Chương 9: Giới thiệu về phương pháp tách trong Hóa phân tích | Bài giảng môn Phân tích bằng công cụ | Đại học Bách khoa hà nội

Chương 9
Giới thiệu về phương pháp tách trong Hóa phân tích
Năm 1903, M. Tswett đầu tiên áp dụng sắc ký hấp phụ để tách các
sắc tố thực vật, bằng cách sử dụng một dung môi hydrocarbon và
bột inulin (carbohydrate) là pha tĩnh. Sự tách của các đám màu dẫn
đến tên “sắc ký”, từ chromatos từ tiếng Hy Lạp, có nghĩa là "màu
sắc". Tswett sau đó thấy rằng CaCO3 hoặc sucrose cũng có thể được
sử dụng làm pha tĩnh. 9.1. Định nghĩa 2
Nguyên lý hoạt động của sắc ký như quá trình chiết nhưng một pha
được giữ cố định và một pha động di chuyển qua pha cố định này.
Chất lỏng đi vào cột gọi là dung môi rửa giải. Chất lỏng đi ra khỏi cột gọi
là dung môi giải hấp. Quá trình mà chất khí hay chất lỏng đi qua cột sắc
ký gọi là quá trình rửa giải. Cột sắc ký được nhồi với các hạt có kích
thước nhỏ như được chỉ ra ở hình vẽ 9-1. 9.1. Định nghĩa 3
Hình 9-1. Ý tưởng đằng sau sắc ký: chất tan A có độ hấp phụ lớn hơn
đối với pha tĩnh so với chất tan B, lưu lại trên cột lâu hơn.
9.2. Phân loại sắc ký 4
(dựa trên tương tác giữa pha tĩnh và pha động )
- Sắc ký hấp phụ: Pha tĩnh là chất rắn, pha động là chất lỏng hay khí.
Chất tan được hấp phụ trên bề mặt của các hạt rắn. Các chất tan được
hấp phụ càng mạnh thì nó càng di chuyển chậm ở trong cột (hình 9-2).
- Sắc ký phân bố: Pha tĩnh là chất lỏng được liên kết với bề mặt rắn, thường là SiO2. Pha động thường là chất khí. Cân bằng của chất tan giữa với pha tĩnh và pha động được thiết lập trong sắc ký khí (hình 9-2).
Hình 9-2. Sắc ký hấp phụ và sắc ký phân bố
9.2. Phân loại sắc ký 5
(dựa trên tương tác giữa pha tĩnh và pha động )
-Sắc ký trao đổi ion: Các loại
nhựa trao đổi ion, ví dụ nhựa trao đổi anion hay nhựa trao đổi cation
được liên kết với pha tĩnh bằng
liên kết cộng hóa trị. Pha động
là các chất lỏng chứa các ion
chất tan có điện tích trái dấu
được liên kết với pha tĩnh bởi
Hình 9-3. Sắc ký trao đổi ion và sắc ký
lực tĩnh điện (hình 9-3). loại cỡ phân tử
9.2. Phân loại sắc ký 6
(dựa trên tương tác giữa pha tĩnh và pha động )
- Sắc ký loại cỡ phân tử: còn
được gọi là sắc ký lọc gel hay
sắc ký thẩm thấu gel. Kỹ thuật
sắc ký này cho phép tách các
phân tử dựa trên kích thước của
nó. Các chất tan có kích thước
lớn hơn sẽ đi qua cột nhanh
chóng. Trong trường hợp lý
tưởng của sắc ký loại cỡ phân
tử, sẽ không có tương tác giữa
pha động và chất tan. Pha động
là chất khí hay lỏng sẽ đi qua gel
xốp. Các lỗ xốp là đủ nhỏ để loại
Hình 9-3. Sắc ký trao đổi ion và sắc ký
các phân tử chất tan có kích loại cỡ phân tử
thước lớn. Các phân tử lớn
không cần thâm nhập vào các lỗ
xốp. Do vậy, các phân tử nhỏ sẽ
cần nhiều thời gian hơn để đi qua cột (hình 9-3).
