa xác định chất cụ thể.
○ Phương pháp quang phổ hấp thụ (đo quang):
■ Nguyên tắc: Tạo dung dịch trong suốt, có màu ổn định. 19 lOMoAR cPSD| 47205411 ■
■ Ưu điểm: Chính xác.
■ Nhược điểm: Saponin ít nối đôi, độ hấp thụ ở vùng sóng ngắn, cần tìm được phản ứng màu. ○ HPLC:
■ Nguyên tắc: Biết rõ chất cần phân tích.
■ Ưu điểm: Chính xác, độ nhạy cao.
■ Nhược điểm: Không đánh giá được toàn phần. 6. Tinh dầu 20