HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
ĐỀ CƯƠNG KHÓA LUẬN
TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN LACTIC VÀ
KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH TỔNG HỢP
GAMMA-AMINOBUTYRIC ACID
Nội Tháng 03/2023
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
ĐỀ CƯƠNG KHÓA LUẬN
TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN LACTIC VÀ
KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH TỔNG HỢP
GAMMA-AMINOBUTYRIC ACID
Người thực hiện
Mã sinh viên
Khóa
Ngành
Giáo viên hướng dẫn
Địa điểm thực tập
: Nguyễn Th Mai
: 642546
: 64
: Công nghệ thực phẩm
: TS. Vũ Duy Nhàn
TS. Quỳnh Hương
: Phân viện Công nghệ sinh học
Trung tâm Nhiệt đới Việt - Nga
Nội Tháng 03/2023
i
THÔNG TIN VỀ SINH VIÊN THỰC HIỆN KHÓA LUẬN
1.
Họtên sinh viên: Nguyễn Thị Mai SV: 642546
Tel: 0356515891 Email: nmai01@gmail.com
2.
Địa chỉ liên hệ: túcC5 Học Viện Nông nghiệp Việt Nam
3.
Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm
4.
Lớp: K64CNTPA Khóa: 64
5.
Giáo viên hướng dẫn 1: TS. Vũ Duy Nhàn
Giáo viên hướng dẫn 2: TS. Quỳnh Hương
6.
Địa điểm thực tập: Phòng Sinh hóa Phân viện Công nghệ sinh học Trung m Nhiệt
đới Việt - Nga
Sinh viên thực hiện
(Ký ghi họ tên)
Nguyễn Thị Mai
ii
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................... iv
I.
ĐẶT VẤN ĐỀ ......................................................................................................... 1
1.1.
Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................ 1
1.2.
Mục tiêu nghiên cứu của đề tài ..................................................................... 2
1.2.1.
Mục tiêu ........................................................................................................ 2
1.2.2.
Yêu cầu ......................................................................................................... 2
II.
TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ................................................... 3
2.1.
Giới thiệu về vi khuẩn lactic .......................................................................... 3
2.2.
Tổng quan về γ -Aminobutyric acid (GABA) .............................................. 3
2.2.1.
Giới thiệu về GABA ..................................................................................... 3
2.2.2.
Hình dạng cấu trúc của GABA ................................................................ 3
2.2.3.
Chức năng của GABA .................................................................................. 4
2.2.4.
Sinh tổng hợp GABA ................................................................................... 4
2.2.5.
Các nguồn sinh tổng hợp GABA .................................................................. 5
2.2.6.
Tình hình nghiên cứu về GABA................................................................... 6
III.
ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ........................................................................................................................... 8
3.1.
Đối tượng nghiên cứu..................................................................................... 8
3.1.1.
Nguyên liệu .................................................................................................. 8
3.1.2.
Hoá chất, thiết bịdụng cụ ........................................................................ 8
3.2.
Phạm vi nghiên cứu ........................................................................................ 8
3.3.
Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 9
3.4.
Môi trường nghiên cứu .................................................................................. 9
3.5.
Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 9
3.5.1.
Phương pháp bố tthí nghiệm ..................................................................... 9
3.5.2.
Phương pháp phân tích thí nghiệm ............................................................. 11
IV.
DỰ KIẾN KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC .................................................................. 14
4.1.
Kết quả tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp GABA ............ 14
iii
4.2.
Kết quả định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn bằng phương pháp sinh
học phân tử .......................................................................................................... 14
4.3.
Kết quả khảo sát điều kiện lên men sinh tổng hợp GABA của chủng
tuyển chọn ............................................................................................................ 14
V.
KẾ HOẠCH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI .................................................................. 15
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 16
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt Tiếng anh hoặc tên khoa học
GABA Gamma aminobutyric acid
GAD Glutamic acid decarboxylase
LAB Lactic acid bacteria
MSG Monosodium glutamate
OD Optical Density
TLC Thin layer chromatography
iv
1
I.
ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1.
Tính cấp thiết của đề tài
Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển không ngừng của khoa học
kỹ thuật nhu cầu cuộc sống ngày càng ng cao, vấn đề sức khỏe đời sống con
người ngày càng được chú trọng hơn cũng như nhu cầu sử dụng các thực phẩm chức
năng ngày một tăng lên, việc nghiên cứu tìm ra các hợp chất hoạt tính sinh học
quan trọng ứng dụng trong thực phẩm chức năng được nhiều sự quan tâm của các nhà
khoa học. Trong đó, Gamma-aminobutyric acid (GABA) một hợp chất được nghiên
cứu rất nhiều trong thời gian gần đây. GABA một amino acid tác dụng giảm
hoạt động của các neuron thần kinh ức chế sự lan truyền của các tế bào dẫn truyền,
từ đó giảm stress, căng thẳng, chứng mất ngcòn giảm thiểu nguy mắc các
bệnh về tim mạch, tiểu đường và cholesterol trong máu (Jin và cs., 2013).
GABA được tổng hợp từ nhiều nguồn khác nhau, trong đó nhiều nghiên cứu
tập trung về sinh tổng hợp GABA từ vi sinh vật do chu trình phát triển ngắn, quá trình
nuôi cấy dễ thực hiện, môi trường nuôi cấy rdễ kiếm, đặc biệt từ vi khuẩn
lactic (LAB) (Lê Thị Huyền Trang Đỗ Thị Bích Thủy, 2020). LAB nhóm vi
sinh vật được ng dụng nhiều trong sản xuất bảo quản thực phẩm, đặc biệt trong
các sản phẩm lên men truyền thống như lên men sữa, thịt (Dương Minh Khải, 2013).
LAB không chỉ tạo ra acid lactic, ethanol, hợp chất thơm, bacteriocin (And
Hoover, 2003) hơn hết LAB đã được các nhà khoa học nghiên cứu ứng dụng để
lên men thu được hàm ợng lớn GABA. Nhiều công trình nghiên cứu trên thế
giới liên quan đến việc tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic khả năng sinh tổng
hợp GABA cao tối ưu hóa điều kiện n men sinh tổng hợp GABA (Li cs.,
2010).
Một số chủng LAB sinh tổng hợp GABA đã được nghiên cứu như
Lactobacillus, Lactococcus, Lactobacillus Brevis được phân lập từ nhiều loại thực
phẩm lên men. Chủng Lactococcus lactis subsp. lactis được phân lập từ kim chi sinh
tổng hợp GABA với nồng độ cao được xác định 3,68 g/l trong môi trường MRS
lỏng với 1% monosodium glutamate (MSG) (Lu cs., 2008). Trong shochu của
2
Nhật Bản, các acid glutamic tự do nồng độ 10,50 mM chuyển đổi thành GABA
nồng độ 10,18 mM bởi Lactobacillus brevis IFO-12005 (Yokoyama cs., 2002).
Chủng Lactobacillus brevis NCL 912 phân lập từ paocai Trung Quốc đã thu được
nồng độ GABA trong dịch lên men tối ưu là 149,05 mM (Li và cs., 2008).
GABA được sản xuất từ LAB hàm lượng cao, an toàn cho người sử dụng.
Bên cạnh LAB thì các yếu tố lên men khác nhau cũng ảnh hưởng đến tlệ GABA
được sinh tổng hợp khác nhau. Trong đó các yếu tố phổ biếncần thiết pH, nhiệt
độ, thời gian nuôi cấy, cơ chất tham gia tổng hợp GABA… (Dhakal và cs., 2012).
Mặc nhiều nghiên cứu về chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ các nguồn
thực phẩm xác định sinh tổng hợp GABA, tuy nhiên nghiên cứu thêm về các
đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn lactic cũng như điều kiện sinh tổng hợp
GABA điều cần thiết, vậy chúng tôi thực hiện đề tài: “Tuyển chọn chủng vi
khuẩn lactic khảo sát điều kiện lên men sinh tổng hợp gamma aminobutyric
acid”.
1.2.
Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
1.2.1.
Mục tiêu
Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic khả năng sinh tổng hợp được gamma
aminobutyric acid (GABA) xác định được các điều kiện lên men sinh tổng hợp
GABA.
1.2.2.
Yêu cầu
-
Tuyển chọn được các chủng vi khuẩn lactic khả năng sinh tổng hợp GABA;
-
Định danh được chủng vi sinh vật tuyển chọn;
-
Khảo sát được các điều kiện lên men sinh tổng hợp GABA của chủng tuyển
chọn.
3
II.
TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
2.1.
Giới thiệu về vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic nhóm vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, thường
không di động, không kháng acid, không cytochrome và catalase âm tính (ngoại
trừ Fructobacillus). Các LAB bao gồm cả dạng cầu khuẩn trực khuẩn. LAB từ lâu
đã được sử dụng như các chủng vi khuẩn khởi đầu cho quá trình lên men của nhiều
loại thực phẩm và đồ uống nhờ vai trò của chúng trong việc tạo hương vị, phát triển
mùi thơm và làm chậm sự hỏng (De Vuyst và Degeest, 1999). Trong y học, nhóm
vi khuẩn lactic sản xuất ra các loại kháng sinh được dùng làm thuốc để chữa các bệnh
về nhiễm khuẩn, nhiễm nấm… (Lahtinen và cs., 2011).
2.2.
Tổng quan về γ -Aminobutyric acid (GABA)
2.2.1.
Giới thiệu về GABA
GABA một amino acid khá phổ biến trong tự nhiên. GABA được biết đến
đầu tiên như một thành phần trong củ khoai y, được phân bố rộng rãi trong
tự nhiên, bao gồm động vật, thực vật vi sinh vật. GABA vai trò quan trọng trong
hệ thống thần kinh trung ương (Abe và cs., 1995). GABA cho thấy hiệu quả cải thiện
rối loạn giấc ngủ liên quan đến việc dùng rượu. GABA thể hạ huyết áp, tác
dụng lợi tiểu, chống tiểu đường, vai trò trong việc kiểm soát sự lo lắng, cơn đau
của thể, giảm hàm lượng lipid trong huyết thanhức chế sự tăng sinh tế o ung
thư, cải thiện trí nhớ và khả năng học tập (Dhakal và cs., 2012).
Năm 1883, GABA lần đầu tiên được tổng hợp được biết đến như một sản
phẩm trao đổi chất thực vật vi khuẩn (Cooper cs., 2003). Đến m 1950, GABA
được phát hiện một phần không thể thiếu của hệ thần kinh trung ương của động vật
có vú (Cooper và cs., 2003).
2.2.2.
Hình dạng cấu trúc của GABA
Gamma aminobutyric acid một amino acid không tham gia cấu tạo nên
protein.
Tên IUPAC: 4 aminobutanoic acid
Công thức phân tử: C
4
H
9
NO
2
4
Khối lượng phân tử: 103,12 g/mol
Điểm nóng chảy: 203,7 (477 K, 399 )
GABA chất rắn, khả năng hòa tan trong nước với độ tan khoảng
1300mg/ml 25.
GABA cấu trúc 4C, bao gồm nhóm amino (NH
2
) nhận proton nhóm acid
cacboxylic (COOH) cho proton, và gốc R, chủ yếu được tìm thấy ở dạng lưỡng cực.
Trong trạng thái khí, GABA dạng cuộn xoắn cao do lực tĩnh điện giữa hai nhóm
chứng năng. Trong trạng thái rắn, lại được tìm thấy dạng cấu trúc thẳng, cấu
hình trans nhóm amino cấu trúc cis cuối nhóm cacboxyl, đây do tương tác
với các phân tử lân cận. trạng thái lỏng, GABA tồn tại cả dạng gấp khúc thẳng.
Điều này giúp GABA thể thực hiện nhiều chức năng sinh học quan trọng (Nguyễn
Thị Anh Đào, 2018).
2.2.3.
Chức năng của GABA
GABA là một loại amino acid không thể thiếu cho cơ thể, cần thiết để duy trì
sự hoạt động bình thường của não bộ, đặc biệt các neuron thần kinh. Chất y
khả năng ngăn chặn sự hoạt động thái quá của các neuron thần kinh tại hệ thống thần
kinh trung ương ức chế sự lan truyền của tế bào dẫn truyền để tăng cường cảm
giác thư thái trong hệ thần kinh. Đây là chất c chế dẫn truyền tự nhiên được thể
sản sinh, tác dụng giúp thư giãn thần kinh giấc ngủ ngon. GABA cùng với
niacinamide và inositol, khả năng giảm bớt căng thẳng lo âu tới vùng thần kinh
trung ương bằng việc chiếm giữ các vùng tiếp nhận thông tin của các tế bào y,
khống chế các vùng tiếp nhận tin. Do đó, GABA giúp làm giảm căng thẳng, giúp ngủ
ngon, giảm huyết áp và giúp an thần (Hayakawa và cs., 2004).
2.2.4.
Sinh tổng hợp GABA
Con đường sinh tổng hợp GABA được tả như sau: L- glutamate được tạo
ra từ alpha- ketoglutarate bằng các phản ng chuyển hóa được xúc tác bởi enzym
glutamate dehydrogenase, sau đó diễn ra quá trình các cơ chất L- glutamte dưới sự
xúc tác của enzyme glutamte decarboxylase (GAD). Hoạt động của enzyme GAD
cần một cofactor là pyridoxal 5’- phosphate (PLP) (Komatsuzaki và cs., 2007).
5
Sản xuất GABA bằng vi khuẩn lactic thì monosodium glutamate (MSG) được
xem như một chất quan trọng (Kook cs., 2010). MSG một dạng muối của
glutamic acid. MSG trong tự nhiên sinh ra từ amino acid được tìm thấy trong đa
số các thực phẩm như phomai, sữa, thịt, cá và nhiều loại rau khác nhau.
chất chính trong quá trình hình thành GABA chính glutamate, sau đó
GABA sinh ra sẽ được chuyển hóa tiếp tạo thành succinic semialdehyde cuối cùng
tạo thành sản phẩm GHB (ở dịch tế bào) succinate (ty thlạp). Ngoài ra ta cũng
có thể thu được glutamate từ con đường dị hóa lysine (Bouché và cs., 2004).
2.2.5.
Các nguồn sinh tổng hợp GABA
2.2.5.1.
Tách chiết từ tự nhiên
Trong tự nhiên, GABA được phân bố rộng rãi, đặc biệt trong o của các
động vật vú. Ngoài ra, các thụ thể GABA còn được tìm thấy con người trong
nhiều quan và mô, bao gồm não, hệ thống thần kinh trung ương, phổi, gan, đường
tiêu hóa, tinh trùng, tinh hoàn, tuyếncác tế bào khối u gan. Một số loại thực vật
ngũ cốc cũng chứa một lượng nhỏ GABA như mầm m gạo, giá đỗ, đậu tương,
chua, chuối, rau bina, chè xanh… GABA cũng được tìm thấy một số vi sinh
vật như vi khuẩn lactic, nấm men, nấm mốc (Kim và cs., 2009).
Mặc GABA được tìm thấy với m lượng lớn trong não của động vật
vú, nhưng không thể sử dụng những nguồn y để sản xuất GABA. Hàm lượng
GABA sinh tổng hợp được tìm thấy trong thực vật lại thấp. vậy, sdụng vi sinh
vật để sản xuất GABA đem lại nhiều ưu điểm hơn cả.
2.2.5.2.
Sinh tổng hợp GABA từ vi khuẩn
GABA ch yếu được hình thành bng phn ng 𝛼 decarboxylation không
nghịch đảo của axit L glutamic hoặc muối của nó, được xúc tác bởi enzyme glutamic
acid decarboxylase (GAD). Enzyme này được tìm thấy vi khuẩn n Lactobacillus
(Bertoldi cs., 1999), Escherichia (Rice cs., 1993), Streptococcus, Aspergillus
(Kato cs., 2002) và Neurospora (Kubicek cs., 1979. Tuy nhiên vi khuẩn
Lactobacillus loại phổ biến nhất để sản xuất GABA vi khuẩn lactic những
hoạt tính sinh đặc biệt thể xem như khá an toàn trong quá trình sử dụng vào
6
mục đích chăm sóc sức khỏe cho con người.
GABA được sản xuất từ vi khuẩn lactic bản chất từ tự nhiên và an toàn cho
sức khỏe. Nhiều sản phẩm được làm tăng hàm lượng GABA bằng sử dụng GABA
sản xuất từ vi khuẩn lactic được phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống như kim
chi, pho mai, sữa chua (Kim cs., 2009; Li cs., 2008). Tiềm năng sản xuất GABA
của LAB được nhiều nghiên cứu như sữa chua, pho mai (Park và Oh, 2007; Rizzello
và cs., 2008), kim chi (Park Oh, 2007) paocai (Li cs., 2008). Việc sàng lọc
vi khuẩn lactic dựa vào khả năng tổng hợp GABA thể đem lại triển vọng mới cho
quá trình sản xuất GABA.
