Bài giảng đại cương sắc ký khí | Đại học Y Dược Huế

lOMoAR cPSD| 45148588
ĐẠI CƯƠNG SẮC KÍ
Cơ sở lí thuyết của săc ki
Chiết ngược dòng gián đoạn
Phương pháp sắc kí phân bố là
Chiết ngược dòng với hàng loạt chất chiết gián đoạn
Ưu điểm của chiết ngược dòng
Chiết được cùng lúc nhiều chất với độ tinh khiết và hiệu suất cao
Phương pháp chuyển pha
Mục đích của chiết ngược dòng
Chiết với chelator kim loại
Sử dụng sự tạp phức của kim loại với chất phối trí hữu cơ
Chiết với cặp ion
Một số base hữu cơ có thể tạo cặp ion với các hợp chất sulfonic trong pha
nước và cặp ion này có thể chiết đuọc pha hữu cơ
Tách hỗn hợp không đồng nhất Lọc
Tách hỗn hợp đồng nhất Chuyển pha
Thứ tự của các dung môi với sức rửa giải tăng dần
Ether ethylic < clorophom < butanol < ethyl acetat Rửa giải gradient
Thành phần pha động hoặc nhiệt độ thay đổi Rửa giải isocratic
Tốc độ, thành phần pha động không đổi
Trong phương trình Van Deemter, tốc độ dòng tỉ lệ thuận, tỉ lệ nghịch với?
Hiệu lực cột được đánh giá dựa vào
Số đĩa và chiều cao đĩa lí thuyết
Nguyên nhân chính dẫn đến pic sắc kí bất đối và bị mở rông
Hiệu lực cột GIẢM khi Tốc độ dòng LỚN Kích thước hạt TĂNG
Thứ tự quá trình sắc kí
Bơm mẫu, khai triển, phát hiện Thởi gian lưu
Sắc kí pha liên kết thuộc cơ chế??? Phân bố???
Cơ chế phân bố của sắc kí
Dựa vào sự phân bô khác nhau của chất tan trong hai chất lỏng không hỗn hoà
Cơ chế trao dổi ion của sắc kí
Cơ chế hấp phụ trong phương pháp sắc kí bao gồm
Sự hấp phụ và giải hấp phụ của chất ohaan tích và pha động diễn ra liên tục trên bề mặt pha tĩnh Hệ số chọn lọc lOMoAR cPSD| 45148588
Tốc độ di chuyển tỉ đối của 2 chất Anpha= lOMoAR cPSD| 45148588
Ưu điểm của hệ thông bơm mẫu trực tiếp
Hạn chế đc THỂ TÍCH NGOÀI CỘT
Ưu điểm của hệ thống bơm nhị phân Tiết kiêm dung môi
Chạy đc chương trình gradient uyển chuyển và đa dạng
Có thể lấy đồng thời 2 dung môi
Ưu điểm của phương pháp dùng van bơm
Làm việc dưới áp suất cao mà không bị gián đoạn dòng chảy
Thể tích mẫu đưa vào hằng định Sắc kí pha đảo Pha tĩnh ít phân cực Sắc kí pha thuận Pha tĩnh phân cực, Cấu hình máy HPLC
HPLC dùng máy bơm cao áp có áp suất 300atm
Bản mỉng hiệu năng cao có Silicagel là
Chất hấp phụ thường dung nhất tron sắc kí lớp mỏng Kiesekguhur là Chấtp hấp phụ yếu Silicagel HF254 la
Pha tĩnh có chất kết dính và thêm chỉ thị huỳnh quang HF Ở 254nm
Sắc kí lớp mỏng là
Ưu điểm của sắc kí lớp mỏng so với sắc kí giấy Độ nhạy cao hơn
Hiệu lực bản mỏng được đánh gia bởi??? Rf
Nhiệt độ cột sắc kí khí
Phải đủ cao để giữ mẫu ở thể hơi nhưng không làm hư pha tĩnh
Cơ chế tách chủ yếu của sắc kí khí Phân bố
Nhiệm vụ pha động trong sắc kí khí
Chỉ có nhiệm vụ vận chuyển các chất qua cột (Ko gây tương tác) Cột PLOT Là cột mao quản mở
Trong đó CHẤT MANG RẮN ĐC BAO BỞI PHA TĨNH LỎNG liên kết hoá học
với mặt trong mao quản Sắc kí khí dùng để tách
Chất khí, chất lỏng có thể hoá hơi ở nhiệt độ thường hoặc sau khi gia nhiệt, sau khi tạo dẫn chất