9.2. Phân loại sắc ký 7
(dựa trên tương tác giữa pha tĩnh và pha động )
- Sắc ký ái lực: Đây là loại sắc ký
có độ chọn lọc cao nhất sử dụng
sự tương tác chọn lọc giữa phân
tử chất tan và một phân tử thứ
hai, phân tử gắn với pha tĩnh nhờ
liên kết cộng hóa trị. Ví dụ, các
phân tử bất động có thể là một
kháng thể với một loại protein cụ
thể. Khi có một hỗn hợp chứa
hàng nghìn protein đi qua cột,
chỉ có một protein là phản ứng
với kháng thể liên kết của cột.
Tất cả các chất tan khác được
Hình 9-4. Sắc ký ái lực
rửa sạch từ cột, protein cần tách
sẽ được tách ra bằng cách thay
đổi độ pH hoặc cường độ ion (hình 9-4).
9.3. Các đại lượng đặc trưng của sắc ký 8 9.3.1. Sắc ký đồ
Hình 9-5. Sơ đồ sắc ký khí ái lực theo thời gian lưu.
9.3. Các đại lượng đặc trưng của sắc ký 9 9.3.1. Sắc ký đồ
Hình 9-6. Sắc ký đồ phân tích mẫu nước tiểu của một người
có methamphetamin (MA) ở tr = 9,96 phút
9.3. Các đại lượng đặc trưng của sắc ký 10 9.3.1. Sắc ký đồ Thời gian lưu, t
r , của mỗi cấu tử là thời gian cần thiết để cấu tử
tiếp cận được với detector kể từ lúc nó được bơm vào cột.
Thể tích lưu, Vr , là thể tích của pha động cần thiết để rửa giải
một chất tan ra khỏi cột.
Thời gian lưu hiệu chỉnh, tr‘ của một chất tan là thời gian cần
thiết để chất tan di chuyển theo chiều dài cột trừ đi thời gian cần
thiết để dung môi đi qua cột. (9-1)
Pha động chuyển động dọc theo cột khi không có chất tan với
thời gian tm. Trong sắc ký khí, tm thường được lấy là thời gian
cần thiết để CH4 chuyển động qua cột
9.3. Các đại lượng đặc trưng của sắc ký 11 9.3.1. Sắc ký đồ
Với hai cấu tử bất kỳ 1 và 2, sự lưu tương đối, là tỉ số giữa thời
gian lưu hiệu chỉnh của chúng (9-2)
Sự lưu tương đối càng lớn, khả năng tách giữa hai cấu tử ra khỏi
nhau càng lớn. Sự lưu tương đối không phụ thuộc vào tốc độ
chảy và vì vậy có thể được sử dụng để xác định pic khi tốc độ chảy thay đổi.
9.3. Các đại lượng đặc trưng của sắc ký 12 9.3.1. Sắc ký đồ
Đối với mỗi pic trên sắc ký đồ, thừa số dung tích, k’, được định nghĩa: (9-3)
Các cấu tử được lưu lại trong cột lâu hơn nếu thừa số dung tích
càng lớn. Để theo dõi hiệu suất của cột sắc ký, tốt nhất là kiểm
tra và đo thừa số dung tích, số đĩa và tính đối xứng của pic. Việc
thay đổi các tham số này chỉ ra sự giảm hiệu suất của cột.
9.3. Các đại lượng đặc trưng của sắc ký 13 9.3.1. Sắc ký đồ
Ví dụ về các tham số lưu:
Một hỗn hợp gồm benzen, toluen và metan được bơm vào cột sắc ký khí. Metan
cho tín hiệu ở 42s, benzen ở 251s và toluen bị rửa giải ở 333s. Hãy xác định thời
gian lưu hiệu chỉnh và thừa số dung tích cho mỗi chất tan và sự lưu tương đối. Giải
Thời gian lưu hiệu chỉnh:
Sự lưu tương đối được diễn tả dưới dạng tỉ số giữa thời gian lưu hiệu
chỉnh của toluen và benzen:
9.3. Các đại lượng đặc trưng của sắc ký 14
9.3.2. Mối quan hệ giữa thời gian lưu và hệ số phân bố
Thừa số dung tích ở phương trình 9-3 là tương đương với: (9-4)
ở đây Cs là nồng độ chất tan trong pha tĩnh, Vs là thể tích của pha tĩnh,
Cm là nồng độ của chất tan trong pha động và Vm là thể tích của pha động.