2.2.6.
Tình nh nghiên cứu về GABA
2.2.6.1.
Tình hình nghiên cứu về GABA trên thế giới
Tại Hàn Quốc, nhóm tác giả Lee (2013) đã nghiên cứu quá trình sản xuất
GABA bằng cố định GAD. Các tác giả đã phát triển ng nghệ sản xuất GABA bằng
cách cđịnh GAD phân lập từ Escherichia coli. Thông qua việc nghiên cứu hoạt
động của enzyme cụ thể và đặc tính phản ứng, acid glutamic được ưu tiên chọn hơn
monosodium glutamate (MSG) để làm cơ chất chính cho GAD cố định.
Nhóm tác giả Lacroix cộng sự (2013) đã nghiên cứu khả năng sản xuất
GABA của các chủng Lactococcus được phân lập từ phô mai. Hđã phát hiện ra 9
chủng trong tổng số 50 chủng riêng biệt trong hai mẫu phô mai khả năng sản xuất
GABA. Trong đó, ULAAC A13 ULAAC A23 khả năng sản xuất GABA
lên đến 50 mg/300 ml sữa lên men. Nghiên cứu này cho thấy các chủng vi sinh vật
sản xuất GABA trong phô mai cứng phô mai mềm dưới những điều kiện sản xuất
GABA phổ biến.
Nhóm tác giả Jannoey (2010) Thái Lan cũng đã nghiên cứu quá trình tích
lũy GABA gạo trong suốt thời gian nảy mầm. Theo các tác giả, các giống gạo
hàm lượng axit glutamic khác nhau, nhưng hàm lượng GABA trong gạo không
sự chênh lệch nhiều (khoảng 0,05%). Trong qtrình nảy mầm, m lượng GABA
trong hạt gạo đều tăng đáng kể. Tuy nhiên, hàm lượng GABA cao hơn gấp
2-3 lần so với hạt gạo, đối với tất cả các giống gạo. Từ nghiên cứu thể thấy gạo
7
nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất GABA.
2.2.6.2.
Tình hình nghiên cứu về GABA Việt Nam
Đề tài nghiên cứu của Trịnh Tất Cường (2012) về nghiên cứu quy trình sản
xuất GABA từ dịch lên men cám gạo bằng Lactobacillus để ứng dụng làm thực phẩm
chức năng đã thu được những thành công nhất định. Đề tài đã y dựng được quy
trình sản xuất GABA từ lên men dịch cám gạo bằng Lactobacillus plantarum KLEPT.
Hàm lượng GABA thu được tương đối cao, đạt tới 660mM.
Quách Thị Việt cộng sự (2013) đã nghiên cứu trên chủng vi khuẩn
Lactobacillus brevis NCTH24 khả năng sinh tổng hợp GABA ứng dụng trong Bio-
yogurt. Chủng vi khuẩn y được đánh giá khả năng chuyển hóa glutamate
thành GABA cũng như các tính chất probiotic như khả năng sống sót trong môi
trường dạ dày và dịch ruột nhân tạo.
Theo nghiên cứu của Cung Thị Tố Quỳnhcộng sự (2012) về xây dựng quy
trình sản xuất gạo mầm (gạo GABA) từ gạo lứt nảy mầm. Kết quả nghiên cứu cho
thấy thể sản xuất được gạo GABA từ nguồn nguyên liệu gạo lứt Huyết Rồng
Jacmine của Việt Nam. Hàm lượng GABA từ gạo mầm thu được khá lớn, gấp 5 lần
(140 ppm) so với gạo lứt nguyên liệu. Đề tài đã mở ra một hướng ứng dụng cho việc
sản xuất các loại gạo dinh dưỡng có giá trị kinh tế cao tại Việt Nam.
8
III.
ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
3.1.
Đối tượng nghiên cứu
3.1.1.
Nguyên liệu
Các chủng vi khuẩn lactic trong bộ sưu tập giống tại Phân viện Công nghệ sinh
học – Trung tâm Nhiệt đới Việt - Nga.
3.1.2.
Hoá chất, thiết bị dụng cụ
3.1.2.1.
Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong quá trình nuôi cấy, định lượng, được sản xuất từ
các hãng lớn và tinh khiết như: Merck, Sigma, Himedia…
3.1.2.2.
Thiết bị
Các thiết bị máy móc tại Phân viện Công nghệ sinh học bao gồm:
-
Máy lắc ổn nhiệt (Tây Ban Nha)
-
Cân điện tử (Trung Quốc)
-
Nồi hấp khử trùng (Sanyo, Nhật)
-
Tủ sấy (Sanyo, Nhật)
-
Tủ cấy (Sanyo, Nhật)
-
Máy li m ức)
-
Kính hiển vi quang học BX51 (Olympus, Nhật)
-
Máy đo quang phổ (Mỹ)
Cùng các thiết bị liên quan khác.
3.1.2.3.
Dụng cụ
Đĩa petri, pipette các loại, ống eppendorf, đèn cồn, bình tam giác các loại, ống
nghiệm, bình định mức, que cấy…
3.2.
Phạm vi nghiên cứu
Địa điểm: Phòng Sinh hóa Phân viện Công nghệ sinh học Trung tâm Nhiệt
đới Việt - Nga.
Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 02/2023 đến tháng 08/2023.
9
3.3.
Nội dung nghiên cứu
-
Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic khả năng sinh tổng hợp GABA;
-
Định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn bằng sinh học phân tử;
-
Khảo sát các điều kiện lên men sinh tổng hợp GABA của chủng tuyển chọn.
3.4.
Môi trường nghiên cứu
Môi trường MRS (g/l): glucose (20); cao thịt (10); pepton (10); cao nấm men
(5); MgSO
4
.7H
2
O (0,2); MnSO
4
.H
2
O (0,05); Sodium acetate (5); K
2
HPO
4
.3H
2
O (2),
Tween 80 (1); Triamonium citrate (2); pH = 6,5-6,8.
Môi trường sinh tổng hợp GABA MRSS (g/l): glucose (20); cao thịt (10);
pepton (10); cao nấm men (5); MgSO
4
.7H
2
O (0,2); MnSO
4
.H
2
O (0,05); Sodium
acetate (5); Monosodium glutamate (50); pH = 6,5.
Môi trường M1: MRS (g/l): Peptone (10); cao nấm men (5); cao thịt (10);
glucose (20); potassium phosphate (2); sodium acetate (5); magnesium sulphate (0,2);
manganese sulphate (0,05); tween 80 (1,08); ammomium citrate (2); pH 6,5 ± 0,2.
Môi trường M2 (g/l): Glucose (20); K
2
HPO
4
(2); CH
3
COONa (5); diamonium
hydrogen citrate (2); MgSO
4
(0,2); MnSO
4
(0,04); tween 80 (1); yeast extract (50,1).
Môi trường M3 (g/l): Glucose (25); cao nấm men (6,25); peptone (6,25);
MgSO
4
.7H
2
O (0,2); MnSO
4
.4H
2
O (0,05); tween 80 (2).
Môi trường M4 (g/l): Glucose (40); cao nấm men (5); peptone (10);
MgSO
4
.7H
2
O (0,2); K
2
HPO
4
(2).
một số môi trường nghiên cứu khác.
3.5.
Phương pháp nghiên cứu
3.5.1.
Phương pháp bố trí thí nghiệm
Khảo sát điều kiện lên men sinh tổng hợp GABA của chủng tuyển chọn
3.5.1.1.
Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp
Các chủng vi khuẩn lactic hoạt tính sinh enzyme glutamte decarboxylase
được hoạt hóa trong môi trường MRS trong 48 giờ. Sau đó hút 5% giống vào các môi
trường dịch thể M1, M2, M3, M4 bổ sung 1% glutamate. Xác định mật độ tế bào
10
bằng cách đo OD 600 nm dịch nuôi cấy ly tâm ở 15000 rpm/15 phút/4℃, loại bỏ
cặn thu dịch phía trên. Dịch thu được đem định lượng bằng phương pháp quang phổ
để xác định hàm lượng GABA.
3.5.1.2.
Lựa chọn nhiệt độ nuôi cấy thích hợp
Cấy 5% thể tích giống nuôi cấy trong môi trường dịch thể thích hợp các
nhiệt độ từ 20℃ đến 55℃, bước nhảy 5℃. Sau 24 giờ xác định OD 600 nm để xác
định mật độ tế bào dịch nuôi cấy ly tâm 15000 rpm/15 phút/4℃, loại bỏ cặn thu
dịch phía trên. Dịch thu được đem định lượng bằng phương pháp quang phổ để xác
định hàm lượng GABA.