Sắc kí khí-rắn, khí- lỏng khác nhau ở Pha tĩnh
Chương trình nhiệt của cột sắc kí khí
Nhiệt độ thay đổi theo thời gian của quá trình sắc kí lOMoAR cPSD| 45148588
Cấu tạo hệ thống sắc kí khí
Nguồn khí, buồng tiêm mẫu, lò, cột, đầu dò, ghi nhận phổ lOMoAR cPSD| 45148588 lOMoAR cPSD| 45148588
Yêu cầu của khí mang trong sắc kí khí Trơ về mặt hoá học Tinh khiết trên 99,99
Khí mang thích hợp cho đầu dò TCD??? Hydro
Trong sắc kí khí để tách hỗn hợp chất phân cực dùng pha tĩnh??? Polyethylen glycon
(polyethylen glycon được dùng phổ biến tách chất phân cực SGK/ 272)
Độ phân cực tăng dần của pha tĩnh lỏng trong sắc kí khí
Polydimethyl siloxan < poly(trìlouropropyldemethyl) siloxan < poli
(dicyanoallydimethyl) siloxan < polyethylen glycol
Trong sắc kí khí, khả năng tách các chất phụ thuộc nhiều vào
Nhiệt độ của hệ thống (pha tĩnh, khí mang, mẫu thử)
Về phương diện định lượng, phương pháp không áp dụng trong sắc
kí khí??? 260 Ngoại chuẩn
Sắc kí lỏng hiệu năng cao để định tính các chất dựa vào
Để định lượng các chất dựa vào
Định tính: thời gian lưu
Định lượng: chiều cao, diện tích pic (thời gian lưu)
Chất chuẩn nội trong sắc kí lỏng hiệu năng cao
Là một chất tinh khiết khác được pha vào mẫu thử và chuẩn ở cùng một tỉ lệ
nhằm tránh sai số do lượng mẫu bơm vào CHẤT CHUẨN NGOẠI và MẪU THỬ
Trong sắc kí khí dùng chuẩn nội để
Hạn chế sai số các thể tích bơm (chất chuẩn ngoại và mẫu thử)
Máy sắc kí khí đầu tiên 1955
Detector nhiệt ion hoá dùng trong phân tích???
Các chất có gốc nito phospho
Áp suất hoạt động tối đa của SKLHNC 5000-6000 psi 1 đợn vị psi 0,0689 bar
HPLC ưu điểm được sử dụng rộng rãi trong phòng thí nghiệm
Độ nhạy độ chính xác cao đáp ứng yêu cầu định tính và định lượng
(KHÔNG có rẻ tiền hay dễ sử dụng nha) Nhược điểm HPLC
hoạt đông dưới áp suất cao
Pha động dễ bay hơi gây hại
Để đuổi bọt khí trong dung môi SKLHNC ngoài việc dùng bộ phận khử khí còn có thể
Lọc áp suất thấp, siêu âm, sục khí heli
Trong SKLHNC trong việc định lượg người ta dùng thông số
Diẹn tích pic và chiều cao pic
Nguyên tắc đầu dò khúc xạ kế vi sai RI lOMoAR cPSD| 45148588
Đầu dò vi sai RI có ưu điểm hơn đầu dò tán xạ ánh sáng bay hơi là lOMoAR cPSD| 45148588 lOMoAR cPSD| 45148588
Có khả năng phát hiện gần như hầu hết các chất
Định lượng bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao Chuẩn ngoại Chuẩn nội, thêm chuẩn Qui về 100% diện tich pi
HPLC trong ngành dùng để Định tính Định lượng
Xác định các chất tạp liên quan cùa hợp chất hữu cơ
Bơm thường dùng trong hệ thống HPLC hiện đại Bơm cao áp
Loại cột HPLC có các hạt nhồi sắp xếp các lỗ xốp nối nhau thành ống
theo chiều dài cột, do đó rất tiện lợi về tốc độ dòng chảy và ít tốn dung môi
Chromolith Performance C18, C8 Sắc kí
Quy trình tách chất tan ra khỏi dung dịch bởi quá trình dịch chuyển khác
nhau về động lực học của các chất này trong hệ thống hai hay nhiều pha Pha động
Các chất chuyển động theo một hướng nhất định và liên tục
