-
Thông tin
-
Hỏi đáp
Đề cương phương pháp nghiên cứu dược liệu
Đề cương phương pháp nghiên cứu dược liệu
Môn: Răng hàm mặt (VLNK 01) 4 tài liệu
Trường: Đại học Y dược Huế 259 tài liệu
Thông tin:
Tác giả:
Preview text:
ĐỀ CƯƠNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU DƯỢC LIỆU
Câu 1- 4: học slide thầy Đức Bài tập:
Đề 1: Hợp chất X có công thức phân tử C2H4Br2. Phổ EIMS, 1D-NMR của X được cho dưới đây: a)
Biện luận để thiết lập cấu trúc của X ? b)
Gán các ion tương ứng với các píc tại m/z 190, 188, 186, 109, 107, 27 ? ĐÁP ÁN:
- Phổ 1H chỉ cho 1 tín hiệu cộng hưởng tại 3,5 chứng tỏ 4 proton của X tương đương từ
trường. Phổ 13C (khử tương tác) chỉ cho 1 tín hiệu cộng hưởng tại 30 chứng tỏ 2 cacbon của X
tương đương từ trường. Tín hiệu triplet trên phổ 13C (chưa khử tương tác) chứng tỏ cacbon thuộc
nhóm CH2. Vậy, cấu trúc của X là: Br-CH2-CH2-Br (1,2-dibromoethane)
- Xem xét các píc đồng vị và píc ion mảnh cho phép gán: m/z 190 [C 81 2H4 Br81Br]+, 188 [C 81 79 81 79 2H4
Br79Br]+, 186 [C2H4 Br79Br]+, 109 [C2H4 Br]+, 107 [C2H4 Br]+, 27 [C2H3]+
Đề 2: Hợp chất C3H5Br có một số đồng phân với các đặc điểm sau:
- Đồng phân A có phổ 1H NMR như sau:
- Đồng phân B có 3 píc trên phổ 13C NMR tại 32,6 (CH2); 118,8 (CH2) và 134,2 (CH).
- Đồng phân C có 2 píc trên phổ 13C NMR tại 12,0 (CH2); 16,8 (CH) với tỉ lệ cường độ 2:1.
Biện luận để thiết lập cấu trúc của A, B, C ? ĐÁP ÁN:
- Tín hiệu singlet tại 2,3 được gán cho proton methyl. Hai tín hiệu singlet tại 5,4, 5,6
được gán cho proton exomethylene. Vậy A là: CH2=CBr-CH3 (2-bromopropene)
- Tín hiệu tại 118,8 (CH2) và 134,2 (CH) chứng tỏ sự hiện diện của nhóm vinyl trong phân
tử. Cacbon còn lại tại 32,6 (CH2) phải liên kết với Br. Vậy B là: CH2=CH-CH2Br (3- bromopropene)
- Tín hiệu tại 12,0 (CH2) có cường độ gấp đôi tín hiệu tại 16,8 (CH) chứng tỏ sự hiện diện
của 2 nhóm CH2 tương đương từ trường. Ngoài ra, các tín hiệu cộng hưởng của C đều thuộc vùng
trường cao loại trừ sự hiện diện của liên kết bội. Vậy C là:
Câu 5 : Trình bày khái niệm, phân loại các phương pháp sắc ký cột ? Khái niệm
Sắc ký cột được tiến hành ở áp suất khí quyển
Pha tĩnh thường là những hạt có kích thước tương đối lớn, được nạp trong cột thủy tinh
Mẫu chất cần phân tách được đặt ở phần trên đầu cột, phía trên pha tĩnh, bình chứa
dung môi giải ly thông thường được đặt phía trên cao
Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phần bên dưới cột, được hứng vào những lọ đặt ngay ống dẫn ra của cột
Sắc ký cột là một kỹ thuật sắc ký được sử dụng để tách hỗn hợp các chất hóa học thành các
hợp chất riêng biệt. Sắc ký cột là phương pháp được sử dụng rộng rãi để tinh chế hoặc phân lập
các hợp chất tinh khiết từ hỗn hợp hợp chất hóa học trong phòng thí nghiệm.
Phân loại sắc ký cột : Căn cứ vào bản chất chất phân tách ta có 4 loại :
Sắc ký cột phân bố
+ pha tĩnh là các chất lỏng được liên kết hóa học trên bề mặt của những hạt rắn, nhuyễn mịn, có tính trơ
+ sự tách riêng các chất của 1 hổn hợp dựa vào việc mỗi hợp chất của hh đó có hệ số phân bố
khác nhau giữa pha tĩnh (chất lỏng tẩm lên bề mặt pha tĩnh) vơi pha động (chất lỏng )
+ Sự phân tách các cấu tử trong mẫu phân tích phụ thuộc chủ yếu vào một đại lượng gọi là hệ
số phân bố, hệ số này đặc trưng cho khả năng hòa tan, phân bố giữa các cấu tử vào pha tĩnh và pha
động.Hệ số phân bố phụ thuộc vào tính chất phân cực của : mỗi hợp chất, pha động và pha tĩnh 2
+ nếu pha tĩnh tương đối phân cực, các hợp chất có tính phân cực mạnh sẽ bị nó giữ mạnh
hơn so với các chất kém phân cực, hậu quả là các chất kém phân cực ra khỏi cột nhanh hơn hợp
chất phân cực. Còn trường hợp còn lại, nếu pha tĩnh kém phân cực thì các chất phân cực sẽ được
rửa giải khỏi cột trước tiên.
Sắc ký cột hấp phụ
+ pha tĩnh là chất rắn : đó là những hạt rắn, nhuyễn mịn, trơ
+ quá trình phân tách phụ thuộc chủ yếu vào sự khác nhau về ái lực hấp phụ của phân tử các
hợp chất phân tích với bề mặt pha tĩnh.
+ độ hấp phụ của hợp chất phân tích lên bề mặt pha tĩnh được kiểm soát bởi 1 số yếu tố như :
liên kết Hydro, lực Van der Waal, tương tác lưỡng cực – lưỡng cực, tính acid – base, khả năng tạo phức
+ sự giữ lại của 1 chất tan trên pha tĩnh thông thường là kết quả của sự kết hợp các yếu tố
này và thường là quá trình thuận nghịch. Việc lựa chọn được pha tĩnh cũng như pha động thích
hợp sẽ tạo ra quá trình phân tách tối ưu, tối đa hóa lượng chất phân tích thu được, đồng thời tránh
được sự lưu giữ không thuận nghịch của các chất phân tích trên pha tĩnh.
Sắc ký cột trao đổi ion: là phương pháp phổ biến nhất để tách, tinh chế protein và các phân tử tích điện.
+ pha tĩnh là những hạt hình cầu, rất nhỡ có cấu tạo hóa học là polyme, gọi là các hạt nhựa.
Bề mặt của hạt mang các nhóm chúc hóa học dạng ion. Có hai loại nhựa là nhưa trao đổi cation và nhựa trao đổi anion.
+ nhựa trao đổi anion : mang nhóm chức có điện dương nên bắt giữ các ion âm pha động và
nhựa trao đổi cation thì ngược lại. Sự bắt giữ xảy ra nhờ lực hút tĩnh điện giữa hai điện tích ngược dấu
+ sự tách riêng các chất của hh dựa vào việc hợp chất nào của hh mang điện tích ngược dấu
với điện tích hạt nhựa, bị nhựa bắt giữ lại trong cột. Lực liên kết của các phân tử trong mẫu phân
tích với các hạt pha tĩnh phụ thuộc vào tương tác ion giữa các nhóm chức ion trái dấu. Lực tương
tác này mạnh hay yếu được xác định bởi số lượng và vị trí của các nhóm ion trên phân tử mẫu phân
tích và trên các hạt pha tĩnh. Các phân tử trong mẫu phân tích có lực tương tác ion yếu sẽ được rửa
giải ra khỏi cột trước. Các phân tử có lực tương tác ion mạnh hơn sẽ liên kết mạnh với pha tĩnh và được rửa giải ra sau.
Sắc ký cột loại cỡ
+ pha tĩnh được cấu tạo bởi những hạt mà trên bề mặt của nó có những lỗ rỗng nhỏ, kích thước
bằng nhau. Nhiều loại nguyên liệu khác nhau được sử dụng để tạo nên các pha tĩnh với các lỗ rỗng
có kích thước khác nhau.
+ Những chất phân tích có kích thước phân tử lớn sẽ ko thể xâm nhập sâu vào mạng lưới các
hạt pha tĩnh, những chất có kích thước phân tử trung bình sẽ xâm nhập vào mạng lưới ở mức độ
nhất định, trong khi đó các phân tử có kích nhỏ sẽ xâm nhập dễ dàng.