3.5.1.3.
Lựa chọn pH nuôi cấy thích hợp
Các chủng vi khuẩn được nuôi trên môi trường nhiệt độ thích hợp với 5%
giống trong khoảng pH khác nhau từ pH 4 đến pH 8, bước nhảy là 1. Sau 24 giờ xác
định OD 600 nm để xác định mật độ tế bào dịch nuôi cấy ly tâm 15000 rpm/15
phút/4℃, loại bỏ cặn thu dịch phía trên. Dịch thu được đem định lượng bằng phương
pháp quang phổ để xác định hàm lượng GABA.
3.5.1.4.
Lựa chọn tỷ lệ giống thích hợp
Các chủng vi khuẩn được nuôi trên môi trường, pH, nhiệt độ thích hợp với tỷ
lệ giống cấy 0,5; 1; 3; 5; 7; 10%. Sau 24 giờ xác định OD 600 nm để xác định mật độ
tế bào dịch nuôi cấy ly m 15000 rpm/15 phút/4℃, loại bỏ cặn thu dịch phía
trên. Dịch thu được đem định ợng bằng phương pháp quang phổ để xác định hàm
lượng GABA.
3.5.1.5.
Lựa chọn nguồn Nitơ thích hợp
Các chủng vi khuẩn được nuôi trên môi trường thích hp với nguồn nitơ cao
men được thay thế bởi các nguồn nitơ khác nhau như: meat extract, pepton, tryptone,
urea, NH
4
+
, NO
2
-
, NO
3
-
. Sau 24 giờ xác định OD 600 nm để xác định mật độ tế bào
dịch nuôi cấy ly tâm 15000 rpm/15 phút/4℃, loại bỏ cặn thu dịch phía trên. Dịch
thu được đem định lượng bằng phương pháp quang phổ để xác định hàm lượng
GABA.
11
3.5.1.6.
Lựa chọn nguồn Carbon thích hợp
Các chủng vi khuẩn được nuôi trên môi trường thích hợp với nguồn glucose
được thay thế bằng các nguồn carbon các dạng khác nhau như: galactose,
saccharose, maltose, mannitol lactose. Sau 24 giờ xác định OD 600 nm để xác
định mật độ tế bào và dịch nuôi cấy ly tâm 15000 rpm/15 phút/4℃, loại bỏ cặn thu
dịch phía trên. Dịch thu được đem định lượng bằng phương pháp quang phổ để xác
định hàm lượng GABA.
3.5.1.7.
Lựa chọn tỷ lệ Glutamate thích hợp
Các chủng vi khuẩn được nuôi môi trường thích hợp với tỷ lệ glutamate khác
nhau từ 3 8%, ớc nhảy 1. Sau 24 giờ xác định OD 600 nm để xác định mật độ
tế bào dịch nuôi cấy ly m 15000 rpm/15 phút/4℃, loại bỏ cặn thu dịch phía
trên. Dịch thu được đem định lượng bằng phương pháp quang phổ để xác định hàm
lượng GABA.
3.5.1.8.
Lựa chọn thời gian nuôi cấy thích hợp
Các chủng vi khuẩn được nuôi môi trường thích hợp với thời gian nuôi cấy
khác nhau từ 24 96 giờ, bước nhảy là 24. Sau mỗi 24, 48, 72, 96 gixác định OD
600 nm để xác định mật độ tế bào và dịch nuôi cấy ly tâm 15000 rpm/15 phút/4℃,
loại bỏ cặn thu dịch phía trên. Dịch thu được đem định lượng bằng phương pháp
quang phổ để xác định hàm lượng GABA.
3.5.2.
Phương pháp phân tích thí nghiệm
3.5.2.1.
Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic khả năng sinh tổng hợp GABA cao
Các chủng vi khuẩn lactic được hoạt hóa trên môi trường MRS thạch sau 48
giờ. Sau đó sẽ được cấy chuyển sang bình tam giác thủy tinh chứa môi trường MRSS
bổ sung 1% glutamate tại 37℃ trong 48 giờ. Dịch nuôi cấy được đem đi ly tâm
15000 rpm/15 phút/ 4℃, sau đó loại bỏ cặn thu dịch phía trên. Dịch thu được đem
định tính bằng phương pháp sắc ký bản mỏng TLC.
12
3.5.2.2.
Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn
được tuyển chọn
Quan sát hình thái khuẩn lạc: Các chủng vi khuẩn lactic thuần khiết được cấy
ria ba pha trên môi trường MRS thạch trong 72 giờ 37℃. Sau đó tiến hành quan sát
đặc điểm hình thái khuẩn lạc theo các tiêu chí như: màu sắc, độ bóng…
Hình thái tế bào: Các chủng được tinh sạch cấy ria ba pha trên môi trường đĩa
thạch MRS trong 48 giờ 37℃. Sau đó tiến hành nhuộm Gram để quan sát hình thái
tế bào.
3.5.2.3.
Định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn bằng phương pháp sinh học phân
tử
Tách chiết DNA từ vi khuẩn: thực hiện phương pháp của Gabor cs., 2003).
Xây dựng y phát sinh chủng loại: y phát sinh được y dựng theo Kimura
(1980), sử dụng phương pháp của Saitou và Nei (1987).
3.5.2.4.
Phương pháp định tính GABA bằng sắc bản mỏng TLC (Thin layer
chrotomagraphy)
Phương pháp xác định được tiến hành theo phương pháp sắc bản mỏng
TLC (Qiucs., 2010).
3.5.2.5.
Phương pháp định lượng GABA bằng phương pháp quang ph
Phương pháp xác định được tiến hành theo phương pháp quang ph (Su cs.,
2003).
Hóa chất: GABA (Sigma), ethanol (Merck), axit boric (Merck), muối natri
borat, acetone (Merck).
Pha đệm borat:
-
Dung dịch A: Dung dịch axit boric 0,2M: cân 12,404 g H
3
BO
3
hòa tan
định mức đến 1000 ml.
-
Dung
dịch
B:
Dung
dịch
muối
natri
borat
0,05M:
cân
19,018
g
Na
2
B
4
O
7
.10H
2
O hòa tan và định mức đến 1000 ml.
Trộn 9,4 ml dung dịch A 0,6 ml dung dịch B thu được đệm borat pH = 7,09.
13
Dựng đường chuẩn GABA:
GABA được sấy khô 105℃ trong 2 giờ, cân 0,2 g GABA trong 10 ml nước
cất được stock solution 20 mg/ml. Hút 1 ml stock solution 20 mg/ml vào 9 ml nước
cất được stock solution 1 nồng độ 2 mg/ml. Dùng stock solution 1 để pha loãng
thành các dãy nồng độ sau từ 0; 0,2; 0,4;…; 2.
-
Cách dựng đường chuẩn:
+ Hút 0,5 ml dung dịch GABA các nồng độ khác nhau cho vào các ống
nghiệm định lượng
+ Bổ sung 3 ml dung dịch đêm borat và 0,5 ml dung dịch nihydrin (2% w/v
nihydrin trong acetone)
+ Đun sôi hỗn hợp trong vòng 20 phút tại 85 ± 5℃
+ Làm lạnh nhanh trong nước đá 5 phút
+ Để hỗn hợp nhiệt độ bằng nhiệt độ phòng, bổ sung 2 ml ethanol 50%
+ Đo hỗn hợp OD 570 nm, dùng Blank mẫu nồng độ 0 mg/ml
+ Lặp lại thí nghiệm 2 lần để thu được giá trị OD1 và OD2
Từ kết quả đo OD, ta thu được phương trình tuyến tính y = ax + b với x
nồng độ GABA (mg/ml), y là giá trị OD 570 nm.
Mẫu thí nghiệm: Chấm 500 μl các mẫu thí nghiệm lên bản TLC và chạy trong
dung môi như định tính. Sau đó cạo lớp bột trên bản TLC cho vào các ống định ợng
chứa 500 μl nước cất, ly m thu dịch trong làm tương tự các bước tiếp theo n
mẫu đối chứng. Sau đó, dựa vào phương trình tuyến tính ta tính được m lượng
GABA có trong các mẫu thí nghiệm.
14
IV.
DỰ KIẾN KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯC
4.1.
Kết quả tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp GABA
4.2.
Kết quả định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn bằng phương pháp sinh học
phân tử
4.3.