Là chất khí, chất lỏng, chất lỏng siêu giới hạn Pha tĩnh
Cố định trong cột hay bề mặt chất rắn Các chất tan
Là thành phần của mẫu di chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác
nhau (dựa vào sự tương tác của pha động, pha tĩnh, chất tan) nhờ đó các
thành phần của mẫu sẽ tách phân biệt thành 2 dải Quy trình sắc kí
Đưa hỗn hợp lên pha tĩnh Cho pha động qua pha tĩnh
Phát hiện các chất được tách
Phân loại sắc kí theo cách lưu trữ pha tĩnh Sắc kí cột
Sắc kí phẳng: pha tĩnh cố định trên mặt phẳng
Sắc kí lớp mỏng: pha tĩnh được tráng trên bản mỏng bằng thuỷ tinh, nhựa, nhôm
Sắc kí giấy: pha tĩnh được thấm trên giấy sắc kí
Phân loại sắc kí dựa trên bản chất vật lí của các pha Sắc kí lỏng Sắc kí khí
Sắc kí lỏng siêu giới hạn
Phân loại sắc kí theo phương cách cho pha động qua pha tĩnh Sắc kí hấp phụ lOMoAR cPSD| 45148588 Sắc kí phân bố lOMoAR cPSD| 45148588 lOMoAR cPSD| 45148588 Sắc kí trao đổi ion
Sắc kí loại trừ phân tử Sắc kí ái lực Sắc kí trao đổi ion
Là kĩ thuật tách sắc kí dựa trên LỰC HÚT TĨNH ĐIỆN giữa các phân tử CHẤT
TAN có điện tích trái dấu với các nhóm cation hay anion liên kết cộng hoá trị
với các tiểu phân của PHA TĨNH (nhưac trao đổi ion) Nhựa trao đổi ion 2 loại: cationit, anionit
Cationit: cationit acid mạnh (SO3-), cationit acid yếu (COO-)
Anionit: anionit base mạnh (amin bậc 4), anionit base yếu (amin bậc 1) Sắc kí phân bố
Các chất tan được tách riêng do sự cân bằng về sự phân bố của chất tan
giữa pha tĩnh lỏng và pha động lỏng hoặc rắn
Pha tĩnh lỏng bao quanh chất mang rắn Sắc kí hấp phụ
Chất tan được hấp phụ trên bề mặt pha tĩnh
Sự hấp phụ phụ thuộc nhiệt độ, và nồng độ
Các chất đồng phân thường được tách theo cơ chế Hấp phụ
Để 2 chất được tách hoàn toàn 2 pic phải : Cách xa nhau Gọn (hẹp và cân đối)
Sắc kí loại trừ phân tử (sắc kí rây phân tử, sắc kí lọc qua gel)
Sự tách chất tan dựa vào sự khác nhau giữa KÍCH THƯỚC PHÂN TỬ khi đi
qua lỗ trống của các gel (các phân tử có kích thước nhỏ bị giữ lại trong các lỗ
trống của gel nên di chuyển chậm hơn các phân tử có kích thước lớn???)
Trong kiểu sắc kí này KHÔNG CÓ SỰ TƯƠNG TÁC giữa chất tan và pha tĩnh
như các sắc kí thông thường
Dùng trong sinh hoá, lọc các phân tử lớn protein, carbs Sắc kí ái lực
Tách chất tan dựa vào sự tương tác của phân tử chất tan với một phân tử thứ
hai liên kết cộng hoá trị với pha tĩnh Có tính chọn lọc cao
Vd: phân tử liên kết cộng hoá trị với pha tĩnh: kháng thể protein
Hỗn hợn qua pha tĩnh: hàng ngàn protein
Chỉ giữ lại 1 protein đặc hiệu với kháng thể trên pha tĩnh
Sau đó tách protein này ra khỏi cột bằng cách thay đổi pH
Tốc độ di chuyển của một chất lOMoAR cPSD| 45148588
Thời gian lưu: thời gian đi từ nơi tiêm mẫu đến đầu dò (tính lúc tiêm đến lúc xuất hiện đỉnh pic) Tr lOMoAR cPSD| 45148588
Thời gian chiết (Tm): thời gian lưu của chấtt không bị lưu trữ (bằng tốc độ di chuyển của dung môi)
Hệ số phân bố K : tỉ lệ nồng độ chất tan trong pha tĩnh và pha động (K lớn:
chất bị pha tĩnh giữ lại nhiều -> di chuyển chậm)
K phụ thuộc bản chất các pha và bản chất chất tan, nhiệt
độ Tốc độ di chuyển tỉ đối của 2 chất Đặc trung bởi hệ số chọn lọc anpha= Kb/Ka
Để tách riêng 2 chất thì anpha >1 (chất b bị lưu giữ mạnh hơn a) Số đĩa lý thuyết
Đại lượng đánh giá quá trình ĐỘNG HỌC và NHIỆT ĐỘNG LỰC HỌC xảy ra trong cột
Nmax= 4000 L/d (L: chiều cao cột, d: đường kính hạt pha tĩnh)
Để cột có hiệu lực cao thì N phải gần bằng Nmax
H=L/N=16(Tr/w)2=5,54(Tr/w1/2)2
W: chiều rộng đáy pic w1/2:chiều rộng giữa pic
H: chiều cao đĩa lí thuyết (H phụ thuộc vận tốc pha động) Độ phân giải
Đại lượng đo mức độ tách 2 chất trên 1 cột sắc kí
Rs= 0,75 hai pic tách ko tốt, còn xen phủ nhiều
Rs= 1 hia pic tách nhau tốt, xen phủ 4%
Rs= 1,5 hai pic tách nhau hoàn toàn, xen phủ 0,03%
Để tăng độ phân giải
Tăng N: dùng cột dài hơn, hoặc giảm tốc độ pha động
Tăng k': (1-5) thay đổi pha động
Tăng anpha:thay đổi pha tĩnh, pha động, thay đổi pH Ứng dụng sắc kí
Định tính và thử độ tinh khiết Định lượng
Hệ số bất đối 1 pic đạt yêu cầu định lượng 0,8 1,2
2 pic kế nhau đạt yêu cầu định lượng 1< Rf < 1,5 HPLC lOMoAR cPSD| 45148588
Phương pháp tách hỗn hợp trên cột được nhồi bởi các hạt <10micromet Cần
bơm áp suất cao 300atm để đẩy pha động qua cột (có pha tĩnh) tốc đông dòng vài ml/phút
HPLC áp dụng với lượng mẫu nhỏ 20 ug
Áp suất hoạt động tối đa của máy 5000-6000 psi 1 psi 0,0689 bar Các bộ phận Binh dung môi Bộ phận khử khí Hệ thống bơm cao áp Tiêm mẫu Lọc tiền cột Cột sắc kí Bộ phận phát hiện
Bộ phận xử lí và ghi tín hiệu
Binh dung môi được làm bằng
Thuỷ tinh trung tính có nắp đậy Dung môi là nước
Dùng màng lọc cellulose nitrat, cellulose acetat 0,45 0,22 um
Dung môi là hh hữu cơ và nước
Màng lọc RC cellulose tái sinh, polyamid, nylon Dung môi hữu cơ Màng lọc teflon Bộ phận lọc dung môi
Kích thước khoảng 5-10 um
Ngâm acid nitric 5%, siêu âm 15 phút
Bộ phận khử khí dung môi
Loại khí ngay trong binh hoặc trên dong chảy
Màng khử khí được đặt thẳng đứng trên dong dung môi để không khí không tan trở lai dung môi
Ngoài ra còn có thể khử khí bằng: lọc dưới áp suất thấp, siêu âm, sục khí helium Hệ thống bơm
Bơm có lưu lượng hằng định : chỉ bơm thể tích nhỏ
Bơm đẳng dòng: lấy đc 1 loại dung môi, không tự trộn đc dung môi, KHÔNG
TĂNG TỐC ĐỘ DÒNG ĐỘT NGỘT
Bơm nhị phân: bơm cùng luc 2 dung môi, TIẾT KIỆM DUNG MÔI
Bơm tứ phân: bơm 4 loại dung môi, CHÚ Ý PHỐI HỢP DUNG MÔI HỢP LÍ TRÁNH KẾT TỦA Bơm có lưu lượng hằng
Một piston: điều chỉnh bằng hệ thống tâm sai, lưu lượng không đổi, ÁP SUẤT ĐỔI lOMoAR cPSD| 45148588 lOMoAR cPSD| 45148588
Hai piston: lưu lượng điều chỉnh bởi motor, lưu lựng không đổi, ÁP SUẤT KHÔNG ĐỔI
Bơm chạy đc chương trình gradient Bơm nhị phân Bơm tứ phân Nguyên tắc tiêm mẫu Không làm xáo trộn mẫu Các cách tiêm mẫu
Bơm trực tiếp bằng sỷinge: tiện lợi đơn giản (nhược: tính lặp lại ko cao, dòng chảy bị gián đoạn)
Sử dụng van bơm: hoạt động dưới áp suất cao, thể tích nhất định
