lOMoARcPSD| 36067889
BÀI 3 CÁC ENZYME THÔNG DỤNG TRONG KĨ THUẬT DI TRUYỀN
1. Các enzyme giới hạn (RE) 1.1
Hiện tượng giải hạn (Restriction)
Các thực khuẩn thể (phage) xâm nhiễm tế bào vi khuẩn và nhân
lên nhờ bộ máy sinh tổng hợp của vi khuẩn. Khi số lượng phage tăng
lên đến hàng triệu bản sao, chúng sẽ phá vỡ tế bảo vi khuẩn. Nhưng
trong amột số trường hợp, tế bào vi khuẩn vẫn nguyên vẹn mà phage
cũng không nhân lên. Hiện tượng này có thể do một trong hai nguyên
nhân (1) DNA phage gần xen vào bộ gen của vi khuẩn dưới dạng
không hoạt động trong một thời gian dài hay ngắn, (2) DNA phage bị
một hệ thống bảo vệ của vi khuẩn tiêu diệt khi vừa mới xâm nhập, hệ
thống bảo vệ này là các RE; đây chính là hiện tượng giới hạn. Khi
nghiên cứu DNA phage bằng phương pháp Southem, người ta thấy
rằng DNA phage trích từ vi khuẩn bị phá vỡ có kích thước nguyên vẹn
trong khi DNA phage trích từ vi khuẩn không bị phá vỡ lại bị cắt thành
những đoạn nhỏ hơn có kích thước xác định.
Từ “giới hạn" có nguồn gốc từ một quan sát thực nghiệm: nhiều
loài vi khuẩn luôn luôn bị phá hủy khi bị xâm nhiễm bởi một loại
phage nhất định. Một số chủng của các loài này lại có khả năng tự bảo
vệ nhờ hiện tượng giới hạn nói trên. “Giới hạn” được ngầm hiểu là giới
hạn trong sự xâm nhiễm.
Tuy vậy, ngay trên những chủng kháng phage, vẫn có một ít vi
khuẩn bị phân hủy. Các phage do số ít vi khuẩn này phóng thích có khả
năng phân hủy chủng vi khuẩn trước kia còn kháng phage.
Tất cả những hiện tượng nêu trên là kết quả của một hệ thống gồm hai loại enzyme:
+Các RE cắt DNA phage ở những vị trí chuyên biệt, luôn luôn
tạo thành những trình tự có kích thước xác định.
-Methylase là enzyme chịu trách nhiệm gắn nhóm methyl vào A
hay C ở vị trí cắt của các RE. Khi A hay C được methyl hóa, RE không lOMoARcPSD| 36067889
còn nhận biết được vị trí cắt. DNA vi khuẩn không bị chính các RE của
chúng cắt là nhờ cơ chế này.
Như vậy, trường hợp một số ít vi khuẩn của chủng kháng phage
lại trở thành nhạy cảm với phage sau một thời gian là do DNA phage
trong một lần xâm nhiễm đã được methyl hóa trước khi các RE kịp
nhận biết nên không bị cắt và giữ được nguyên vẹn cấu trúc và chức
năng. Kể từ đó, DNA methyl hóa này có thể phá vỡ các vi khuẩn trước kia không phage.
Các RE hợp thành hệ thống bảo vệ ở tế bào procaryote. Chưa có
hệ thống nào tương đương được phát hiện ở eucaryote. 1.2. Tên gọi các RE
Tên gọi thống nhất cho các RE được quy định như sau:
- Chủ đầu viết hoa là chữ đầu tên giống vi khuẩn từ đó RE được li trích.
- Hai chữ kể tiếp không viết hoa tương ứng với loài của vi khuẩn nói trên.
- Tiếp theo là một chữ số la mã chỉ thứ tự RE được phát hiện
(trong trường hợp nhiều RE cũng được tìm thấy ở một loài vi khuẩn).