+ Ở đây hầu như ko có sự tương tác giữa chất phân tich với pha tĩnh nên quá trình phân tách
phụ thuộc vào hình dạng và kích thước tiểu phân các chất phân tích
+ chất có kích thước phân tử lớn sẽ rửa giải đầu tiên và cứ tiếp tục như vậy
Câu 6 : Trình bày các bước cơ bản để triển khai sắc ký cột và căn cứ để lựa
chọn pha tĩnh, pha động ?
Triển khai sắc ký cột: Các bước cơ bản
Nhồi cột bằng pha tĩnh và nạp mẫu lên trên đầu cột
Đặt bình chứa dung môi pha động lên trên pha tĩnh và cho dung môi chảy qua cột dưới
tác dụng của trọng lực
Thu các mẫu phân tích bằng tay hoặc bằng máy hứng mẫu tự động
Qúa trình phân lập và tinh chế các hợp chất từ dịch chiết thô ban đầu sẽ trở nên dễ dàng
hơn nếu đoán được cấu trúc hóa học của hợp chất phân lập. Trong hầu hết các trường hợp phân lập
hợp chất từ tự nhiên, cấu trúc hóa học của các chất hiếm khi được biết trước. Tuy nhiên, các dữ
liệu về độ phân cực cũng như dữ liệu từ các thử nghiệm định tính sơ bộ các hợp chất tồn tại trong
dịch chiết như lkaloid, flavonoid, steroid … rất hữu ích cho quá trình khai triển sắc ký cột
Lựa chọn pha tĩnh :
Việc lựa chọn pha tĩnh phụ thuộc vào độ phân cực của mẫu phân tích
Đối với các hợp chất phân cực mạnh, sắc ký trao đổi ion hoặc sắc ký loại cỡ là các lựa chọn ưu tiên
Trong trường hợp các hợp chất phân tích thuộc các lớp chất đã biết thì có thể bắt đầu
quá trình phân lập bằng cách sử dụng các protocol đã được công bố
Đối với mẫu phân tích chưa dự đoán được độ phân cực của các hợp chất thì thường sử
dụng sắc ký lớp mỏng để lựa chọn pha tĩnh vì một số pha tĩnh dùng trong SKLM cũng được dùng
trong sắc ký cột vd như silicagel, alumin
Lựa chọn pha động :
B1 : chuẩn bị dịch chiết thô hoặc hh cần phân tích trong 1 dung môi hữu cơ có nhiệt độ
sôi thấp ở nồng độ tối thiểu là 10 mg/ml
B2 : triển khai mẫu nầy ( 2-5 uL) với các loại SKLM khác nhau
B3 : triển khai SKLM với các dung môi pha động khác nhau
B4 : quan sát các bản mỏng sắc ký dưới đèn UV hoặc phun các thuốc thử đặc trưng
B5 : phân tích các bản mỏng, lựa chọn hệ dung môi có khả năng lưu giữ các hợp chất trong
mẫu phân tích với hệ nào có Rf = 0,2-0,3. Đối với các dịch chiết thô chọn dung môi rửa giải khởi
đầu là dung môi có thể đẩy vết chất cao nhất của của cao chiết lên vị trí ở bản mỏng có Rf = 0,5 và
chọn dung môi chấm dứt sắc ký cột là dung môi có thể đẩy vết chất thấp nhất của cao chiết lên vị
trí ở bản mỏng có Rf = 0,2.
Việc khai triển mẫu phân tích bằng sắc ký lớp mỏng với các dung môi pha động khác nhau sẽ
giúp lựa chọn được các điều kiện để khai triển sắc ký cột. Điều này sẽ cung cấp các thông tin hữu
ích cho việc lựa chọn các điều kiện khởi đầu quá trình sắc ký cũng như lựa chọn dung môi pha
động để rửa giải được càng nhiều hợp chất càng tốt.
Câu 7 : Trình bày các phương pháp nhồi cột sắc ký ?
Cột có thể được nhồi pha tĩnh trực tiếp hoặc cũng có thể mua các loại cột đã được nhồi sẵn
bằng các loại pha tĩnh khác nhau, ở các kích cỡ khác nhau. Pha tĩnh sau khi dung xong thường 4
được bỏ đi để tránh gây nhiễm mẫu cho các mẫu khác. Tuy nhiên, đối với một số loại gel, ví dụ
như silicagel pha liên kết, Sephadex LH-20, có thể rửa pha tĩnh và tái sử dụng.
+ Có hai cách nhồi cột thông thường là nhồi cột ướt và nhồi cột khô.
+ cột sắc ký thường đượclàm bằng thủy tinh nên hầu như trơ với tất cả các loại dung môi và
có thể chịu được áp suất nhẹ đến trung bình khi triển khai sắc ký cột.
+ lượng pha tĩnh cần dùng phụ thuộc vào lượng mẫu phân tích thông thường với mỗi gam
dịch chiết, lượng pha tĩnh cầm thiết vào khoảng 25-50 g ( phân tách thô ) ; 100-200 g ( phân tách chất tinh khiết )
Phương pháp nhồi cột ướt: là phương pháp dễ thực hiện và hay được sử dụng để nạp
cột. Đây là phương pháp duy nhất để nhồi cột đối với loại pha tĩnh trương nở trong dung môi pha
động, ví dụ như pha tĩnh carbohydrat (Sephadex G-10). Phương pháp nhồi cột ướt được thực hiện theo quy trình như sau:
Cho pha tĩnh vào trong cột cốc đã chứa sẵn dung môi khởi đầu cho quá trình sắc ký, đều
đặn, mỗi lần 1 lượng nhỏ, vừa rót vừa khuấy nhẹ đều
Lượng dung môi phải vừa đủ để dung môi ko quá sệt khiến cho bọt khí sẽ bắt giữ trong
cột và cũng ko được quá lỏng
Dùng 1 phễu lọc có đuôi dài, đặt trên đầu cột, rót hh sệt vào cột, vừa mở nhẹ khóa ở bên
dưới cột để cho dung môi chảy ra, hứng vào 1 cốc trống để bên dưới cột, dung môi nầy được sử
dụng lại để rót trả lại trên đầu cộtTiếp tục rót chất sệt vào cột cho đến khi hết số lượng, vừa rót
vừa dùng 1thanh cao su gõ nhẹ vào bên ngoài thành cột để pha tĩnh nén đều trong cột
Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy ra và rót lại vào đầu cột vài ba lần để việc nạp cột
được chặt chẽ cho đến khi thấy pha tĩnh trong cột có dạng đồng nhất
Trong quá trình nạp cột ko được để cho đầu cột bị khô nghĩa là phải lun có dung môi phủ trên đầu cột
Đối với các loại pha tĩnh có thể trương nở cần có thời gian để chúng trương nở hoàn toàn
Nếu mặt thoáng pha tĩnh ko nằm ngang
+ cho dung môi thêm cao lên trên phân đầu cột
+ dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ phần dung môi gần sát mặt thoáng
+ làm xáo trộn 1 phần pha tĩnh ở trên đầu cột
+ để yên, pha tĩnh lắng xuống từ từ tạo nên 1 mặt thoáng bằng phẳng.
Phương pháp nhồi cột khô : cũng là một phương pháp nhồi cột hiệu quả, và thương
được sử dụng đối với pha tĩnh là silica gel hoặc silica gel pha liên kết. Phương pháp nhồi cột khô
thường đặc biệt hữu ích đối với sắc ký lỏng chân không (VLC- vancuum liquid chromatography)
dùng để phân lập các hợp chất tự nhiên kém phân cực hoặc phân cực trung bình với pha tĩnh thường
là Silica gel 60 H. Phương pháp này được tiến hành theo quy trình sau:
Dùng kẹp để giữ cho cột thẳng đứng trên giá, cho dung môi khởi đầu sắc ký vào khoảng 2/3 chiều cao cột
Ngang qua 1 phễu lọc có đuôi dài, cho pha tĩnh ở dạng bột khô vào thẳng trong cột, đều
đặn, mỗi lần 1 lượng nhỏ, vừa cho vừa gõ nhẹ thành cột
Khi lớp pha tĩnh đạt được chiều cao khoảng 2 cm trong cột thì mơt nhẹ khóa bên dưới cột để
cho dung môi chảy ra, hứng vào 1 cốc trống.
Câu 8: Trình bày các phương pháp rửa giải cột sắc ký. Phân tích ưu
nhược điểm của mỗi phương pháp. Gồm 4 phương pháp :
Rửa giải bằng građien: người ta thường dùng cách này để triển khai cột sắc ký vì cách
này thực hiện đơn giản nhưng lại cho quá trình phân tách khá tốt. nếu trong một bước nhảy
gradient, thành phần của hệ dung môi thay đổi theo tính phân cực thì quá trình phân tách các hợp
chất tự nhiên diễn ra rất hiệu quả. Dối với hệ thống rửa giải gradient trong quá trình sắc kí lỏng
hiệu năng cao, các chương trình gradient có thể được cài đặt. Trong sác kí cột, mỗi bước nhảy
gradient thường tương ứng với lượng dung môi gấp khoảng 1,3 lần thể tích cột. bước nhảy
gradient được tạo ra bằng chuẩn bị hệ dung môi pha động bao gồm các dung môi phân cực và
kém phân cực ở các tỷ lệ khác nhau.