Hệ thống bơm mẫu tự động Lọc tiền cột
Loại các tạp làm tắc cột Cột sắc kí
Thép không rỉ, thuỷ tinh đặc biệt ( chỉ dùng khi áp suất 60psi), nhựa polyethilen
2 loại cột: cột phân tích, cột chế hoá
Bộ phận phát hiện UV vis
Nguyên lý:Các phân tử chất hữu cơ hấp thu ánh sáng UV, độ hấp thu tỉ lệ thuận nồng độ
Nguồn ánh sáng đơn sắc
Flow cell (cốc đo dòng chảy qua): làm bằng thạch anh có 2 đầu ống hình trụ
Bộ phận đo sự thay đổi cường độ ánh sáng: DIOD QUANG, ỐNG NHÂN QUANG,
Ưu điểm của UV Vis detector Dễ sử dụng Độ nhạy cao Không phá huỷ mẫu
Nhược điểm UV Vis detector
Ko dùng đc với các chât hấp thu UV kém
Bộ phận phát hiện đa sóng PDA
Giống như UV vis detector nhưng đa kênh, mỗi kênh hấp thụ 1 bước sóng
Nguyên lí: Các phân tử chất hữu cơ hấp thu ánh sáng UV, độ hấp thu tỉ lệ thuận nồng độ
BỘ TẠO ÁNH SÁNG ĐA SẮC (cho phép nhiều bước sóng đi qua)
Nguồn sáng: đèn Deuterium Flow cell lOMoAR cPSD| 45148588
DIOD ARRAY: dùng hệ quang học đảo (truyền ánh sáng trắng qua mẫu đo)
đo độ hấp thu của tất cả các bước sóng đồng thời Ưu và nhược của bộ
phận phát hiện đa sóng PDA lOMoAR cPSD| 45148588 lOMoAR cPSD| 45148588
Ưu: đo được độ hấp thu ở nhiều bước sóng đông thời Nhược: đắt
Nguyên lí của các bộ phận phát hiện
Các phân tử chất hữu cơ hấp thu ánh sáng UV, độ hấp thu tỉ lệ thuận nồng độ
Bộ phận phát hiện khúc xạ kế vi sai (IR)
Nguyên lí: dựa trên sự khác nhau giữa chỉ số khúc xạ của pha động và
pha động chưa chất tan sau li giải Bộ phận phát hiện huỳnh quang (FD)
Độ nhạy gâp ngàn lần so với máy UV vis
Nguyên lí: đo độ phát quang của các chất do đó có tính chọn lọc cao vì hầu
hết các chất hấp thu UV vis nhưng không phải chất nào cũng phát huỳnh quang
Dùng để: phát hiện thuốc trừ sâu, vitamin, aamin, các chất chuyển hoá thuốc trong cơ thể
Sự phát quang sử dụng 2 bước sóng: bước sóng kích thích, bước sóng phát xạ
Ưu và nhược của bộ phận phát hiện huỳnh quang
Ưu: độ nhạy cao, có tính chọn lọc Khuyết: phức tạp
Bộ phận phát hiện tán xạ bay hơi (ELSD)
Chất sau khi được rửa giải được phân tán (bằng khí trơ nitrogen), các phần
tử nhỏ đc hoá hơi, qua flow cell, ánh sáng lase chiếu vào các ptu này sẽ tán
xạ ánh sáng, diod quang ghi lại sự tán xạ
Ưu và nhược của bộ phận phát hiện tán xạ bay hơi
Ưu: nhạy cao, phát hiện hầu như các hợp chất
Nhược: không dùng được cho pha động khó bay hơi, mẫu phân tích phải có
sự bay hơi THẤP HƠN pha động
Bộ phận phát hiện điện hoá (ED)
Phát hiện các hợp chất có tính oxy hoá- khử Giá thành rẻ
Giới hạn phát hiện thấp
Bộ phận phát hiện khối phổ
Thuận lợi: phát hiện vạn năng, độ nhạy cao, độ chọn lọc cao, thời gian nhanh;
định danh đc các chất tan ngay
Nhược: giá thành rất đắt, một lượng lớn pha động đi và khối phổ, nhạy với nhiệt
Bộ phận phát hiện đo cường độ xung Ứng dụng
Định tính: dựa vào thời gian lưu, thu sản phẩm ra khỏi cột, định danh bằng
các pp khác như khối phổ, hồng ngoại, cộng hưởng từ
Định lượng: diện tích pic và chiều cao pic, thời gian lưu