Đôi khi còn có thêm một chữ viết hoa để chỉ chúng vi khuẩn sử dụng. Ví dụ: Giống Loài Chủng Escherichia coli Ry13
EcoRI : enzyme đầu tiên được tìm thấy ở E. coli
EcoRV - enzyme thứ năm được tìm thấy ở E. coli
1.3. Các loại enzyme giới hạn
Enzyme giới hạn là các endonuclease có khả năng thủy giải DNA
mạch đội một cách lặp lại ở những vị trí (trình tự) xác định.
Do đặc tính cơ bản của các RE là khả năng nhận biết và cắt một
trình tự xác định trên phân tử DNA nên dựa vào khả năng này, người ta chia chúng làm ba loại: lOMoARcPSD| 36067889 -
Loại I: Khi enzyme nhận biết được trình tự, nó sẽ di chuyển trên
phân tử DNA đến cách đó khoảng 1000-5000 nucleotide và giải
phóng độ vài chục nucleotide. -
Loại II: Enzyme nhận biết trình tự và cắt ngay vị trí đó. - Loại
III: Enzyme nhận biết một trình tự và cắt DNA ở vị trí cách đó khoảng 20 nucleotide.
Kể từ đây, chúng ta chỉ quan tâm đến các RE loại II vì đó là nhóm
duy nhất được sử dụng trong các thao tác sinh học phân tử. 1.4 Các RE loại II
1.4.1. Trình tự nhận biết
Mỗi RE nhận biết một trình tự nucleotide đặc trưng. Các trình tự này
thường bao gồm 4-8 nucleotide (thường là 4 hay 6). Các RE khác nhau có
cùng một trình tự nhận biết được gọi là các isoschizomers. Đối với một số
RE, trình tự nhận biết không có tính chuyên biệt tuyệt đối - một số nucleotide
của trình tự có thể được thay thế bởi nucleotide khác. Ví dụ: A T Nspl GGGCCC T A Bgl GCCNNNNNGGC
Vị trí nucleotide thứ tư đối với Nspl có thể là A, C hay T.
N chỉ vị trí có thể nhận bất kì loại nào trong bốn loại nucleotide.
Đặc trưng quan trọng nhất của các trình tự nhận biết là chúng có cấu
trúc palindromic, nghĩa là hai mạch của trình tự hoàn toàn giống nhau khi
chúng được đọc theo chiều 5'→3'.
Như vậy, vị trí cất là giống nhau trên hai mạch.
EcoRI 5'G AATT C3' 3'C TTAA G5'
(Dấu mũi tên thắng đứng chỉ vị trí cắt) lOMoARcPSD| 36067889
1.4.2. Các kiểu cắt của các RE loại II -
Cắt tạo đầu bằng (blunt ends): Một số RE cắt hai mạch DNA tại cùng
một điểm. Sau khi cắt, hai đầu bằng sẽ không có khả năng tự kết hợp trở lại.
Để nối chúng lại phải dùng enzyme T4 ligase. Haelli 5'GG CC3' 3'CC GG5' 5'GG + CC3' 3'CC GG5’ -
Cắt tạo đầu so le hay đầu dính (cohesive ends): Ở một số RE, vị trí cắt
lệch nhau trên hai mạch. Trong trường hợp này, các đầu dính bổ sung có thể
bắt cặp trở lại. Đặc tính này được sử dụng rất nhiều trong tái tổ hợp di truyền
in vitro, hai phân tử DNA có nguồn gốc khác nhau nhưng cùng được cắt bởi
một RE có khả năng kết hợp thành một thông qua các đầu dính. EcoRI 5'G AATT C3’ 3'C TTAA G5’ 5'G + AATTC3' З'СТТАА G5'
1.4.3. Một số quy tắc cần chú ý khi thiết lập một phản ứng thủy giải bởi RE. -
Mỗi RE hoạt động tối ưu trong những điều kiện phản ứng xác định nhất
là về mặt dung dịch đệm. Tốt nhất ta nên tuân thủ đúng các khuyến cáo của
hãng sản xuất. Các dung dịch đệm dùng cho phản ứng RE thường cơ bản