Rửa giải nhờ vào trọng lực: thôngthường, quá trình rửa giải bằng trọng lực có khả
năng phân tách tốt khi kích thước tiểu phân pa tĩnh lớn hơn 60 𝜇m. Pha tĩnh với các hạt có kích
thước nhỏ hơn không thể tạo ra áp lực đủ để dung môi rửa giải chảy qua cột với vận tốc mong
muốn. người ta thường thiết kế quá trình rưả giải bằng trọng lực bằng cách đặt bình chứa dung
môi pha động lên trên đầu cột và có thể kiếm soát tốc dộ của dòng chảy bằng cách điều chỉnh và bên dưới cột.
Rửa giải nhờ vào lực đẩy: quá trình này được thiết lập bằng cách tác dụng một áp lực
lên đầu cột để tăng độ phân giải của quá trình sắc ký. Kĩ thuật này gọi là sắc kí chớp nhoáng,
thường sử dụng các hạt pha tĩnh với kích thước 40 -60 𝜇m. Cột dùng cho kĩ thuật sắc kí này phải
được làm bằng thủy tinh có thành dày và cứng để chịu được áp lực cột. cột nên được che chắn
bên ngoài bởi một tấm dưới nhựa để tránh khi sử dụng áp suất cao, cột có thể bị nổ vỡ.
Hiện nay cột sắc kí chớp nhoáng có thể được mua dưới các dạng thương mại trên thị trường
đã được nhồi sẵn pha tĩnh.
Rửa giải nhờ vào áp lực chân không: kĩ thuật này được gọi là sác kí lỏng chân không.
Áp lực chân không được đặt ra ở đầu ra của cột. quá trình rửa giải tương tự đối với trường hợp
sử đụng lực đẩy, tuy nhiên khó kiểm soát tốc độ chảy của pha động hơn. Một ưu điểm của kĩ
thuật này là an toàn hơn so với kĩ thuật FC. Thông thường, kĩ thuật này được ứng dụng để tinh
chế một hỗn hợp chất từ mẫu phân tích, đặc biệt từ hỗn hợp chất phản ứng. trong phân lập các
hợp chất tự nhiên, kĩ thuật này hay sử dụng để phân tách dịch chiết thô ban đầu thành các phân
đoạn nhỏ đối với các phân đoạn kém phân cực hoặc phân cực trung bình.
Rửa giải nhờ vào lực bơm: hệ thống này cho phép kiểm soát tốt tốc độ dòng chảy pha
động. lọa bơm được dùng thường trơ về hóa học và có thể sử dụng với dung môi dễ cháy. Người
ta có thể phân loại sắc kí cột căn cứ vào mức độ áp suất được tạo ra khi khai triển cột và mức áp
suất này phụ thuộc vào kích thước tiểu phân của pha tĩnh sử dụng. Sắc kí cột áp suất thấp (LPLC)
coa kích thước tiểu phân hạt pha tĩnh trong khoảng 40 -200 𝜇m, tạo ra mức áp suất thấp hơn áp
suất khí quyển. sắc kí cột áp suất trung bình (MPLC) là hạt pha tĩnh có kích thước 4 – 12 𝜇m với
mức áp suất 500 – 300 psi. Độ phân giải của các loại sắc kí này giảm dần theo thứ tự HPLC >
MPLC > LPLC. Trong khi đó thời gian khai triển cột lại tăng theo thứ tự LPLC > MPLC > HPLC. 6 Rửa giải bằng
Rửa giải nhờ Rửa giải nhờ Rửa giải Rưa giải nhờ gradien trọng lực vào lực đẩy nhờ vào vào lực bơm lực chân không Nhược -Thời gian lâu, -Pha tinh -áp lực cao, -khó kiểm đặc biệt khi pha kích thước nhỏ dễ gây nổ vỡ soát tốc tĩnh kích thước nhỏ khó rửa giải hơn độ chảy của pha động Ưu -Thực hiện đơn Phân tách tốt -tăng độ phân -an toàn -kiểm soat tố giản, quá trinh kích thước tiểu giải
hơn so với độ chảy của phân tách
phân pha tĩnh lớn -thời gian kĩ thuật Pha động khá tốt, hơn 60um nhanh hơn -có thể sử dụng với dung môi dễ cháy
Câu 9: Phân loại sắc ký, phân loại sắc ký cột. Phân loại sắc ký
Theo bản chất vật lý các pha
pha động có thể là 1 chất lỏng hay chất khí
pha tĩnh có thể là 1 chất rắn hay 1 chất lỏng
do đó dựa vào bản chất các pha ta phân biệt các phương pháp sau + sắc ký lỏng – lỏng + sắc ký lỏng – rắn + sắc ký khí –lỏng + sắc ký khí –rắn
Theo hiện tượng sắc ký :
Sắc ký hấp phụ :
+ Dựa trên sự phân bố chất phân tích giữa pha động và pha tĩnh nhờ tương tác phân tử thông qua trung tâm hấp phụ
+ Pha tĩnh : chất rắn hoặc lỏng có diện tích bề mặt lớn, bền vững về mặt hóa học
+ Pha tĩnh :hấp phụ chất phân tích trên bề mặt của chúng ở mức đọ khác nhau
+ Tùy thuộc lực liên kết giữa pha tĩnh và từng cấu tử chất phân tích, khi cho pha động đi qua
pha tĩnh các chất phân tích sẽ di chuyển với các tốc độ khác nhau
Sắc ký phân bố lỏng – lỏng :
Sự khác biệt giữa sắc ký phân bổ lỏng-lỏng và sự phân bố thông thường là ở chỗ sắc ký phân
bố lỏng- lỏng còn gọi là sắc ký chiết, pha tĩnh là chất lỏng, pha động cũng là chất lỏng, còn sự
phân bố nói chung là sự phân chia chất phân tích vào 2 pha không cần xét tới lỏng hay rắn.
Điểm khác nhau cơ bản giữa sắc ký phân bố lỏng-lỏng và sắc ký hấp phụ là ở chỗ: sắc ký phân
bố lỏng-lỏng có đường đẳng nhiệt tuyến tính ở khoảng nhiệt độ lớn, phương pháp có độ nhạy cao
nhưng có nhược điểm là pha tĩnh không được bền vững, hiện tượng trôi mất pha tĩnh làm cho độ lặp lại bị giảm.
+ Pha tĩnh :là chất lỏng, ko hòa lẫn với pha động, chất lỏng này được bao trên bề mặt chất
rắn gọi là giá hay chất mang và phải là chất trơ
+ Ngoài ra còn có sắc ký khí – lỏng.
Sắc ký trao đổi ion :
+ Pha tĩnh : thường là pha rắn có khả năng trao đổi ion của nó với các chất phân tích trong pha động
+ Chất có khả năng trao đổi cation gọi là cationit
+ Chất có khả năng trao đổi anion gọi là anionit
+ Lực liên kết chủ yếu giữa chất phân tích với pha tĩnh là lực hút tĩnh điện, phụ thuộc nhiều
vào điện tích ion chất phân tích, pH dung dịch và bán kính hydrat hóa của các ion chất phân tích.
+ VD : phản ứng trao đổi ion giữa cationit acid mạnh với Ca++ có thể viết như sau : 2R-SO3H + Ca++ = ( R-SO3) 2 Ca + 2H+
Phản ứng của anionit base mạnh với Cl- :
R-N(CH3)3OH + Cl- = R-N(CH3)3Cl + OH-
Sắc ký rây phân tử :
+ Pha tĩnh là các chất rắn có diện tích bề mặt lớn, xốp, có những đường đi trong lòng chất
rắn còn gọi là mao quản với kích thước cỡ phân tử
+ Các phân tử chất phân tích có thể khuếch tán vào pha tĩnh ở mức độ khác nhau tùy thuộc
theo kích thước của chúng
+ Các chất phân tích có kích thước lớn : ko thể đi vào sâu pha tĩnh sẽ bị rửa giải nhanh và
ngược lại các chất phân tích có kích thước nhỏ phân bố sâu vào pha tĩnh sẽ bị rửa giải chậm
+ Thứ tự rửa giải là các chất có kích thước nhỏ đi ra sau và ngược lại.
