Chương 9: Giới thiệu về phương pháp sắc ký | Bài giảng môn Phân tích bằng công cụ | Đại học Bách khoa hà nội

CHƯƠNG 9
GiỚI THIỆU VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ (Choromatography) Milestones in Chromatography
1903: Tswett - plant pigments (chlorophyll, carotenes, and xanthophylls) separated on chalk columns
1931: Lederer & Kuhn - LC of carotenoids 1938: TLC and ion exchange 1950: Reverse phase LC
1954: Martin & Synge (Nobel Prize) 1959: Gel permeation 1965: Instrumental LC (Waters)
1960s: HPLC was developed as an analyticaltool
1974: LC/MS (fully developed in 1990s)
2000s: Development of new packing material and detector: chiral stuff, micro/nano LC Look at this video
Chromatography is the method of separating, dissociating and analyzing
substances based on their different distribution between mobile and stationary phases.
Chromatography operates on the same principle as extraction, but one phase is held in place
while the other moves past it. Figure below shows a solution containing solutes A and B placed
on top of a column packed with solid particles and filled with solvent. When the outlet is
opened, solutes A and B flow down into the column.
Fresh solvent is then applied to the top of the
column and the mixture is washed down the
column by continuous solvent flow. If solute A
is more strongly adsorbed than solute B on the
solid particles, then solute A spends a smaller
fraction of the time free in solution. Solute A
moves down the column more slowly than
solute B and emerges at the bottom after solute
B. We have just separated a mixture into its components by chromatography. 3 The mobile phase (the solvent moving through the column) in
chromatography is either a liquid or a gas.
The stationary phase (the one that stays in place inside the column) is most
commonly a viscous liquid chemically bonded to the inside of a capillary
tube or onto the surface of solid particles packed in the column.
Fluid entering the column is called eluent. Fluid emerging from the end of
the column is called eluate.
The process of passing liquid or gas through a chromatography column is called elution.
 Analytical - determine chemical composition of a sample
 Preparative - purify and collect one or more components of a sample
Dựa trên tương tác giữa pha tĩnh và pha động (Attactive forces)
❖ Sắc ký hấp phụ: Pha tĩnh là chất rắn, pha động là chất lỏng hay khí. Chất
tan được hấp phụ trên bề mặt của các hạt rắn. Các chất tan được hấp phụ
càng mạnh thì nó càng di chuyển chậm ở trong cột.
❖Sắc ký phân bố: Pha tĩnh là chất lỏng được liên kết với bề mặt rắn, thường là
SiO . Pha động thường là chất khí. Cân bằng phân bố của chất tan giữa với 2
pha tĩnh và pha động được thiết lập trong sắc ký khí. 6
❖ Sắc ký trao đổi ion: Các loại nhựa trao đổi ion, ví dụ nhựa trao đổi anion -SO - +
3 , hay nhựa trao đổi cation –N(CH3)3 được liên kết với pha
tĩnh bằng liên kết cộng hóa trị. Pha động là các chất lỏng chứa các ion
chất tan có điện tích trái dấu được liên kết với pha tĩnh bởi lực tĩnh điện. 7
❖ Sắc ký loại cỡ phân tử: Còn được gọi là sắc ký lọc gel hay sắc ký thẩm
thấu gel. Kỹ thuật sắc ký này cho phép tách các phân tử dựa trên kích
thước của nó. Các chất tan có kích thước lớn hơn sẽ đi qua cột nhanh
chóng. Trong trường hợp lý tưởng của sắc ký loại cỡ phân tử, sẽ không có
tương tác giữa pha động và chất tan. Pha động là chất khí hay lỏng sẽ đi
qua gel xốp. Các lỗ xốp là đủ nhỏ để loại các phân tử chất tan có kích thước
lớn. Các phân tử lớn không cần thâm nhập vào các lỗ xốp. Do vậy, các phân
tử nhỏ sẽ cần nhiều thời gian hơn để đi qua cột. 8
❖Sắc ký ái lực: Đây là loại sắc ký có độ chọn lọc cao nhất sử dụng sự
tương tác chọn lọc giữa phân tử chất tan và một phân tử thứ hai, phân
tử gắn với pha tĩnh nhờ liên kết cộng hóa trị. Ví dụ, các phân tử bất
động có thể là một kháng thể với một loại protein cụ thể. Khi có một hỗn
hợp chứa hàng nghìn protein đi qua cột, chỉ có một protein là phản ứng
với kháng thể liên kết của cột. Tất cả các chất tan khác được rửa sạch từ
cột, protein cần tách sẽ được tách ra bằng cách thay đổi độ pH hoặc cường độ ion. 9
Dựa trên tính chất của pha động (Mobile phase)
Khí- Rắn (Stationary phase is solid)
Sắc ký khí: (Gas, GC)
Khí- Lỏng (Stationary phase is Liquid)
Mẫu phân tích cần bay hơi ỏ nhiệt độ thấp hơn 350 oC
Column (CLC, gravity flow)
Sắc ký lỏng (Liquid, LC)
High performance (HPLC, pressure flow)
Thin layer (TLC, adsorption)
Sắc ký dòng tới hạn (supercritical fluid, SCFC) ❑ Sắc ký đồ
Sơ đồ sắc ký khí ái lực theo thời gian lưu. 11
Sắc ký đồ̀ phân tích mẫu nước tiểu của một người có
methamphetamin (MA) ở tr = 9,96 phút 12
❑ Các đại lượng đặc trưng
Thời gian lưu (Retention time, tr ) của mỗi cấu tử là thời gian cần thiết để
cấu tử tiếp cận được với detector kể từ lúc nó được bơm vào cột.