khác nhau ở nồng độ NaCl. Do đó, khi trong một phản ứng cần sử dụng nhiều
RE: (1) Nếu chúng hoạt động tốt trong cùng một dung dịch đệm thì có thể
được sử dụng đồng thời; (2) nếu yêu cầu về dung dịch đệm khác nhau thì
DNA phải được cắt bởi RE hoạt động trong dung dịch đệm có nồng độ NaCl
thấp trước, sau đó thêm NaCl để đạt nồng độ cao hơn cần cho RE kia hoạt
động và tiếp tục phản ứng thủy giải. lOMoARcPSD| 36067889 -
RE sẽ giữ được hoạt tính trong một dung dịch đệm chứa 50% glycerol
nếu luôn luôn được bảo quản ở -20°C. Khi tiến hành phản ứng thủy giải, chỉ
lấy RE ra vào phút chót sau khi đã cho đủ các thành phần khác và giữ trong
đá trong thời gian càng ngắn càng tốt trước khi cất trở lại vào -20C. -
Nên tiến hành phản ứng trong một thể tích càng nhỏ càng tốt để tạo
thuận lợi cho sự tiếp xúc enzyme-cơ chất. Tuy nhiên, phải đảm bảo thể tích
RE không vượt quá 1/10 thể tích phản ứng vì glycerol ức chế hoạt động enzyme. 1.4.4. Ứng dụng
Việc sử dụng các RE có ý nghĩa quyết định trong sự phát triển của sinh
học phân tử eucaryote. Chúng cho phép cắt nhỏ bộ gen khổng lồ của các sinh
vật eucaryote. Các RE chủ yếu được sử dụng trong phương pháp tạo dòng với
mục đích thu nhận một trình tự xác định với số lượng lớn. Ngoài ra, chúng
còn được dùng vào việc lập bản đồ giới hạn (restriction map), vào việc phân
tích so sánh bộ gen ở các loài khác nhau thông qua kĩ thuật RFLP (Restriction
Fragments Length Polymorphism - tính đa hình kích thước của các trình tự giới hạn).
2. Các enzyme thông dụng khác
2.1. Các polymerase Gồm hai nhóm: -
Các DNA polymerase xúc tác sự tổng hợp DNA, theo chiều 5'-3'. Phần
lớn các DNA polymerase dùng một bản mẫu là DNA để làm khuôn cho sự
tổng hợp (DNA polmerase I, T4 DNA polymerase, Taq polymerase). Một
DNA polymerase đặc biệt là enzyme phiên mã ngược (Revere Transcriptase)
lại sử dụng khuôn là RNA để tổng hợp DNA. Sau chót phải kể đến một DNA
polymerase không tổng hợp mạch mới từ khuôn mã chỉ thêm các nucleotide
vào đầu của một phần từ DNA có sẵn, đó là Terminal transferase. Các DNA
polymerase, để hoạt động, cần một mồi (primer). Mồi là một đoạn DNA hay
RNA ngắn bắt cặp bổ sung với phần đầu của khuôn, để từ đó các polymerase
mới nối dài tạo mạch bổ sung. -
Các RNA polymerase tham gia tổng hợp RNA, thông dụng nhất là SP6, T7 và ng RNA polymerase. lOMoARcPSD| 36067889
2.1.1. DNA polymerase I (DNA pol 1)
Trong tự nhiên, DNA pol I có vai trò chủ yếu trong cơ chế sửa sai khi sao chép ở vi khuẩn.
Ngoài hoạt tính polymerase (tổng hợp) theo chiều 5'-3', DNA pol I còn có
hoạt tính exonuclease (thủy giải dần liên kết giữa các nucleotide từ đầu phân
tử DNA) theo chiều 5’-3’ và 3’-5’.
Các ứng dụng chủ yếu của enzyme này là:
- Xác định trình tự DNA bằng phương pháp các dideoxynucleotide.
-Tổng hợp mẫu dò có độ phóng xạ cao.
- Xây dựng các vector từ DNA mạch đơn.