+ Thời gian lưu của các chất tỷ lệ nghịch vơi kích thước phân tử của chúng
+ Tuy nhiên chất phân tích có thể tương tác khác với pha tĩnh làm cho thứ tự rửa giải ko phải
lúc nào cũng tuân theo quy luật trên. Sắc ký ái lực :
+ Đây là sắc ký có độ chọn lọc cao nhất dựa vào sự tương tác chọn lọc giữa phân tử chất tan
và một phân tử thứ hai được gắn với pha tĩnh nhờ liên kết cộng hóa trị.
+ Ví dụ: các phân tử bất động có thể là một kháng thể với 1 loại protein cụ thể. Khi có một hỗn
hợp chứa hàng nghìn protein đi qua cột, chỉ có 1 protein là phản ứng với kháng thể liên kết của
cột. Tất cả các chất tan khác được rửa sạch từ cột, protein cần tách sẽ được tách ra bằng cách
thay đổi độ pH hoặc cường độ ion.
Theo kỹ thuật và phương tiện sắc ký :
Theo phương pháp giữ pha tĩnh :
+ Sắc ký trên cột : pha tĩnh được nhồi trong cột bằng kim loại hay thủy tinh. 8
+ Sắc ký lớp mỏng : pha tĩnh được tráng đều và giữ trên bề mặt của bản thủy tinh hay nhựa,
nhôm. lớp mỏng pha tĩnh thường là silicagel, nhôm oxit xenlulose, chất nhặ trao đổi lớn. có
chiều dày khoảng 0,24-0,5 mm
+ Sắc ký giấy : pha tĩnh ( lỏng ) được thấm trên 1 loại giấy lọc đặc biệt gọi là giấy sắc ký có
bản chất là xenlulozo với các khoang rỗng dẫn đến thấm các dung môi khác nhau
Theo cách nhận biết chất phân tích :
+ Sắc ký khai triển : các chất được tách trên pha tĩnh theo dòng pha động
+ Sắc ký rửa giải : các chất được giải ly lần lượt ra khỏi pha tĩnh
Phân loại sắc ký cột: (Giống ý 2 câu 5)
Câu 10: Sắc ký lớp mỏng: nguyên tắc, các dụng cụ và cách tiến hành. Khái niệm:
Sắc ký lớp mỏng hay còn gọi là sắc ký phẳng ( planar chromatography), dựa chủ yếu vào hiện
tượng hấp thu trong đó pha động là dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua
một pha tĩnh là một chất trơ ( thí dụ như: silicagel hay oxid alumin). Pha tĩnh được tráng thành một
lớp mỏng, đều, phủ lên nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hay plastic. Do chất hấp thu được
tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này gọi là sắc ký lớp mỏng. Nguyên tắc :
Tất cả các dạng SKLM đều liên quan đến sự cân bằng động học của các phân tử giữa hai pha
Các phân tử di chuyển liên tục qua lại giữa trạng thái tự do và hấp phụ ở trên pha tĩnh
Hàng triệu các phân tử hấp phụ và giải hấp phụ mỗi giây
Sự cân bằng hai pha phụ thuộc vào :
+ Kích thức và độ phân cực của phân tử
+ Độ phân cực của pha tĩnh
+ Độ phân cực của dung môi
Độ phân cực chất phân tích do cấu trúc hóa học của nó quyết định => việc lựa chọn pha
tĩnh và động khác nhau sẽ cho hiệu quả tách sắc ký khác nhau
Ái lực khác nhau của chất tan trên pha tĩnh làm chúng di chuyển với các vận tốc khác
nhau trong pha động của hệ thống sắc ký =>kết quả là chúng được tách thành những dải khác
nhau trong pha động và các cấu tử lần lượt hiện ra theo trật tự trong tương tác với pha tĩnh. Các dụng cụ:
− Bình sắc ký: Một chậu, hũ, lọ bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng, có nắp đậy.
− Pha tĩnh: Một lớp mỏng khoảng 0,25 nm của một loại hợp chất hấp thu ( silicagel,
alumin..) được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên tấm kiếng, tấm nhôm, hay tấm plastic.. −
-Mẫu cần phân tích: thường là hỗn hợp gồm nhiều chất với độ phân cực khác nhau. Sử
dụng khoảng 1ul dung dịch mẫu với nồng độ pha loãng 2-5% −
Pha động: dung môi hay hỗn hợp hai dung môi, di chuyển chậm chậm dọc theo tấm lớp
mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó. −
Pha tĩnh trong sắc ký hấp phụ gọi chung là chất hấp phụ.
Ðèn tử ngoại, phát các bức xạ có bước sóng ngắn 254 nm và bước sóng dài 365 nm. Các tiến hành:
Quá trình SKLM tiến hành qua nhiều bước bao gồm : chuẩn bị mẫu, lựa chọn tấm bản mỏng
sắc ký, lựa chọn pha động, đưa chất phân tích lên bản mỏng, triển khai sắc ký, làm khô bản
mỏng và phát hiện chất phân tích. Chuẩn bị mẫu :
Đây là bước đầu tiên của SKLM
Để đạt hiệu quả cao thì mẫu được xử lý qua 1 số bước như : lấy mẫu, xử lý cơ học,
lọc, tách, làm sạch, loại tạp
Chuẩn bị mẫu phụ thuộc vào bản chất dược liệu cần phân tích
Hai phương pháp thường áp dụng là :
+ hòa tan mẫu vào dung môi thích hợp : đối với chất sáp, nhựa
+ thủy phân mẫu thành phần nhỏ bằng acid : đối với protein và carbohydrat
Lựa chọn dung môi phụ thuộc vào độ tan của mẫu phân tích
Lựa chọn bản sắc ký :
Đây là bước thứ hai của SKLM
Sự phân giải các thành phần trong mẫu phụ thuộc vào pha tĩnh, pha động
Silicagel : loại pha tĩnh tối ưu, đưọc sử dụng nhiều trong nghiên cứu và SKLM
Bản mỏng được rửa trước bằng metanol sau đó hoạt hóa bởi nhiệt.
Lựa chọn hệ dung môi : ( lựa chọn pha động )
Đây là bước quan trọng nhất trong SKLM
Việc lựa chọ dung môi chủ yếu dựa vào kinh nghiệm, chưa có quy tắc cụ thể cho việc nầy
Có thể dùng hỗn hợp dung môi hữu cơ, có thể thêm nước, acid, base để tối ưu hóa độ tan
của mẫu phân tích trong hệ dung môi đó. VD :
+ Chất phân cực hoặc ion : tách tốt trong dung môi nước, n-butanol
+ Thêm acid acetic vào hh dung môi : làm tăng độ hòa tan các thành phần cơ bản trong mẫu
+ Thêm NH3 : tăng độ hòa tan của các hợp chất có tính acid
Nếu pha tĩnh phân cực : các dung môi như n-hexan, benzen, chlorofom thường ưu tiên lựa chọn
Đói với SKLM pha thuận có chất hấp phụ phân cực : hệ dung môi thường sử dụng là kém
phân cực , nếu dùng dung môi phân cực nó sẽ hấp phụ mạnh trên pha tĩnh => hiệu suất tách sẽ kém.
Đối với SKLM pha đảo : hệ dung môi sẽ là phân cực
Một số yếu tố cần lưu ý khi lựa chọn hệ dung môi :
+ Bản chất chất phân tích
+ Bản chất pha tĩnh được sử dụng
+ Loại sắc ký : pha thường hay đảo
+ Có thể sử dụng 1 hoặc nhiều dung môi nhưng nên hạn chế dùng hệ quá phức tạp, nhiều
thành phần với tỷ lệ khác nhau bởi vì đảm bảo chính xác trong pha chế và ổn định hệ là rất khó khăn 10
Chấm mẫu sắc ký :
Là bước thứ tư trong SKLM
Dd mẫu được đưa vào ống vi quản bằng thủy tinh
Dd mẫu có thể tích từ 0,1-1 ul chấm trên đường xuất phát của bản mỏng, các vạch chấm phải cách đều nhau.
Lượng mẫu quá nhỏ : khó khăn trong quan sát sau này
Lượng mẫu quá lớn : gây quá tải và sai khác trong kết quả sắc ký
Vết chấm có thể dạng tròn hoặc vạch ngắn. dạng vạch ngắn cho kết quả tốt hơn trong phân tích
Một tấm sắc ký có thể chạy đồng thời nhiều mẫu nhưng phải đánh dấu vị trí của từng mẫu
bằng cách sử dụng bút chì
Pp để thu được 1 vết mẫu nhỏ đó là sấy khô sau mỗi lần đưa mẫu lên bản mỏng.
Khai triển bản mỏng :
Bản mỏng được đặt trong bình khai triển.
Dung môi trong bình sắc ký cần được bão hòa trước khi tiến hành bằng cách đặt tờ giáy lọc
vào mặt trong bình và lắc nhẹ để dm thấm ướt giấy
1 số kỹ thuật khai triển sắc ký : - Khai triển đi lên :
+ Dung môi đi lên bản mỏng bằng hiện tượng mao dẫn.