Tỉ số Cs/Cm là tỉ số nồng độ của chất tan trong pha tĩnh và pha động. Nếu
cột được chuyển động đủ chậm để đạt cân bằng, tỉ số Cs/Cm là hệ số
phân bố, K, được giới thiệu trong chương chiết. Do đó, chúng ta có thể
biểu diễn phương trình 9-4 dưới dạng: (9-5)
9.3. Các đại lượng đặc trưng của sắc ký 15
9.3.2. Mối quan hệ giữa thời gian lưu và hệ số phân bố
Do , sự lưu tương đối có thể diễn đạt: (9-6)
Điều này có nghĩa là sự lưu tương đối của hai chất tan tỉ lệ với tỉ số của
hệ số phân bố của chúng. Mối liên hệ này là cơ sở vật lý của phương pháp sắc ký.
Thể tích lưu,Vr , là thể tích của pha động cần thiết để rửa giải một chất
tan cụ thể ra khỏi cột: Thể tích lưu: Vr = tr×uv (9-7)
ở đây uv là tốc độ chảy của pha động (thể tích trên đơn vị thời gian). Thể
tích lưu của một chất tan cụ thể là không đổi trong một phạm vi của tốc độ chảy.
9.4. Hiệu quả tách 16
9.4.1. Độ phân giải
Các chất tan chuyển động qua cột sắc ký có xu hướng phân bố như đường cong
Gauxơ với độ lệch chuẩn σ (hình 9-6). Thời gian sử dụng để di qua cột càng dài,
thì pic sắc ký càng tù. Thông thường người ta đo độ rộng ở độ cao bằng một nửa
chiều cao pic w1/2. Từ phương trình đường cong Gauxơ
có thể thấy là w1/2 = 2.35σ và w = 4σ.
Hình 9-6. Đường cong
Gauxơ lý tưởng để đo w và
w1/2. Các giá trị của w là thu được
bằng cách ngoại su y
các tiếp tuyến với các điểm
uốn xuống đường cơ sở.
9.4. Hiệu quả tách 17
9.4.1. Độ phân giải
Trong sắc ký, độ phân giải của hai pic với nhau được định nghĩa là:
ở đây, Δtr hay ΔVr là sự tách giữa hai pics (đơn vị thời gian hay thể tích)
và wav là độ rộng trung bình của hai pic. Ngoài ra, độ phân giải có thể
biểu diễn qua việc sử dụng w1/2av chiều rộng tại nửa chiều cao của đỉnh
đường cong Gauxơ. Hình 9-7 cho thấy sự chồng chéo của hai đỉnh với
mức độ khác nhau của độ phân giải. Đối với phân tích định lượng, độ
phân giải là > 1,5 là điều trong đợi.
9.4. Hiệu quả tách 18
9.4.1. Độ phân giải
Hình 9-7. Độ phân giải của các pic Gauxơ có diện tích và biên độ bằng nhau.
Đường nét đứt cho thấy các pic riêng biệt và các dòng liền là tổng của hai
đỉnh pic. Phần chồng sắc ký đồ là phần bóng mờ.
9.4. Hiệu quả tách 19
9.4.2. Sự khuếch tán
Hình 9-8. Sự mở rộng của pic khi di chuyển qua cột sắc ký
Khi chuyển động qua cột, lý tưởng nhất là pic sắc ký có dạng
hình Gauxơ, theo chiều dài của cột thì pic có độ rộng càng lớn
(hình 9-8). Ít lý tưởng hơn, pic sắc ký sẽ có dạng không đối xứng.
9.4. Hiệu quả tách 20 9.4.2. Sự khuếch tán
Một trong những nguyên nhân chính của sự nở pic là sự khuếch tán. Hệ
số khuếch tán đo sự di chuyển ngẫu nhiên từ nơi có nồng độ cao đến
nơi có nồng độ thấp. Hình 9-9 cho thấy sự khuếch tán tự phát của chất
tan qua một mặt phẳng với một gradien nồng độ dc/dx. Số mol chất tan
đi qua một mét vuông trong một giây gọi là thông lượng, J, tỉ lệ thuận với gradien nồng độ: (9-8)
Hình 9-9. Thông lượng của các phân tử khuếch tán
qua một đơn vị diện tích là tỷ lệ thuận với gradient
nồng độ và hệ số khuếch tán: J =- D (dc / dx).