Trong thực tế, người ta ít sử dụng DNA pol I mà sử dụng một sản phẩm hình
thành từ sự thủy phân nhẹ của enzyme này: đoạn Klenow (Klenow
fragment). Đoạn Klenow của DNA pol I giữ được hoạt tinh polymerase và
exonuclease 3'-5', đồng thời mất đi hoạt tính exonuclease S-3' không mong muốn.
2.1.2. T4 DNA polymerase
Enzyme này có nguồn gốc từ phage T4 xâm nhiễm vi khuẩn. Hoạt tính
giống hệt như hoạt tính của đoạn Klenow nhưng do hoạt tính exonuclease
3'-5' mạnh hơn nên được sử dụng nhiều hơn khi cần tổng hợp mẫu dò có độ phóng xạ cao. 2.1.3. Taq polymerase
Taq polymerase (thường được viết tắt là “Taq pol” hoặc “Taq”) là một
DNA polymerase bền nhiệt được sử dụng trong PCR, ban đầu được phân lập
từ Thermus aquaticus, một loài vi khuẩn ưa nhiệt được tìm thấy trong suối và
miệng giếng nước nóng. PCR tận dụng khả năng chịu nhiệt độ cao của Taq
được yêu cầu trong bước biến tính để tách hai sợi DNA. Với một nhiệt độ
hoạt động tối ưu là 75-80°C, Taq polymerase có thể được tái sử dụng qua một
vài chu kỳ PCR mà không bị biến tính bởi nhiệt. Taq polymerase cũng thể
hiện khả năng cao trong việc sao chép với 1kb DNA trong vòng 30-60 giây
trong PCR. Taq DNA polymerases cũng thể hiện đặc tính exonuclease chiều
5'-3' cho phép cắt các nucleotide từ đầu 5' của sợi DNA trong phản ứng dịch
mã qua khe (Nick translation). Hoạt động này là quan trọng vì nó sẽ tách các lOMoARcPSD| 36067889
đầu dò oligo đã được đánh dấu từ dầu 5' của DNA để tạo các tín hiệu có thể
xác định được trong ứng dụng real-time PCR.
Một trong những nhược điểm chính của Taq là mất khả năng đọc sửa vì
thiếu hoạt tính exonuclease 3’-5', bởi vậy dẫn đến độ chính xác nhân bản thấp
(1 lỗi trong 9000 cặp bazo). Đối với PCR thường quy với các đoạn nhân bản
ngắn, hay các ứng dụng trong đó kết hợp các nucleotide không chuẩn như
deoxyuridine hay inosine là cần thiết, khả năng xử lý cao và độ chính xác
thấp của Taq mang đến nhiều thuận lợi hơn. Thiếu hoạt động đọc sửa 3’-5’
cũng dẫn đến thừa một adenine ở đầu 3' của mỗi sợi, tạo đoạn DNA với đầu
dính. Một sử dụng tiềm năng của các sản phẩm này là trong nhân dòng, ở đó
chúng có thể được nối trực tiếp vào một vector plasmid chứa đầu thymine ở 3'.
2.1.4. Enzyme phiên mã ngược (Reverse transcriptase)
Cùng với các enzyme giới hạn, enzyme phiên mã ngược có vai trò quyết
định trong quá trình hình thành ngành sinh học phân tử encaryote. Enzyme
này do các retrovirus sản sinh nhằm sao chép bộ gen RNA của chúng trong tế
bào kí chủ. Hiện nay, với các sản phẩm thương mại về sinh học phân tử,
enzyme phiên mã ngược có nguồn gốc từ AMV (Avian Myeloblastosis Virus)
và thông dụng hơn là từ MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus).
Enzyme phiên mã ngược, như tên gọi của nó, tổng hợp nên một mạch DNA
bổ sung (cDNA - complementary DNA) từ khuôn RNA theo chiều 5'-3', khi có mặt của mồi.
Các ứng dụng chủ yếu là:
- Thiết lập ngân hàng cDNA.
- Tiến hành phản ứng PCR trên mRNA
- Xác định trình tự của nucleic acid bằng phương pháp sử dụng các dideoxynucleotide.