+ Tốc độ đi lên của dung môi chậm, dm đi từ dưới lên trên - Khai triển đi xuống :
+ Hướng dòng chảy của dm đi xuống
+ Dm đi xuống theo lực hấp dẫn và hiện tượng mao dẫn
+ Tiến hành nhanh hơn so với khai triển đi lên - Khai triển hai chiều
+ Để phân tích các hợp chất phức tạp
+ Trước tiên khai triển bản mỏng với 1 chấm chất phân tích => sau khai triển, xoay bản mỏng
90 độ => cho bản mỏng vào bình sắc ký vơi hệ dm khác => tiến hành sắc ký.
Hiện vết sau khi khai triển :
Sau khi dung môi gần đến mép của bản mỏng => lấy ra => dùng bút chì đánh dấu đường đi
của dung môi => cho bay hơi dm => sấy
Một số pp phát hiện vết như sau :
+ Pp vật lý : dùng tia UV 254 nm cho phép nhận ra các hợp chất có thể hấp thụ tia UV, các hợp
chất sẽ có màu tối sẫm trên nền sáng. đèn chiếu tia UV 366 nm phát hiện các hợp chất có phát
huỳnh quang, các vết sẫm của chất mẫu có màu sáng trên nền bản mỏng sẫm màu. + Pp hóa học
o Tác nhân có thể là Thuốc thử chung hoặc thuốc thử đạc hiệu
o Các hchc phát hiện bằng cách nhúng bản mỏng vào trong dd H2SO4 10% sau đó làm nóng đén 200 độ C Giá trị Rf :
Là Đại lượng đặc trưng cho mức di chuyển của chất phân tích 11
Rf = a/b trong đó : a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử trên bản
mỏng, b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi của vết.
Các yếu tố ảnh hưởng đến Rf :
+ tính chất của chất hập phụ, pha động + bề dày bản mỏng + nhiệt độ
+ kỹ thuật chạy sắc ký
+ lượng mẫu chấm lên bản sắc ký.
Câu 11. Ứng dụng của sắc ký lớp mỏng. Bài tập vận dụng
Ứng dụng của sắc ký lớp mỏng.
Công bố đặc điểm của hợp chất vừa mới phân lập
+ Một hợp chất sau khi được phân lập lần đầu tiên trong tự nhiên cần công bố một số đặc điểm
của hợp chất này như: phổ NMR, nhiệt độ nóng chảy, năng suất quay cực… và cả giá trị Rf của nó.
+ Một hợp chất tinh khiết có một vết với SKLM, có giá trị Rf không đổi khi khai triển với một
hệ pha động xác định.
Để kiểm tra xem 2 hợp chất có giống nhau hay không
Chấm trên cùng 1 bản mỏng 2 vết có cùng nồng độ (A, B). Tiến hành SKLM trên 3 hệ
dung môi có độ phân cực khác nhau. Muốn kết luận 2 chất có giống nhau hay không, phải đáp ứng cả 2 yêu cầu sau:
Về Rf của 2 chất so sánh (A, B): Cả 3 bản phải có giá trị Rf của 2 chất luôn giống nhau.
Chỉ cần có 1 bản có sự sai khác về giá trị Rf của 2 chất này thì 2 chất khác nhau.
Về màu sắc của 2 vết đối với 1 thuốc thử: hai vết phải cho cùng 1 màu đối với 1 loại thuốc
thử sử dụng. Nếu 2 vết có giá trị Rf giống nhau nhưng khác màu thì đó cũng là 2 chất khác nhau.
Tìm hiểu sơ bộ tính chất của mẫu phân tích
+ Biết được số các hợp chất có trông hỗn hợp mẫu ban đầu
Sau khi triển khai sắc ký, căn cứ vào số lượng vết trên sắc ký đồ để dự đoán sơ bộ số lượng
các hợp chất có mặt trong mẫu phân tích.
Tuy nhiên do bản mỏng có độ phân giải thấp do đó, trên bản mỏng có trường hợp xuất hiện
1 vết nhưng nó là 1 hh nhiều chất nhưng chưa tách được nhau.
+ Kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất
Thử tinh khiết là 1 ứng dụng rất phổ biến của SKLM, nhằm kiểm tra sự tinh khiết của các
hợp chất: khai triển dd mẫu với các dung môi khác nhau để phát hiện các vết lạ ngoài vết chính của hợp chất.
Chuẩn bị 3 bản mỏng giống nhau, trên đó chấm mẫu phân tích. Thực hiện khai triển bản mỏng
với 3 hệ dung môi khác nhau
-Một hệ dung môi đẩy các vết di chuyển gần với mức xuất phát
-Một hệ dung môi đẩy các vết di chuyển đến khoảng giữa của bản
-Một hệ dung môi đẩy các vết đi xa vị trí xuất phát. 12
Một chất là tinh khiết khi chất này sau khi khai triển SKLM trên cả 3 bản đều cho vết tròn đều,
màu sắc đồng nhất, và chỉ có 1 vết chất duy nhất, không xuất hiện bất kỳ 1 vết bẩn hay vết chất khác.
+ Biết được tính phân cực của các hợp chất trong mẫu phân tích.
Đối với SKLM pha thuận, chất phân tích có độ phân cực càng kém bền thì khả năng dichuyển
trên bản mỏng càng cao, do đó cho Rf cao, trái lại, chất có độ phân cực cao lại cho Rf thấp.
Ngược lại, đối với SKLM pha đảo, chất càng phân cực càng có Rf lớn và chất kém phân cực có Rf nhỏ hơn
Định hướng phân lập bằng sắc ký cột
Trước tiên tiến hành SKC, cần thiết phải dùng SKLM để dò tìm hệ dung môi thích hợp nhất
cho quá trình rửa giải. Thông thường, sau khi tìm được hệ dung môi có khả năng tách tốt hợp chất
phân tích trên SKLM, cần thay đổi tỉ lẹ các thành phần của hệ dung môi để làm giảm độ phân cực
của hệ dung môi một ít trước khi dùng hệ đó để giải ly trên SKC.
Trong quá trình rửa giải SKC, cần thiết phải chấm các dịch hứng được trên bản SKLM để
theo dõi sự xuất hiện của các hợp chất được rửa giải.
Theo dõi tiến trình xảy ra phản ứng
Triển khai 3 vết chất gồm: chất tham gia phản ứng (SM), hh trong quá trình phản ứng (RXN)
và sản phẩm tạo thành (P) trên cùng 1 bản SKLM.
Nếu quá trình phản ứng bắt đầu xảy ra, trên sắc ký đồ tại vết hh trong quá trính phản ứng
(RXN) có xuất hiện vết chất tham gia phản ứng (SM), không xuất hiện vất chất sản phẩm vì sản
phẩm chưa được tạo thành. Trái lại, khi phản ứng đã kết thúc, trên sắc ký đồ, tại vết hh trong quá
trình phản ứng (RXN) xuất hiện vết sản phẩm (P), không xuất hiện vết chất tham gia phản ứng vì
khi đó chất tham gia phản ứng đã tiêu thụ hết trong quá trình hình thành sản phẩm.
Kiểm tra để biết một hợp chất có kém bền không
Thực hiện giải ly hai chiều với cùng một hệ dung môi cho 2 quá trình sắc ký.
Hợp chất nào có tính chất không bị thay đổi bởi bất cứ yếu tố nào (ánh sáng, không khí, dung
môi,…) thì phải hiện vết lên trên đường chéo của bản mỏng.
Bài tập vận dụng
Cần chú ý đến dạng câu hỏi thứ tự rửa giải các hợp chất phân đoạn trong dung môi : ta có
các dung môi được sắp xếp theo thứ tự độ phân cực tăng dần nhưu sau n-hexan Methanol cyclohexen Acid acetic toluen Nước benzen diethyleter chloroform diclometan 1,2 diclometan Aceton Ethyl acetat Acetonitril Propanol
Câu 12. Ưu và nhược điểm của SKLM Ưu điểm SKLM :
Chỉ cần 1 lượng mẫu rất ít để phân tích có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn
đối chứng trong cùng điều kiện phân tích thời gian nhanh chóng
Có thể sử dụng acid mạnh như H2SO4, HNO3 để phát hiện vết
Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể được định vị trên tấm sắc ký lớp mỏng
Nhược điểm SKLM :
SKLM đối với các phản ứng xảy ra ở nhiệt độ thấp sẽ cho kết quả ko đúng bởi vì mẫu
thử sẽ đượclàm ấm lên trongmao dẫn
Khả năng phân tách còn hạn chế
Ko thể tự động hóa hoàn toàn
Độ lặp lại Rf thấp do bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố khác nhau.