Kết quả khảo sát điều kiện lên men sinh tổng hợp GABA của chủng tuyển
chọn

Preview text:

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM    
ĐỀ CƯƠNG KHÓA LUẬN
TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN LACTIC VÀ
KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH TỔNG HỢP
GAMMA-AMINOBUTYRIC ACID
Hà Nội – Tháng 03/2023
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM   
ĐỀ CƯƠNG KHÓA LUẬN
TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN LACTIC VÀ
KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH TỔNG HỢP
GAMMA-AMINOBUTYRIC ACID Người thực hiện : Nguyễn Thị Mai Mã sinh viên : 642546 Khóa : 64 Ngành
: Công nghệ thực phẩm
Giáo viên hướng dẫn : TS. Vũ Duy Nhàn
TS. Vũ Quỳnh Hương
Địa điểm thực tập
: Phân viện Công nghệ sinh học
Trung tâm Nhiệt đới Việt - Nga
Hà Nội – Tháng 03/2023
THÔNG TIN VỀ SINH VIÊN THỰC HIỆN KHÓA LUẬN
1. Họ và tên sinh viên: Nguyễn Thị Mai Mã SV: 642546 Tel: 0356515891 Email: nmai01@gmail.com
2. Địa chỉ liên hệ: Ký túc xá C5 – Học Viện Nông nghiệp Việt Nam
3. Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm 4. Lớp: K64CNTPA Khóa: 64
5. Giáo viên hướng dẫn 1: TS. Vũ Duy Nhàn
Giáo viên hướng dẫn 2: TS. Vũ Quỳnh Hương
6. Địa điểm thực tập: Phòng Sinh hóa – Phân viện Công nghệ sinh học – Trung tâm Nhiệt đới Việt - Nga
Sinh viên thực hiện
(Ký và ghi rõ họ tên) Nguyễn Thị Mai i MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................... iv
I. ĐẶT VẤN ĐỀ ......................................................................................................... 1
1.1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................ 1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài ..................................................................... 2
1.2.1. Mục tiêu ........................................................................................................ 2
1.2.2. Yêu cầu ......................................................................................................... 2
II. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ................................................... 3
2.1. Giới thiệu về vi khuẩn lactic .......................................................................... 3
2.2. Tổng quan về γ -Aminobutyric acid (GABA) .............................................. 3
2.2.1. Giới thiệu về GABA ..................................................................................... 3
2.2.2. Hình dạng và cấu trúc của GABA ................................................................ 3
2.2.3. Chức năng của GABA .................................................................................. 4
2.2.4. Sinh tổng hợp GABA ................................................................................... 4
2.2.5. Các nguồn sinh tổng hợp GABA .................................................................. 5
2.2.6. Tình hình nghiên cứu về GABA................................................................... 6
III. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ........................................................................................................................... 8
3.1. Đối tượng nghiên cứu..................................................................................... 8
3.1.1. Nguyên liệu .................................................................................................. 8
3.1.2. Hoá chất, thiết bị và dụng cụ ........................................................................ 8
3.2. Phạm vi nghiên cứu ........................................................................................ 8
3.3. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 9
3.4. Môi trường nghiên cứu .................................................................................. 9
3.5. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 9
3.5.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm ..................................................................... 9
3.5.2. Phương pháp phân tích thí nghiệm ............................................................. 11
IV. DỰ KIẾN KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC .................................................................. 14
4.1. Kết quả tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp GABA ............ 14 ii
4.2. Kết quả định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn bằng phương pháp sinh
học phân tử .......................................................................................................... 14
4.3. Kết quả khảo sát điều kiện lên men sinh tổng hợp GABA của chủng
tuyển chọn ............................................................................................................ 14
V. KẾ HOẠCH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI .................................................................. 15
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 16 iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt
Tiếng anh hoặc tên khoa học GABA Gamma – aminobutyric acid GAD Glutamic acid decarboxylase LAB Lactic acid bacteria MSG Monosodium glutamate OD Optical Density TLC Thin layer chromatography iv I. ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển không ngừng của khoa học
kỹ thuật và nhu cầu cuộc sống ngày càng nâng cao, vấn đề sức khỏe đời sống con
người ngày càng được chú trọng hơn cũng như nhu cầu sử dụng các thực phẩm chức
năng ngày một tăng lên, việc nghiên cứu và tìm ra các hợp chất có hoạt tính sinh học
quan trọng ứng dụng trong thực phẩm chức năng được nhiều sự quan tâm của các nhà
khoa học. Trong đó, Gamma-aminobutyric acid (GABA) là một hợp chất được nghiên
cứu rất nhiều trong thời gian gần đây. GABA là một amino acid có tác dụng giảm
hoạt động của các neuron thần kinh và ức chế sự lan truyền của các tế bào dẫn truyền,
từ đó giảm stress, căng thẳng, chứng mất ngủ và còn giảm thiểu nguy cơ mắc các
bệnh về tim mạch, tiểu đường và cholesterol trong máu (Jin và cs., 2013).
GABA được tổng hợp từ nhiều nguồn khác nhau, trong đó nhiều nghiên cứu
tập trung về sinh tổng hợp GABA từ vi sinh vật do chu trình phát triển ngắn, quá trình
nuôi cấy dễ thực hiện, môi trường nuôi cấy rẻ và dễ kiếm, đặc biệt là từ vi khuẩn
lactic (LAB) (Lê Thị Huyền Trang và Đỗ Thị Bích Thủy, 2020). LAB là nhóm vi
sinh vật được ứng dụng nhiều trong sản xuất và bảo quản thực phẩm, đặc biệt trong
các sản phẩm lên men truyền thống như lên men sữa, thịt (Dương Minh Khải, 2013).
LAB không chỉ tạo ra acid lactic, ethanol, hợp chất thơm, bacteriocin (And và
Hoover, 2003) mà hơn hết LAB đã được các nhà khoa học nghiên cứu ứng dụng để
lên men và thu được hàm lượng lớn GABA. Nhiều công trình nghiên cứu trên thế
giới liên quan đến việc tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng
hợp GABA cao và tối ưu hóa điều kiện lên men sinh tổng hợp GABA (Li và cs., 2010).
Một số chủng LAB sinh tổng hợp GABA đã được nghiên cứu như
Lactobacillus, Lactococcus, Lactobacillus Brevis… được phân lập từ nhiều loại thực
phẩm lên men. Chủng Lactococcus lactis subsp. lactis được phân lập từ kim chi sinh
tổng hợp GABA với nồng độ cao được xác định là 3,68 g/l trong môi trường MRS
lỏng với 1% monosodium glutamate (MSG) (Lu và cs., 2008). Trong shochu của 1
Nhật Bản, các acid glutamic tự do có nồng độ 10,50 mM chuyển đổi thành GABA có
nồng độ 10,18 mM bởi Lactobacillus brevis IFO-12005 (Yokoyama và cs., 2002).
Chủng Lactobacillus brevis NCL 912 phân lập từ paocai Trung Quốc đã thu được
nồng độ GABA trong dịch lên men tối ưu là 149,05 mM (Li và cs., 2008).
GABA được sản xuất từ LAB có hàm lượng cao, an toàn cho người sử dụng.
Bên cạnh LAB thì các yếu tố lên men khác nhau cũng ảnh hưởng đến tỷ lệ GABA
được sinh tổng hợp khác nhau. Trong đó các yếu tố phổ biến và cần thiết là pH, nhiệt
độ, thời gian nuôi cấy, cơ chất tham gia tổng hợp GABA… (Dhakal và cs., 2012).
Mặc dù nhiều nghiên cứu về chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ các nguồn
thực phẩm và xác định là sinh tổng hợp GABA, tuy nhiên nghiên cứu thêm về các
đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn lactic cũng như điều kiện sinh tổng hợp
GABA là điều cần thiết, vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài: “Tuyển chọn chủng vi
khuẩn lactic và khảo sát điều kiện lên men sinh tổng hợp gamma – aminobutyric acid”.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 1.2.1. Mục tiêu
Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp được gamma
aminobutyric acid (GABA) và xác định được các điều kiện lên men sinh tổng hợp GABA. 1.2.2. Yêu cầu
- Tuyển chọn được các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp GABA;
- Định danh được chủng vi sinh vật tuyển chọn;
- Khảo sát được các điều kiện lên men sinh tổng hợp GABA của chủng tuyển chọn. 2
II. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
2.1. Giới thiệu về vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, thường
không di động, không kháng acid, không có cytochrome và catalase âm tính (ngoại
trừ Fructobacillus). Các LAB bao gồm cả dạng cầu khuẩn và trực khuẩn. LAB từ lâu
đã được sử dụng như các chủng vi khuẩn khởi đầu cho quá trình lên men của nhiều
loại thực phẩm và đồ uống nhờ vai trò của chúng trong việc tạo hương vị, phát triển
mùi thơm và làm chậm sự hư hỏng (De Vuyst và Degeest, 1999). Trong y học, nhóm
vi khuẩn lactic sản xuất ra các loại kháng sinh được dùng làm thuốc để chữa các bệnh
về nhiễm khuẩn, nhiễm nấm… (Lahtinen và cs., 2011).