2.1.5. Terminal transferase
Enzyme này được là trích từ tuyến ức của bê.
Terminal transferase xúc tác phản ứng gắn các deoxynucleotide
vào đầu 3'OH tự do của phân tử DNA. Sự gắn này mang tính ngẫu nhiên nên
thành phần nucleotide của chuỗi polynucleotide mới hình thành hoàn toàn
phụ thuộc nồng độ của 4 loại nucleotide có trong phản ứng. lOMoARcPSD| 36067889
Enzyme này được sử dùng khi cần: -
Thêm đuôi polynucleotide (tailing) để tạo đầu so le (xem phần enzyme
giới hạn) cho phân tử DNA, dùng trong tạo dòng. -
Đánh dấu đầu 3'OH của các DNA trong phương pháp xác định trình tự
nucleic acid theo Maxam và Gilbert
2.1.6. Các RNA polymerase
Ba loại RNA polymerase được sử dụng nhiều nhất trong sinh học phân
tử là SP6 RNA polymerase có nguồn gốc từ phage xâm nhiễm Salmonella
typhimurium, T3 và 17 RNA polymerase có nguồn gốc từ phage xâm nhiễm Escherichia coli.
Các enzyme này xúc tác sự tổng hợp RNA từ một mạch của một phân
tử DNA mạch đôi theo chiều 5'-3'. Quá trình tổng hợp không cần mồi nhưng
khuôn DNA phải có mang một promoter đặc trưng của phage. Người ta
thường dùng các enzyme này để tạo một lượng lớn RNA từ một trình tự DNA
được nối ngay sau promoter thích hợp.
Chúng thường được sử dụng để:
-Tổng hợp mẫu dò RNA đánh dấu phóng xạ hay hóa học. -
Xác định trình tự của một DNA được dòng hóa trong một vector có
mang các promoter đặc trưng cho phage SP6, T3, 17.
- Nghiên cứu bản phiên mã RNA của một DNA đã được dòng hóa. Trong
trường hợp này, các RNA polymerase có giá trị cao vì RNA là những phân tử
kém bền vững, rất khó thu nhận được dưới dạng tinh khiết với hàm lượng cao
bằng các kĩ thuật cổ điển. Nhờ các RNA polymerase, người ta có thể tổng hợp
một số lượng RNA lớn từ một DNA được dòng hóa, dùng trong các nghiên
cứu về cấu trúc, điều hỏa, và các mối tương tác của RNA. 2.2. Các ligase
Đây là các enzyme xúc tác sự hình thành liên kết nối hai đoạn DNA
(DNA ligase) hay RNA (RNA ligase). Trong kĩ thuật tạo dòng (lĩnh vực ứng
dụng quan trọng nhất của các ligase), chúng thường được sử dụng kết hợp với
hai enzyme khác là T4 polynucleotide kinase và Alkaline phosphatase, nên
hai enzyme này sẽ được đề cập ngay sau các ligase. lOMoARcPSD| 36067889
2.2.1. E. coli DNA ligase
Enzyme được li trích từ E. coli và xúc tác phản ứng nối hai trình tự DNA có đầu so le. 5' ACGG + TAATCGCCA 3' 3' TGCCATTA GCGGT 5’ E. coli DNA ligase 5' ACGGTAATCGCCA 3' 3' TGCCATTAGCGGT 5' 2.2.2. T4 DNA ligase
Có nguồn gốc từ phage T4 xâm nhiễm E. coli. Enzyme này có cùng
chức năng với ligase trích từ E. coli nhưng đặc biệt còn có khả năng nối hai
trình tự DNA đầu bằng nên là ligase được được sử dụng nhất trong kĩ thuật tạo dòng. 2.2.3. T4 RNA ligase
Enzyme được li trích từ phage T4 xâm nhiễm E. coli, xúc tác sự nối hai
trình tự RNA bằng liên kết phosphodiester.
Do cơ chất thích hợp nhất cho enzyme là các phân tử nhỏ (ví dụ như một
polynucleotide) nên T4 RNA ligase thường được sử dụng để đánh dấu phóng
xạ đầu 3' của các phân tử RNA dùng làm mẫu dò phân tử (probe).