Câu 13: Các tiêu chí lựa chọn dung môi chiết xuất trong hóa học cây thuốc
- Độ phân cực của dung môi: chia thành 2 hoặc 3 nhóm:
+Dung môi không phân cực: benzene, toluene, hexan, heptan, ether dầu hỏa, xăng,..
+ Dung môi phân cực: trong đó bao gồm dung môi phân cực yếu và vừa (dichloromethane,
aceton, aethylacetat,…), dung môi phân cực mạnh (nước, các loại cồn có mạch C ngắn như
methanol, ethanol, isopropanol,…).
- Độ nhớt: chia thành dung môi nhớt (có độ nhớt lớn như isopropanol) và dung môi
không nhớt hoặc ít nhớt (linh động như aceton).
- Sức căng bề mặt: dựa vào sức căng bề mặt người ta chia thành: dung môi óc sắc căng
bề mặt lớn (ví dụ nước) và dung môi có sức căng bề mặt nhỏ (Ví dụ diethyl ether).
- Nhiệt độ sôi: dựa vào nhiệt độ sôi mà người ta chia thành: dung môi dễ bay hơi (có
nhiệt độ sôi thấp như ether) và dung môi khó bay hơi (có nhiệt độ sôi lớn như n-butanol).
- Tỷ trọng: Dựa vào tỷ trọng mà người ta chia thành: DM nặng ( có tỷ trọng lớn hơn
clorofom) và DM nhẹ ( có tỷ trọng nhỏ như pentan). Khi hỗn hơp hai dung môi không tan lẫn
vào nhau, dựa vao tỷ trọng mà người ta sẽ biết được dung môi có tỷ trọng lớn thì sẽ phải nằm ở phía dưới.
- Tính hòa tan chọn lọc: Dựa vào tính chọn lọc mà người ta chia thành: DM có tính
chọn học và DM không có tính chọn lọc. Nói chung DM có khả năng hòa tan nhiều hoạt chất
thì tốt. tuy nhiên không phải cứ DM càng hòa tan nhiều hoạt chất thì càng tốt mà quan trọng là
DM phải có tính hòa tan chọn lọc. Một DM vừa hòa tan tốt hoạt chất lại vừa hòa tan tốt tạp chất
thì không phải là một dung môi tốt và ta không nên lựa chọn. Một DM tốt phải là dung môi
càng hoà tan nhiều hoạt chất thì càng tốt và đồng thời lại phải càng hòa tan ít tạp chất thì càng
tốt. Đây chính là dung môi có tính hòa tan chọn lọc mà ta nên chọn.
- Tính độc: dựa vào độc tính mà người ta chưa thành: dung môi không độc (ví dụ: nước)
và dung môi độc (ví dụ: benzene, có thể gây ung thư) - Tính kinh tế: dựa vào tính kinh tế mà
người ta chia thành: dung môi rẻ tiền dễ kiếm (vd: nước) và dung môi quý hiếm đắt tiền. -
Khả năng gây ô nhiễm: càng ngày người ta lại càng quan tâm nhiều hơn đến vấn đề
gây ô nhiễm môi trường. Dung môi độc hại trong quá trình sử dụng hay các chất thải độc hại sẽ
ngấm xuống đất, chảy ra biển vào song suối ao hồ hoặc bay vào không khí, con người tiếp xúc
trực tiếp hoặc hít phải khí độc hại, đang càng ngàu càng bị nhiễm phải nhiều căn bệnh hiểm 14
nghèo. Dựa vào tính chất này mà người ta chia ra làm loại: dung môi không gây ô nhiễm (vd:
nước sạch) và dung môi gây ô nhiễm môi trường (vd: benzene, methanol…)
Tóm lại để có thể lựa chọn được một loại dung môi tốt cho quá trình chiết xuất thì phụ
thuộc vào rất nhiều yếu tố. tùy thuộc vào cả mục đích của quá trình chiết xuất mà yêu cầu đối
với dung môi cũng có khác nhau. Tùy từng trường hợp cụ thể mà người ta sẽ lựa chọn dung môi sao cho thích hợp.
Câu 14: Nước, cồn: phân tích những thuận lợi và khó khăn của 2 dung
môi này trong chiết xuất hoạt chất từ dược liệu. Nước Ưu điểm:
Là dung môi thông dụng dễ kiếm, giá thành hạ
Dễ thấm vào dược liệu, do có độ nhớt thấp và sức căng bề mặt nhỏ.
Có khả năng hòa tan muối alcaloid, một số glycosid, đường, chất nhầy, pectin, chất
màu, các acid, các muối vô cơ, enzym… Nhược điểm:
Có khả năng hòa tan rộng nên dịch chiết có nhiều tạp chất, tạo môi trường cho vi khuẩn,
nấm mốc phát triển, dịch chiết khó bảo quản.
Có thể gây thủy phân một số hoạt chất (glycosid, alcaloid).
Có độ sôi cao nên khi cô đặc dịch chiết, nhiệt độ làm phân hủy một số hoạt chất.
ít được dùng làm dung môi cho phương pháp ngâm nhỏ giọt vì dược liệu khô khi gặp
nước sẽ trương nở làm kín các khe hở giữa các tiểu phân, do đó dung môi không đi qua được.
Tùy theo mục đích và phương pháp chiết xuất có thể dùng nước cất, nước khử khoáng,
nước kiềm, nước acid, nước có chất bảo quản làm dung môi chiết xuất. Cồn (etanol) Ưu điểm:
Hòa tan được alcaloid, một số glycosid, tinh dầu, nhựa, ít hòa tan các tạp chất nên có
khả năng hòa tan chọn lọc.
Có thể pha loãng với nước ở bất kỳ tỉ lệ nào, nên có thể pha loãng ethanol thành những
nồng độ khác nhau theo yêu cầu chiết xuất đối với từng loại dược liệu.
Ethanol có nồng độ > 20% có khả năng bảo quản, ngăn cản vi khuẩn, nấm mốc phát triển.
Nhiệt độ sôi thấp nên khi cô đặc dịch chiết, hoạt chất ít bị phân hủy.
Ethanol cao độ làm đông vón các chất nhầy, albumin, gôm. pectin… nên còn dùng để loại tạp chất.
Là dung môi thích hợp với phương pháp ngâm nhỏ giọt vì không làm trương nở dược liệu như nước. Nhược điểm:
+ Dỗ cháy, có tác dụng dược lý riêng.
+ Người ta có thể dùng ethanol được acid hóa bằng các acid vô cơ hoặc hữu cơ để làm tăng chiết xuất
Câu 15: Phương pháp nhận biết và loại bỏ tạp chất dễ tan trong nước
trong quá trình chiết xuất.
Những dược liệu chứa nhiều tạp chất pectin, gôm hoặc chất nhầy :
+ đây là những chất tan được trong nước và khi tan trong nước thì sẽ bị trương nở, tạo
dung dịch keo, làm tăng độ nhớt, gây cản trở cho quá trình chiết xuất => vì vậy các tạp chất
này có thể loại bằng cách cho kết tủa trong cồn cao độ Tanin :
Tanin đôi khi có hàm lượng cao trong 1 số dịch chiết. Tanin kết tủa với protein, ức chế 1
số enzyme nên có xu hướng thay đổi ( làm giảm ) hoạt tính sinh học của dịch chiết
Tanin thực vật bản chất là các polyphenol nên thường có trong các dịch chiết của dung môi phân cực. Phương pháp loại : + Tủa với FeCl3
+ Có thể bị loại khi cho dịch chiết đi qua cột polyamide, shephadex LH20 hoặc cột silicagel
+ Lắc dịch chiết với dd muối Chloride 1%, loại bỏ pha ở trên. Sau đó pha CHCl3 được làm
khan nước với Na2SO4 khan trong vài giờ.
+ Tanin cũng có thể bị tủa với gelatin ( thường dùng 5% w,v NaCl và 0,5% w/v gelatin ),
caffeine, nylon hoặc protein.
+ Tanin bị giữ lại với PVP hoặc polyamide resine bởi cầu nối hydrogen giữa OH phenol
của tanin và nhóm amin của tác, nhân phản ứng. PVP được cho lên cột, sau đó cho dịch chiết
chảy qua. Kiểm tra bằng thuốc thử FeCl3 để đảm bảo tanin được loại bỏ.
Có thể sử dụng diethyl amino ethyl cellulose để có thể loại bỏ tanin mà không giữ lại quá
nhiều hợp chất phenol khác như PVP
+ Các hợp chất phenolic có thể loại đi bằng cách rửa với dd 1% NaOH. Chất màu : -
Các chất màu thường gặp là chlorophyll, flavonoid, anthronoid khi quá trình chiết
xuất thực hiện với các bộ phận như lá, hoa, thân, cành. - Phương pháp:
+ Dùng than hoạt tính hoặc carbon hoạt tính ( hấp phụ chọn lọc). Cho than hoạt lên cột rồi
sau đó cho dịch chiết cần loại màu chảy lên cột. Hoặc trộn bột than hoạt cùng với dịch chiết,
khuấy trộn rồi để một thời gian, sau đó lọc. Sự hấp thu có ảnh hưởng bởi nhiệt độ, nhiệt độ tăng thì sự hấp thu tăng.