2.2. Tổng quan về γ -Aminobutyric acid (GABA)
2.2.1. Giới thiệu về GABA
GABA là một amino acid khá phổ biến trong tự nhiên. GABA được biết đến
đầu tiên như là một thành phần trong mô củ khoai tây, được phân bố rộng rãi trong
tự nhiên, bao gồm động vật, thực vật và vi sinh vật. GABA có vai trò quan trọng trong
hệ thống thần kinh trung ương (Abe và cs., 1995). GABA cho thấy hiệu quả cải thiện
rối loạn giấc ngủ liên quan đến việc dùng rượu. GABA có thể hạ huyết áp, có tác
dụng lợi tiểu, chống tiểu đường, có vai trò trong việc kiểm soát sự lo lắng, cơn đau
của cơ thể, giảm hàm lượng lipid trong huyết thanh và ức chế sự tăng sinh tế bào ung
thư, cải thiện trí nhớ và khả năng học tập (Dhakal và cs., 2012).
Năm 1883, GABA lần đầu tiên được tổng hợp và được biết đến như một sản
phẩm trao đổi chất thực vật và vi khuẩn (Cooper và cs., 2003). Đến năm 1950, GABA
được phát hiện là một phần không thể thiếu của hệ thần kinh trung ương của động vật
có vú (Cooper và cs., 2003).
2.2.2. Hình dạng và cấu trúc của GABA
Gamma – aminobutyric acid là một amino acid không tham gia cấu tạo nên protein.
Tên IUPAC: 4 – aminobutanoic acid
Công thức phân tử: C4H9NO2 3
Khối lượng phân tử: 103,12 g/mol
Điểm nóng chảy: 203,7 ℃ (477 K, 399 ℉)
GABA là chất rắn, có khả năng hòa tan trong nước với độ tan khoảng 1300mg/ml ở 25℃.
GABA có cấu trúc 4C, bao gồm nhóm amino (NH2) nhận proton và nhóm acid
cacboxylic (COOH) cho proton, và gốc R, chủ yếu được tìm thấy ở dạng lưỡng cực.
Trong trạng thái khí, GABA có dạng cuộn xoắn cao do lực tĩnh điện giữa hai nhóm
chứng năng. Trong trạng thái rắn, nó lại được tìm thấy ở dạng cấu trúc thẳng, cấu
hình trans ở nhóm amino và cấu trúc cis ở cuối nhóm cacboxyl, đây là do tương tác
với các phân tử lân cận. Ở trạng thái lỏng, GABA tồn tại ở cả dạng gấp khúc và thẳng.
Điều này giúp GABA có thể thực hiện nhiều chức năng sinh học quan trọng (Nguyễn Thị Anh Đào, 2018).
2.2.3. Chức năng của GABA
GABA là một loại amino acid không thể thiếu cho cơ thể, cần thiết để duy trì
sự hoạt động bình thường của não bộ, đặc biệt là các neuron thần kinh. Chất này có
khả năng ngăn chặn sự hoạt động thái quá của các neuron thần kinh tại hệ thống thần
kinh trung ương và ức chế sự lan truyền của tế bào dẫn truyền để tăng cường cảm
giác thư thái trong hệ thần kinh. Đây là chất ức chế dẫn truyền tự nhiên được cơ thể
sản sinh, có tác dụng giúp thư giãn thần kinh và có giấc ngủ ngon. GABA cùng với
niacinamide và inositol, có khả năng giảm bớt căng thẳng và lo âu tới vùng thần kinh
trung ương bằng việc chiếm giữ các vùng tiếp nhận thông tin của các tế bào này,
khống chế các vùng tiếp nhận tin. Do đó, GABA giúp làm giảm căng thẳng, giúp ngủ
ngon, giảm huyết áp và giúp an thần (Hayakawa và cs., 2004).
2.2.4. Sinh tổng hợp GABA
Con đường sinh tổng hợp GABA được mô tả như sau: L- glutamate được tạo
ra từ alpha- ketoglutarate bằng các phản ứng chuyển hóa và được xúc tác bởi enzym
glutamate dehydrogenase, sau đó diễn ra quá trình các cơ chất L- glutamte dưới sự
xúc tác của enzyme glutamte decarboxylase (GAD). Hoạt động của enzyme GAD
cần một cofactor là pyridoxal 5’- phosphate (PLP) (Komatsuzaki và cs., 2007). 4
Sản xuất GABA bằng vi khuẩn lactic thì monosodium glutamate (MSG) được
xem như một cơ chất quan trọng (Kook và cs., 2010). MSG là một dạng muối của
glutamic acid. MSG trong tự nhiên sinh ra từ amino acid mà được tìm thấy trong đa
số các thực phẩm như phomai, sữa, thịt, cá và nhiều loại rau khác nhau.
Cơ chất chính trong quá trình hình thành GABA chính là glutamate, sau đó
GABA sinh ra sẽ được chuyển hóa tiếp tạo thành succinic semialdehyde và cuối cùng
tạo thành sản phẩm GHB (ở dịch tế bào) và succinate (ty thể lạp). Ngoài ra ta cũng
có thể thu được glutamate từ con đường dị hóa lysine (Bouché và cs., 2004).
2.2.5. Các nguồn sinh tổng hợp GABA
2.2.5.1. Tách chiết từ tự nhiên
Trong tự nhiên, GABA được phân bố rộng rãi, đặc biệt là trong não của các
động vật có vú. Ngoài ra, các thụ thể GABA còn được tìm thấy ở con người trong
nhiều cơ quan và mô, bao gồm não, hệ thống thần kinh trung ương, phổi, gan, đường
tiêu hóa, tinh trùng, tinh hoàn, tuyến vú và các tế bào khối u gan. Một số loại thực vật
và ngũ cốc cũng chứa một lượng nhỏ GABA như mầm cám gạo, giá đỗ, đậu tương,
cà chua, chuối, rau bina, lá chè xanh… GABA cũng được tìm thấy ở một số vi sinh
vật như vi khuẩn lactic, nấm men, nấm mốc (Kim và cs., 2009).
Mặc dù GABA được tìm thấy với hàm lượng lớn trong não của động vật có
vú, nhưng không thể sử dụng những nguồn này để sản xuất GABA. Hàm lượng
GABA sinh tổng hợp được tìm thấy trong thực vật lại thấp. Vì vậy, sử dụng vi sinh
vật để sản xuất GABA đem lại nhiều ưu điểm hơn cả.
2.2.5.2. Sinh tổng hợp GABA từ vi khuẩn
GABA chủ yếu được hình thành bằng phản ứng 𝛼 – decarboxylation không
nghịch đảo của axit L – glutamic hoặc muối của nó, được xúc tác bởi enzyme glutamic
acid decarboxylase (GAD). Enzyme này được tìm thấy ở vi khuẩn như Lactobacillus
(Bertoldi và cs., 1999), Escherichia (Rice và cs., 1993), Streptococcus, Aspergillus
(Kato và cs., 2002) và Neurospora (Kubicek và cs., 1979. Tuy nhiên vi khuẩn
Lactobacillus là loại phổ biến nhất để sản xuất GABA vì vi khuẩn lactic có những
hoạt tính sinh lý đặc biệt và có thể xem như khá an toàn trong quá trình sử dụng vào 5
mục đích chăm sóc sức khỏe cho con người.
GABA được sản xuất từ vi khuẩn lactic có bản chất từ tự nhiên và an toàn cho
sức khỏe. Nhiều sản phẩm được làm tăng hàm lượng GABA bằng sử dụng GABA
sản xuất từ vi khuẩn lactic được phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống như kim
chi, pho mai, sữa chua (Kim và cs., 2009; Li và cs., 2008). Tiềm năng sản xuất GABA
của LAB được nhiều nghiên cứu như sữa chua, pho mai (Park và Oh, 2007; Rizzello
và cs., 2008), kim chi (Park và Oh, 2007) và paocai (Li và cs., 2008). Việc sàng lọc
vi khuẩn lactic dựa vào khả năng tổng hợp GABA có thể đem lại triển vọng mới cho
quá trình sản xuất GABA.