2.2.4. T4 Polynucleotide kinase
Có nguồn gốc từ phage T4 xâm nhiễm E. coli. Enzyme này xúc tác sự
móhn nểyuhcلا-phosphate của ATP cho đầu 5' của DNA hay RNA. Tùy điều
móhN )1( :gnứ nảhp uểik iah ar yảx ểht óc mệihgn cựht nệikلا-phosphate
được chuyển đến đầu 5' của một DNA đã mất nhóm phosphate; (2) khi có
một lượng thừa ADP, phản ứng mang tính thuận nghịch, DNA chuyển nhóm
móhn nậhn àv PDA ohc etahpsohpلا-phosphate (thường có đánh dấu phóng -
23[ ửt nâhp tộm ừt )ạxلاP]ATP. Enzyme còn có hoạt tính phosphatase.
Các ứng dụng chính của enzyme này là: -
Đánh dấu phóng xạ đầu 5' của DNA trong các kĩ thuật xác định trình tự
DNA theo phương pháp Maxam và Gilbert, dùng làm mẫu do phân tử trong các kĩ thuật lại, ... -
Phosphoryl hóa các trình tự DNA không có nhóm phosphate đầu 5' để
chuẩn b phản ứng nổi (ligation) trong phương pháp tạo dòng. lOMoARcPSD| 36067889
2.2.5. Alkaline phosphatase
Được lí trích từ E. coli hay từ ruột bé, enzyme xúc tác sự loại bỏ nhóm 5'
phosphate của DNA, RNA và các nucleotide tự do. Enzyme được dùng để: -
Loại nhóm 5' phosphate của DNA hay RNA trước khi đánh dấu phóng
xạ đầu 5' của chúng bằng 32P (xem T4 polynucleotide kinase). -
Loại nhóm 5' phosphate trên các trình tự DNA. Trong kĩ thuật tạo dòng,
khi một vector được "mở ra" bằng một RE rồi được loại nhóm 5' phosphate
thì nó không thể tự nối lại. Chỉ khi có một DNA lạ có mang các đầu
5’phosphate cần thiết được đưa vào thì phản ứng nối mới xảy ra giữa vector và DNA lạ.
T4 polinucleotide kinase và alkaline phosphatase thường được sử dụng
đồng thời trên vector và đoạn DNA cần gắn xen trong kĩ thuật tạo dòng. 3.Các nuclease
Đây là nhóm các enzyme phân cắt DNA (DNase) và RNA (RNase). Các
RE mà chúng ta đã xem ở phần trên cũng là những nuclease nhưng mang tính
chuyên biệt trình tự cao hơn. Các nuclease chính bao gồm các enzyme sau: 3.1. DNase I
Enzyme có nguồn gốc từ tụy tạng bò và xúc tác phản ứng thủy giải liên
kết nằm ngay sau một pyrimidine trên chuỗi DNA mạch đơn hay mạch đôi.
Trong trường hợp của DNA mạch đôi, chỗ cắt có thể xảy ra trên một hay trên cả hai mạch.
Các ứng dụng chính của enzyme này là: -
Loại DNA tạp nhiễm trong các phân đoạn RNA hay protein. -
Tạo các "chỗ đứt" (nick) trên DNA trong kĩ thuật đánh dấu mẫu dò kiểu Nick translation. -
Phát hiện các gen hoạt động trên nhiễm sắc thể. DNase ở nồng độ
thấp có khả năng phân hủy các gen đang hay đã từng hoạt động, đặc biệt là
các vị trí siêu nhạy cảm nằm trong các phần được phiên mã mạnh nhất của nhiễm sắc thể. lOMoARcPSD| 36067889 3.2. Nuclease SI
Enzyme được li trích từ Aspergillus oryzae, có khả năng phân hủy các
DNA mạch đơn. DNA mạch đôi, phân tử lai DNA:RNA không bị enzyme
phân cắt, trừ những đoạn mạch đơn trên các phân tử này.