+ Loại chlorophyl bằng cách lắc với các dung môi không phân cực. Hoặc nếu dùng cột
silicagel pha thường thì hợp chất thường này sẽ ra ở phân đoạn đầu và có thể nhận ra được bằng
sắc ký trên cột. Việc kiểm tra đã loại được hết chlorophyl hay chưa có thể bằng mắt thường
thông qua màu của dịch chiết hoặc SKLM.
- + Có thể sử dụng dd PbCO3 2-5% để kết tủa 1 số tạp chất trong đó có chlorophyl và
các chất màu khác. Sau đó lọc để loại bỏ tạp. 16
Câu 16: Phương pháp nhận biết và loại bỏ tạp chất ít tan trong nước
trong quá trình chiết xuất.
Những dược liệu chứa nhiều tạp chất tinh bột :
+ tinh bột có tính chất ko tan trong nước lạnh, nhưng ở nhiệt độ cao sẽ bị hồ hóa, làm
tăng độ nhớt của dung dịch ảnh hưởng đến chiết xuất => ko nên xay dược liệu quá mịn, tránh
giải phóng ra nhìu tinh bột và ko nên chiết ở nhiệt độ cao để tránh hồ hóa
Những dược liệu chứa tạp là chất béo, dầu mỡ, tinh dầu, sáp, nhựa
+ đây là những chất ko tan trong nước và thường tan trong các dung môi ko phân cực
+ nếu dùng dung môi chiết là nước, các chất này sẽ làm dung môi khó thâm vào dược
liệu, gây cản trở quá trình chiết xuất do đó phải loại chúng đi bằng các dung môi thích hợp trước khi chiết
+ nếu dùng dung môi ko phân cực để chiết sẽ lẫn nhiều tạp, những tạp này sẽ được loại
đi trong giai đoạn tinh chế.
Câu 17: Nguyên tắc hoạt động và cấu tạo của máy SK khí. Các ứng dụng của SK khí.
Nguyên tắc hoạt động,cơ chế tách chất
Sắc ký khí được sử dụng để phân tích một lượng rất lớn những loại hợp chất hữu cơ
khác nhau :chất khí, chất lỏng đôi khi là chất rắn.Những hợp chất không bền nhiệt, kém bay
hơi,loại hợp chất ion kỹ thuật sắc ký không thể phân chia mẫu trực tiếp ngay được.
→ Cần biến đổi thành dẫn xuất có tính bay hơi.
1.a,Nguyên tắc hoạt động:
Trong SKK, pha động là 1 chất khí thường gọi là khí mang.Khí này xuất phát từ một bình
khí nén thành một dòng khí có thể điều chỉnh lưu lượng bởi những van khóa, để đi vào một cột có chứa pha tĩnh.
-Tại cột này, các thành phần khác nhau của hỗn hợp mẫu khảo sát sẽ được tách riêng ra.
-Mẫu chất khảo sát hoặc các chất chuẩn được tiêm vào dòng khí mang tại một vị trí ở đầu
cột pha tĩnh, rồi đi ngang qua pha tĩnh được tách thành những hợp chất riêng rẽ và ra khỏi cột.
-Các hợp chất khác nhau của hỗn hợp mẫu chất ban đầu được bộ phân phát hiện hợp chất
ghi nhận và giao diện của máy biến đổi tín hiệu đó thành các mũi xuất hiện trên sắc kí đồ.Máy
sẽ in sắc kí đồ ra giấy.
1. b,Cơ chế tách chất
-Pha động là khí mang mang theo chất phân tích, chất phân tích có ái lực khác nhau giữa
pha tĩnh và pha động,chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau 2. Cấu tạo A,khí mang
- Đóng vai trò là pha động→giữ vai trò quan trọng trong việc tách hỗn hợp mẫu chất cũng
như để cho bộ phận ghi nhận tín hiệu có thể hoạt động hiệu quả - Đựng trong bình
cấp khí, bình có van giảm áp và đồng hồ kiểm tra lưu lượng khí 17
- Khí mang phải có tính trơ: không tác dụng với nguyên liệu nhồi cột cũng như với mẫu phân tích.
- Khí mang như hydrogen, heium giúp tách mẫu tốt hơn là các loại khí có trọng lượng phân
tử lớn, ví dụ: nitrogen,dioxyd cacbon, argon.
Việc lựa chọn khí trơ làm pha động còn phụ thuộc vào loại detector cần dùng.
- Các tạp chất trong khí mang như không khí hơi nước, vết các loại khí hydrocacbon có thể
tác dụng với mẫu chất; làm hư hại cột sắc ký ; làm ảnh hưởng đến bộ phận phát tín hiệu
- Khí mang phải có độ tinh khiết 99,999%.
- Bình có đồng hồ đo áp suất để điều chỉnh lưu lượng
- Nên cho khí mang qua qua hệ thống phòng bị để loại bổ tạp chất. Hệ thống gồm một chuỗi
các bình có chứa các hạt rây phân tử để giữ nước, than hoạt tính để giữ hydrocacbon,silicagel
để giúp pha động không còn chứa oxygen.
-Trong thực nghiệm thường sử dụng khí mang nitrogen hoặc helium cho cột nhồi PLOT
helium thường cho pick hẹp hơn. Nitrogen thường được sử dụng với cột nhồi, với tốc độ dòng
khí 30-50ml/phút.Với cột mao quản WCOT thường dùng helium hoặc hydrogen.
B,Bộ phân tiêm mẫu
-Là nơi mẫu từ bên ngoài được đưa vào bên trong máy sắc kí.
-Gồm ống thủy tinh hoặc thép không rỉ, một đầu ống nối vào bên trong máy sắc kí,còn đầu
kia tiếp xúc với bên ngoài, đầu này có gắn một nút ngăn bằng cao su Silicon dày 2,3-3.2mm.
- Nút ngăn cao su sau vài lần bị kim tiêm xuyên qua, bị thủng lỗ, không bịt kín ống được
nữa, sẽ dễ dàng được thay thế.
- Ông này còn có một nhánh ngang để dẫn khí mang vào máy. Các ống được đặt trong lò nung
- Mẫu được đưa vào bên trong máy nhờ một bơm tiêm nhỏ hoặc van tiêm mẫu,xuyên thủng
qua nút ngăn là đệm cao su silicon ở đầu cột,để đưa một lượng rất nhỏ dung dịch mẫu vào bên trong ống
- Nếu tiêm mẫu dư, pick sắc ký sẽ giãn rộng và độ phân giải kém.
- Do thể tích hóa hơi lớn nên cần gắn thêm một thiết bị để chỉ cho phep một lượng nhỏ mẫu đi vào cột.
- Có thể đưa mẫu vào máy dưới dạng khí hoặc lỏng
- Dung môi dùng để phải đạt các yêu cầu sau:
+ Không phản ứng hóa học với mẫu phân tích và nguyên liệu làm pha tĩnh
+ Phải hòa tan mẫu hoàn toàn
+ Dung môi phải có thời gian lưu khác với mẫu phân tích 18
-Phải điều chỉnh để bộ phận tiêm mẫu có nhiệt độ cao hơn 20-30 độ C nhiệt độ sôi của hợp
chất kém bay hơi nhất trong hỗn hợp mẫu phân tích và có nhiệt độ cao hơn 20-50 dộ C nhiệt độ cột sắc kí.
- Có 4 kĩ thuật bơm mẫu thường dùng: +Chia dòng +không chia dòng +thẳng vào cột +bay hơi nhanh 3,Cột sắc kí
-Cột sắc kí đặc biệt rất dài
+loại nhồi cột pha tĩnh thường có đường kính trong 2-6 mm và dài 1-3 met
+cột mao quản có đường kính trong 0,2-0,7mm và dài 10-100met.
-Cột dài được cuôn thành các khoanh tròn đường kính 10-20cm.Hai đầu cột được thiết kế
thành mối nối để một đầu cột dễ dàng nối với bộ phận tiêm mẫu và đầu kia của cột nối vào bộ
phận phát tín hiệu mà không có khoảng thể tích chết.
-Loại cột nhồi thường làm bàng thủy tinh hoặc thép không rỉ. Cột được đặt trong lò nung
nhỏ. Nhiệt độ lò nung khoảng 50-150độ C khi cần có thể cao hơn.
- áp suất hơi cũng như độ hòa tan của các hợp chất thay đổi theo nhiệt độ vì thế cần kiếm
soát chính xác nhiệt độ.