Thể tích lưu (Retention volume, Vr) là thể tích của pha động cần thiết để
rửa giải một chất tan ra khỏi cột.
Thời gian pha động chuyển động dọc theo cột khi không có chất tan (Tm).
Thời gian lưu hiệu chỉnh (Adjusted retention time, t’r) của một chất tan là
thời gian cần thiết để chất tan di chuyển theo chiều dài cột trừ đi thời gian
cần thiết để dung môi đi qua cột. t’r = tr – tm (9-1)
Trong sắc ký khí, tm thường được lấy là thời gian cần thiết để CH4 chuyển động qua cột. 13
Sự lưu tương đối (Relative retetion, α) với hai cấu tử bất kỳ 1 và 2
là tỉ số giữa thời gian lưu hiệu chỉnh của chúng. (9-2)
Sự lưu tương đối càng lớn, khả năng tách giữa hai cấu tử ra khỏi
nhau càng lớn. Sự lưu tương đối không phụ thuộc vào tốc độ
chảy và vì vậy có thể được sử dụng để xác định pic khi tốc độ chảy thay đổi. 14
Thừa số dung tích (Capacity factor, k’) được định nghĩa: (9-3)
Các cấu tử được lưu lại trong cột lâu hơn nếu thừa số dung tích
càng lớn. Để theo dõi hiệu suất của cột sắc ký, tốt nhất là kiểm
tra và đo thừa số dung tích, số đĩa và tính đối xứng của pic. Việc
thay đổi các tham số này chỉ ra sự giảm hiệu suất của cột. 15 16
❑ Mối quan hệ giữa thời gian lưu và hệ số phân bố
Thừa số dung tích ở phương trình 9-3 là tương đương với: (9-4)
Cs là nồng độ chất tan trong pha tĩnh, Vs là thể tích của pha tĩnh.
Cm là nồng độ của chất tan trong pha động, Vm là thể tích của pha động.
Tỉ số Cs/Cm là tỉ số nồng độ của chất tan trong pha tĩnh và pha động.
Nếu cột được chuyển động đủ chậm để đạt cân bằng, tỉ số Cs/Cm là hệ số
phân bố, K, được giới thiệu trong chương chiết. Do đó, chúng ta có thể biểu
diễn phương trình 9-4 dưới dạng: (9-5) 17 Do
, sự lưu tương đối có thể diễn đạt: (9-6)
Sự lưu tương đối của hai chất tan tỉ lệ với tỉ số của hệ số phân bố của
chúng. Mối liên hệ này là cơ sở vật lý của phương pháp sắc ký.
Thể tích lưu (Vr) , là thể tích của pha động cần thiết để rửa giải một chất
tan cụ thể ra khỏi cột: Vr = tr×uv (9-7)
uv là tốc độ chảy của pha động (thể tích trên đơn vị thời gian). Thể tích
lưu của một chất tan cụ thể là không đổi trong một phạm vi của tốc độ chảy. 19 ❑ Độ phân giải
Các chất tan chuyển động qua cột sắc ký có xu hướng phân bố như
đường cong Gauxơ với độ lệch chuẩn σ. Thời gian một chất tan đi qua cột
càng dài, thì pic sắc ký càng tù. Thông thường người ta đo độ rộng ở độ
cao bằng một nửa chiều cao pic w1/2. Từ phương trình đường cong Gauxơ:
w1/2 = 2.35σ và w = 4σ.
Đường cong Gauxơ lý tưởng để đo w và w . Các giá trị của w là thu được bằng 1/2
cách ngoại suy các tiếp tuyến với các điểm uốn xuống đường cơ sở. 20