Do đó, enzyme thưởng được sử dụng để:
- Phân tích cấu trúc của các phân tử lai DNARNA.
- Loại bỏ các phần mạch đơn của một đầu so le trên phân tử DNA (sau khi
được cắt bởi một RE tạo đầu so le) để tạo đầu bằng.
- Loại bỏ các cấu trúc bậc hai (các nút vòng) trên phân tử RNA trong quá
trình phiên mã ngược tạo cDNA.
Một enzyme có hoạt tính tương tự là Mung bean nuclease (được trích từ mầm đậu). 3.3. Exonuclease III
Enzyme được tách chiết từ E. coli, xúc tác phản ứng thủy giải tuần tự các
nucleotide từ đầu 3'OH tự do của một DNA, theo chiều 3'->5'. Kết quả là hình
thành nên một vùng mạch đơn dài trên một DNA mạch đôi. Enzyme còn có
các hoạt tính 3’phosphatase, RNase H.
Các ứng dụng chủ yếu của exonuclease III là: -
Tạo các cấu trúc mạch đơn ở một số vùng trên phân tử DNA dùng
làmcơ chất cho đoạn Klenow của DNA polymerase I (để sản xuất mẫu dò đặc trưng cho từng mạch). -
Tạo ra những đột biến "mất đoạn" tại những vùng đặc biệt trên DNA
khi phối hợp với nuclease S1.
Một exonuclease có hoạt tính tương tự là nuclease BAL31,có hoạt tính
exonuclease 5’–3' và 3’–5', có khả năng tạo các DNA mạch đôi đầu bằng
không cần sự hiện diện của nuclease S1. 3.4. RNase A
Đây là một enzyme có hoạt tính rất cao, hiện diện ở mọi nơi và cực kì
bền vững (không mất hoạt tính khi bị xử lí ở 90 độ C trong một giờ). Enzyme
thương mại hóa được li trích từ tụy bỏ.
RNase A cắt một cách đặc trưng liên kết phosphodiester nằm ngay sau
một pyrimidine của một RNA mạch đơn. lOMoARcPSD| 36067889
Enzyme này thường được dùng để:
- Loại bỏ RNA trong các chế phẩm DNA hay protein -
Loại bỏ các vùng không bắt cặp trên RNA trong phân tử lai RNA:DNA. 3.5. RNase H
Enzyme này có khả năng loại bỏ RNA trong một phân tử lai RNA:DNA
và thưởng được dùng để loại bỏ RNA sau phản ứng phiên mã ngược để tiếp
tục tổng hợp mạch thứ hai của cDNA hình thành một DNA mạch đôi.
Ngoài ra, người ta còn sử dụng một số RNase khác vào những phản ứng đặc
trưng như: RNase III và VI cắt RNA mạch đôi RNase T1 cắt ngay sau G,
RNase U2 đặc trưng cho A, Rnase T2 đặc trưng cho AGCU, ... Tóm tắt
Các enzyme giới hạn (RE) có nguồn gốc từ vi khuẩn, có khả năng thủy
giải DNA ở những vị trí xác định, gọi là trình tự nhận biết. Các RE được
phân thành ba nhóm nhưng chỉ có nhóm II là được sử dụng trong các thí
nghiệm sinh học phân tử. Đó là những muclease có tính chuyên biệt trình tự
rất cao. Các RE được ứng dụng chủ yếu trong phương pháp tạo dòng.
Các enzyme biến đổi được phân thành nhiều nhóm lớn: - Các
polymerase: xúc tác phản ứng tổng hợp DNA (các DNA polymerase) và RNA
(các RNA polymerase), được sử dụng khi cần tạo một số lượng lớn bản sao
của nucleic acid (tạo mẫu dò, xác định trình tự nucleotide,...)
-Các ligase: xúc tác phản ứng nối hai đầu của hai trình tự DNA (các
DNA ligase) hay RNA (các RNA ligase), thường dùng trong tạo dòng -Cac
nuclease: phân cắt DNA (DNase) hay RNA (RNase) một cách không chuyên biệt.