2.2.6. Tình hình nghiên cứu về GABA
2.2.6.1. Tình hình nghiên cứu về GABA trên thế giới
Tại Hàn Quốc, nhóm tác giả Lee (2013) đã nghiên cứu quá trình sản xuất
GABA bằng cố định GAD. Các tác giả đã phát triển công nghệ sản xuất GABA bằng
cách cố định GAD phân lập từ Escherichia coli. Thông qua việc nghiên cứu hoạt
động của enzyme cụ thể và đặc tính phản ứng, acid glutamic được ưu tiên chọn hơn
monosodium glutamate (MSG) để làm cơ chất chính cho GAD cố định.
Nhóm tác giả Lacroix và cộng sự (2013) đã nghiên cứu khả năng sản xuất
GABA của các chủng Lactococcus được phân lập từ phô mai. Họ đã phát hiện ra 9
chủng trong tổng số 50 chủng riêng biệt trong hai mẫu phô mai có khả năng sản xuất
GABA. Trong đó, ULAAC – A13 và ULAAC – A23 có khả năng sản xuất GABA
lên đến 50 mg/300 ml sữa lên men. Nghiên cứu này cho thấy các chủng vi sinh vật
sản xuất GABA trong phô mai cứng và phô mai mềm dưới những điều kiện sản xuất GABA phổ biến.
Nhóm tác giả Jannoey (2010) ở Thái Lan cũng đã nghiên cứu quá trình tích
lũy GABA ở gạo trong suốt thời gian nảy mầm. Theo các tác giả, dù các giống gạo
có hàm lượng axit glutamic khác nhau, nhưng hàm lượng GABA trong gạo không có
sự chênh lệch nhiều (khoảng 0,05%). Trong quá trình nảy mầm, hàm lượng GABA
trong lá và hạt gạo đều tăng đáng kể. Tuy nhiên, lá có hàm lượng GABA cao hơn gấp
2-3 lần so với hạt gạo, đối với tất cả các giống gạo. Từ nghiên cứu có thể thấy gạo là 6
nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất GABA.
2.2.6.2. Tình hình nghiên cứu về GABA ở Việt Nam
Đề tài nghiên cứu của Trịnh Tất Cường (2012) về nghiên cứu quy trình sản
xuất GABA từ dịch lên men cám gạo bằng Lactobacillus để ứng dụng làm thực phẩm
chức năng đã thu được những thành công nhất định. Đề tài đã xây dựng được quy
trình sản xuất GABA từ lên men dịch cám gạo bằng Lactobacillus plantarum KLEPT.
Hàm lượng GABA thu được tương đối cao, đạt tới 660mM.
Quách Thị Việt và cộng sự (2013) đã có nghiên cứu trên chủng vi khuẩn
Lactobacillus brevis NCTH24 có khả năng sinh tổng hợp GABA ứng dụng trong Bio-
yogurt. Chủng vi khuẩn này được đánh giá là có khả năng chuyển hóa glutamate
thành GABA cũng như có các tính chất probiotic như khả năng sống sót trong môi
trường dạ dày và dịch ruột nhân tạo.
Theo nghiên cứu của Cung Thị Tố Quỳnh và cộng sự (2012) về xây dựng quy
trình sản xuất gạo mầm (gạo GABA) từ gạo lứt nảy mầm. Kết quả nghiên cứu cho
thấy có thể sản xuất được gạo GABA từ nguồn nguyên liệu gạo lứt Huyết Rồng và
Jacmine của Việt Nam. Hàm lượng GABA từ gạo mầm thu được khá lớn, gấp 5 lần
(140 ppm) so với gạo lứt nguyên liệu. Đề tài đã mở ra một hướng ứng dụng cho việc
sản xuất các loại gạo dinh dưỡng có giá trị kinh tế cao tại Việt Nam. 7
III. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng nghiên cứu 3.1.1. Nguyên liệu
Các chủng vi khuẩn lactic trong bộ sưu tập giống tại Phân viện Công nghệ sinh
học – Trung tâm Nhiệt đới Việt - Nga.
3.1.2. Hoá chất, thiết bị và dụng cụ
3.1.2.1. Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong quá trình nuôi cấy, định lượng, được sản xuất từ
các hãng lớn và tinh khiết như: Merck, Sigma, Himedia…
3.1.2.2. Thiết bị
Các thiết bị máy móc tại Phân viện Công nghệ sinh học bao gồm:
- Máy lắc ổn nhiệt (Tây Ban Nha)
- Cân điện tử (Trung Quốc)
- Nồi hấp khử trùng (Sanyo, Nhật) - Tủ sấy (Sanyo, Nhật) - Tủ cấy (Sanyo, Nhật) - Máy li tâm (Đức)
- Kính hiển vi quang học BX51 (Olympus, Nhật) - Máy đo quang phổ (Mỹ)
Cùng các thiết bị liên quan khác.
3.1.2.3. Dụng cụ
Đĩa petri, pipette các loại, ống eppendorf, đèn cồn, bình tam giác các loại, ống
nghiệm, bình định mức, que cấy…
3.2. Phạm vi nghiên cứu
Địa điểm: Phòng Sinh hóa – Phân viện Công nghệ sinh học – Trung tâm Nhiệt đới Việt - Nga.
Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 02/2023 đến tháng 08/2023. 8
3.3. Nội dung nghiên cứu
- Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp GABA;
- Định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn bằng sinh học phân tử;
- Khảo sát các điều kiện lên men sinh tổng hợp GABA của chủng tuyển chọn.
3.4. Môi trường nghiên cứu
Môi trường MRS (g/l): glucose (20); cao thịt (10); pepton (10); cao nấm men
(5); MgSO4.7H2O (0,2); MnSO4.H2O (0,05); Sodium acetate (5); K2HPO4.3H2O (2),
Tween 80 (1); Triamonium citrate (2); pH = 6,5-6,8.
Môi trường sinh tổng hợp GABA MRSS (g/l): glucose (20); cao thịt (10);
pepton (10); cao nấm men (5); MgSO4.7H2O (0,2); MnSO4.H2O (0,05); Sodium
acetate (5); Monosodium glutamate (50); pH = 6,5.
Môi trường M1: MRS (g/l): Peptone (10); cao nấm men (5); cao thịt (10);
glucose (20); potassium phosphate (2); sodium acetate (5); magnesium sulphate (0,2);
manganese sulphate (0,05); tween 80 (1,08); ammomium citrate (2); pH 6,5 ± 0,2.
Môi trường M2 (g/l): Glucose (20); K2HPO4 (2); CH3COONa (5); diamonium
hydrogen citrate (2); MgSO4 (0,2); MnSO4 (0,04); tween 80 (1); yeast extract (50,1).
Môi trường M3 (g/l): Glucose (25); cao nấm men (6,25); peptone (6,25);
MgSO4.7H2O (0,2); MnSO4.4H2O (0,05); tween 80 (2).
Môi trường M4 (g/l): Glucose (40); cao nấm men (5); peptone (10); MgSO4.7H2O (0,2); K2HPO4 (2).
Và một số môi trường nghiên cứu khác.
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
Khảo sát điều kiện lên men sinh tổng hợp GABA của chủng tuyển chọn
3.5.1.1. Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp
Các chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính sinh enzyme glutamte decarboxylase
được hoạt hóa trong môi trường MRS trong 48 giờ. Sau đó hút 5% giống vào các môi
trường dịch thể M1, M2, M3, M4 bổ sung 1% glutamate. Xác định mật độ tế bào 9
bằng cách đo OD 600 nm và dịch nuôi cấy ly tâm ở 15000 rpm/15 phút/4℃, loại bỏ
cặn thu dịch phía trên. Dịch thu được đem định lượng bằng phương pháp quang phổ
để xác định hàm lượng GABA.
3.5.1.2. Lựa chọn nhiệt độ nuôi cấy thích hợp
Cấy 5% thể tích giống nuôi cấy trong môi trường dịch thể thích hợp và ở các
nhiệt độ từ 20℃ đến 55℃, bước nhảy là 5℃. Sau 24 giờ xác định OD 600 nm để xác
định mật độ tế bào và dịch nuôi cấy ly tâm ở 15000 rpm/15 phút/4℃, loại bỏ cặn thu
dịch phía trên. Dịch thu được đem định lượng bằng phương pháp quang phổ để xác định hàm lượng GABA.
3.5.1.3. Lựa chọn pH nuôi cấy thích hợp
Các chủng vi khuẩn được nuôi trên môi trường và nhiệt độ thích hợp với 5%
giống trong khoảng pH khác nhau từ pH 4 đến pH 8, bước nhảy là 1. Sau 24 giờ xác
định OD 600 nm để xác định mật độ tế bào và dịch nuôi cấy ly tâm ở 15000 rpm/15
phút/4℃, loại bỏ cặn thu dịch phía trên. Dịch thu được đem định lượng bằng phương
pháp quang phổ để xác định hàm lượng GABA.
3.5.1.4. Lựa chọn tỷ lệ giống thích hợp
Các chủng vi khuẩn được nuôi trên môi trường, pH, nhiệt độ thích hợp với tỷ
lệ giống cấy 0,5; 1; 3; 5; 7; 10%. Sau 24 giờ xác định OD 600 nm để xác định mật độ
tế bào và dịch nuôi cấy ly tâm ở 15000 rpm/15 phút/4℃, loại bỏ cặn thu dịch phía
trên. Dịch thu được đem định lượng bằng phương pháp quang phổ để xác định hàm lượng GABA.
3.5.1.5. Lựa chọn nguồn Nitơ thích hợp
Các chủng vi khuẩn được nuôi trên môi trường thích hợp với nguồn nitơ cao
men được thay thế bởi các nguồn nitơ khác nhau như: meat extract, pepton, tryptone, urea, NH + - -
4 , NO2 , NO3 . Sau 24 giờ xác định OD 600 nm để xác định mật độ tế bào
và dịch nuôi cấy ly tâm ở 15000 rpm/15 phút/4℃, loại bỏ cặn thu dịch phía trên. Dịch
thu được đem định lượng bằng phương pháp quang phổ để xác định hàm lượng GABA. 10
3.5.1.6. Lựa chọn nguồn Carbon thích hợp
Các chủng vi khuẩn được nuôi trên môi trường thích hợp với nguồn glucose
được thay thế bằng các nguồn carbon ở các dạng khác nhau như: galactose,
saccharose, maltose, mannitol và lactose. Sau 24 giờ xác định OD 600 nm để xác
định mật độ tế bào và dịch nuôi cấy ly tâm ở 15000 rpm/15 phút/4℃, loại bỏ cặn thu
dịch phía trên. Dịch thu được đem định lượng bằng phương pháp quang phổ để xác định hàm lượng GABA.
3.5.1.7. Lựa chọn tỷ lệ Glutamate thích hợp
Các chủng vi khuẩn được nuôi ở môi trường thích hợp với tỷ lệ glutamate khác
nhau từ 3 – 8%, bước nhảy là 1. Sau 24 giờ xác định OD 600 nm để xác định mật độ
tế bào và dịch nuôi cấy ly tâm ở 15000 rpm/15 phút/4℃, loại bỏ cặn thu dịch phía
trên. Dịch thu được đem định lượng bằng phương pháp quang phổ để xác định hàm lượng GABA.
3.5.1.8. Lựa chọn thời gian nuôi cấy thích hợp
Các chủng vi khuẩn được nuôi ở môi trường thích hợp với thời gian nuôi cấy
khác nhau từ 24 – 96 giờ, bước nhảy là 24. Sau mỗi 24, 48, 72, 96 giờ xác định OD
600 nm để xác định mật độ tế bào và dịch nuôi cấy ly tâm ở 15000 rpm/15 phút/4℃,
loại bỏ cặn thu dịch phía trên. Dịch thu được đem định lượng bằng phương pháp
quang phổ để xác định hàm lượng GABA.
3.5.2. Phương pháp phân tích thí nghiệm
3.5.2.1. Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp GABA cao
Các chủng vi khuẩn lactic được hoạt hóa trên môi trường MRS thạch sau 48
giờ. Sau đó sẽ được cấy chuyển sang bình tam giác thủy tinh chứa môi trường MRSS
bổ sung 1% glutamate tại 37℃ trong 48 giờ. Dịch nuôi cấy được đem đi ly tâm ở
15000 rpm/15 phút/ 4℃, sau đó loại bỏ cặn thu dịch phía trên. Dịch thu được đem
định tính bằng phương pháp sắc ký bản mỏng TLC. 11
3.5.2.2. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn
được tuyển chọn
Quan sát hình thái khuẩn lạc: Các chủng vi khuẩn lactic thuần khiết được cấy
ria ba pha trên môi trường MRS thạch trong 72 giờ ở 37℃. Sau đó tiến hành quan sát
đặc điểm hình thái khuẩn lạc theo các tiêu chí như: màu sắc, độ bóng…
Hình thái tế bào: Các chủng được tinh sạch cấy ria ba pha trên môi trường đĩa
thạch MRS trong 48 giờ ở 37℃. Sau đó tiến hành nhuộm Gram để quan sát hình thái tế bào.
3.5.2.3. Định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn bằng phương pháp sinh học phân tử
Tách chiết DNA từ vi khuẩn: thực hiện phương pháp của Gabor và cs., 2003).
Xây dựng cây phát sinh chủng loại: Cây phát sinh được xây dựng theo Kimura
(1980), sử dụng phương pháp của Saitou và Nei (1987).
3.5.2.4. Phương pháp định tính GABA bằng sắc ký bản mỏng TLC (Thin layer chrotomagraphy)
Phương pháp xác định được tiến hành theo phương pháp sắc ký bản mỏng TLC (Qiu và cs., 2010).
3.5.2.5. Phương pháp định lượng GABA bằng phương pháp quang phổ
Phương pháp xác định được tiến hành theo phương pháp quang phổ (Su và cs., 2003).
Hóa chất: GABA (Sigma), ethanol (Merck), axit boric (Merck), muối natri borat, acetone (Merck). Pha đệm borat:
- Dung dịch A: Dung dịch axit boric 0,2M: cân 12,404 g H3BO3 hòa tan và định mức đến 1000 ml.
- Dung dịch B: Dung dịch muối natri borat 0,05M: cân 19,018 g
Na2B4O7.10H2O hòa tan và định mức đến 1000 ml.
Trộn 9,4 ml dung dịch A và 0,6 ml dung dịch B thu được đệm borat pH = 7,09. 12
Dựng đường chuẩn GABA:
GABA được sấy khô ở 105℃ trong 2 giờ, cân 0,2 g GABA trong 10 ml nước
cất được stock solution 20 mg/ml. Hút 1 ml stock solution 20 mg/ml vào 9 ml nước
cất được stock solution 1 có nồng độ 2 mg/ml. Dùng stock solution 1 để pha loãng
thành các dãy nồng độ sau từ 0; 0,2; 0,4;…; 2.
- Cách dựng đường chuẩn:
+ Hút 0,5 ml dung dịch GABA ở các nồng độ khác nhau cho vào các ống nghiệm định lượng
+ Bổ sung 3 ml dung dịch đêm borat và 0,5 ml dung dịch nihydrin (2% w/v nihydrin trong acetone)
+ Đun sôi hỗn hợp trong vòng 20 phút tại 85 ± 5℃
+ Làm lạnh nhanh trong nước đá 5 phút
+ Để hỗn hợp có nhiệt độ bằng nhiệt độ phòng, bổ sung 2 ml ethanol 50%
+ Đo hỗn hợp OD 570 nm, dùng Blank là mẫu có nồng độ 0 mg/ml
+ Lặp lại thí nghiệm 2 lần để thu được giá trị OD1 và OD2
Từ kết quả đo OD, ta thu được phương trình tuyến tính y = ax + b với x là
nồng độ GABA (mg/ml), y là giá trị OD 570 nm.
Mẫu thí nghiệm: Chấm 500 μl các mẫu thí nghiệm lên bản TLC và chạy trong
dung môi như định tính. Sau đó cạo lớp bột trên bản TLC cho vào các ống định lượng
chứa 500 μl nước cất, ly tâm thu dịch trong và làm tương tự các bước tiếp theo như
mẫu đối chứng. Sau đó, dựa vào phương trình tuyến tính ta tính được hàm lượng
GABA có trong các mẫu thí nghiệm. 13
IV. DỰ KIẾN KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC
4.1. Kết quả tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp GABA
4.2. Kết quả định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn bằng phương pháp sinh học phân tử
4.3. Kết quả khảo sát điều kiện lên men sinh tổng hợp GABA của chủng tuyển chọn 14