-Có thể thực hiện quá trình sắc kí với chương trình đẳng nhiệt hoặc chương trình nhiệt độ
4.Bộ phận phát tín hiệu Bộ phận phát hiện Mục đích:
Để theo dõi khi có một khí, khác với khí mang được giải ly ra khỏi cột sắc kỳ
Đầu dò dùng phát hiện tín hiệu để định tính và định lượng các chất cần phân tích
Đầu dò được nối với máy tính cho thấy các tín hiệu xuất hiện trên màn hình máy tính được
nối với máy in để in ra sắc kỳ đổ Yêu cầu
Mọi hợp phần có trong 0,1𝜇𝑙 mẫu phải được phát hiện ở mức 1% hay phát hiện được
0,002𝜇𝑙 mẫu (khối lượng cỡ 10-6g)
Có nhiều loại đầu dò với công năng khác nhau tùy theo mục đích phân tích
Bộ phân phát hiện cần có các tính chất sau: - Độ nhạy cao -
Khả năng cho tín hiệu với nhiều loại hợp chất -
Khoảng tuyến tính của tín hiệu theo nồng độ rộng - Cho tín hiệu nhanh - Ổn định - Dễ sử dụng
Các detector thường dùng trong GC: -
Detector in hóa ngọn lửa(FID) - Detector dẫn nhiệt(TCD) - Detector bẫy electron(ECD) - Detector ion hóa quang(PID) -
Detector quang hóa ngọn lửa(FPD) - Detector ion hoa nhiệt(TID) - Detector khối phổ(GC-MS)
Đầu dò dẫn nhiệt (TCD) Nguyên tắc:
Các chất khí đi qua khỏi cột sắc kỳ sẻ có độ dẫn nhiệt khác với khí mang(helium)
Sợi dây tóc đèn nhạy cảm với nhiệt độ, được đặc trong ống tại đầu ra của cột sắc ký khí và
bị nung nóng bởi một dòng điện
Sợi tóc bị làm lạnh bởi dòng khí helium và đạt một nhiệt độ cân bằng
Chất phân tích được giải ly ra khỏi cột sắc ký khí, do độ dẫn nhiệt của các khí này khác với
đọ dẫn nhiệt của helium nên sợi tóc đèn bị làm nguội ờ nhiệt độ khác
Sự thay đổi trong quá trình làm nguội, nghĩa là có hiện tượng nhiệt đọ thay đổi, khiến cho
điện trở của sợi tóc đèn thay đổi, điện áp giảm, tạo ra một mũi tín hiệu( a peak) được ghi lên sắc ký đồ Ưu điểm:
Phát hiện tất cả các loại hợp chất vô cơ và hữu cơ
Thích hợp cho loại sắc ký khi sử dụng cột điều chế( Không làm hư mẫu khi mẫu đi ngang qua bộ phận đầu dò) Nhược điểm:
Kém nhạy, không thể phát hiện hợp chất hiện diện ở nồng độ nhỏ
Đầu dò bắt điện tử(ECD) Nguyên tắc:
Đầu dò gồm hai điện cực
Điện cực khối trụ rỗng phóng ra tia phóng xạ 𝛽 sẽ làm phân tử khi mang bị ion hóa, tạo ra
electron có năng lượng cao
Các electron này được hút về điện cực thu nhận, tạo nên một dòng điện và trên sắc ký đồ
xuất hiện thành tín hiệu đường nền 20
Khi một hợp chất có tính ái lực cao với điện tử đi vào bộn phận đầu dò sẽ bắt điện tử đi vào
bộ phận đầu dò sẽ bắt giữ các electron, tạo nên các gốc tự do và các ion thứ cấp có năng lượng
thấp hơn, như thế làm giảm dòng điện ở đầu dò
Sự thay đổi tạo nên tín hiệu điên tử. Tín hiệu được khuếch đại, đưa đến một mũi xuất hiện trên sắc ký đồ
Phân tích sự hiện diện một số loại hợp chất thuộc về môi trường( dư lượng các loại thuốc
trừ sâu có chứa cl2, thuốc diệt cỏ….) Ưu điểm:
Rất nhạy, có thể phát hiện một số loại hợp chất khi chúng hiện diện ở nồng độ cực nhỏ
Không làm hư hại mẫu khi mẫu đi ngang qua bộ phận đầu dò nên thích hợp cho loại sắc
ký khi sử dụng cột điều chế Nhược điểm :
Chỉ nhạy đối với một số ít loại hợp chất( chứa nguyên tố có độ âm điện mạnh)
Đầu dò nitrogen-phosphor(NPD) Ưu điểm
Phát hiện dư lượng các thuốc trừ sâu có chứa N và P, các hợp chất phosphat hữu cơ
(organophosphate) các hợp chất carbamat
Khi so sánh với đầu dò ion hóa ngọn lửa(FID), nhạy hơn gấp 50 lần (để phát hiện hợp chất
có chứa N), nhạy hơn 500 lần( để phát hiện hợp chất P) Nhược điểm
Chỉ nhạy đối với loại hợp chất có chứa N và P, còn các loại hợp chất không chứa N,P sẻ
không cho tín hiệu mũi có thể đo để sử dụng
Không thể sử dụng cho kỷ thuật sắc ký điều chế( ngọn lửa cũng đốt cháy thiêu hủy mẫu)
Đầu dò trăc quang ngọn lửa(FPD) Ưu điểm
Độ nhạy cao, dùng để phát hiện dư lượng thuốc trừ sâu có chứa S và P, phân tích các chất
màu, các chất thêm vào trong thực phẩm hoặc các loai thức uống, hợp chất hữu cơ lưu huỳnh
Để phân tích các chất khí có lưu huỳnh như tiophen, mercaptan, disulfur, H2S, S02, các sản
phẩm than đá, dầu mỏ có chứa lưu huỳnh Nhược điểm
Chỉ nhạy đối với loại hợp chất có chứa S và P, còn các loại hợp chất không chứa S, P cho
tín hiệu mũi có thể không đủ để sử dụng
Ngọn lửa cũng đốt cháy thiêu hủy mẫu nên không thể sử dụng cho các kỷ thuật sắc ký điều chế
Đầu dò quang ion hóa(PID) Nguyên tắc
Đầu dò quang ion hóa sử dụng năng lượng của một ngọn điện tử ngoại chân không để ion
hóa các chất phân tích vừa được giải ly ra khỏi cột sắc ký
Ngọn đèn tử ngoại phát ra tia sáng đi vào buồng ion hóa. Trong buồng này, các phân tử
ion hóa bởi năng lượng phóng ra của ngọn đèn Ưu điểm
Đàu dò quang ion hóa có đọ nhạy cao, phát hiện mẫu hiện diện ở nồng độ nhỏ
Có thể áp dụng để phân tích một phổ rất rộng các loại hợp chất hữu cơ và vô cơ
Không làm hư hại mẫu nên thích hợp cho các sắc ký khi sử dụng cột điều chế
● Đầu dò ion hóa ngọn lửa -Nguyên tắc:
+Có một ngọn lửa nhỏ cháy đều nhờ khí hydrogen.
+Hydrogen được cho vào dòng chảy ở đầu ra của cột sắc kí trộn đều với khí mang rồi xuất
hiện ở đầu ra của ống,đi vào luồng không khí, để tạo nên ngọn lửa.
+Phía trên cao của ngọn lửa là một ống hình trụ rỗng làm bằng kim loại, đó là bộ phận thu
nhận giữ vai trò điện cực âm.
+Phần đầu của bộ phận tạo ra ngọn lủa là điện cực dương.
→hai đầu điện cực sẽ tạo ra một dòng điện yếu
+Đầu dò còn gồm một bộ phận đánh lửa, một ống để đưa không khí vào buồng chứa ngọn lửa - Quá trình:
+Khi một hợp chất hữu cơ đi ra khỏi cột sắc kí, được dẫn vào bộ phận đầu dò, qua ngọn lửa bị đốt cháy.
+Ngọn lửa hydrogen tinh khiết có chứa các gốc tự do H●,O●,OH● nhưng không chứa các
ion. Khi hợp chất hữu cơ hiện diện trong ngọn lửa, sự oxyhoa sẽ xảy ra và số lượng sẽ tương
ứng với số nguyên tử cacbon và cũng tương ứng với số phân tử. ■Ưu điểm :
-phát hiện hợp chất hiện diện ở nồng dộ rất nhỏ của tất cả hợp chất hữu cơ,đường nền sắc kí đồ bằng phẳng -có tính tuyến tính cao -thông dụng ■Nhược điểm 22
-không thể phân tích tất cả các loại hợp chất, chỉ phát hiện các hợp chất hữu cơ nào có thể
bị đốt cháy và phân mảnh dưới ngọn lửa hydrogen.
-không thể phát hiện các hợp chất sau:H2,O2,N2,H2S...
-ngọn lửa đốt cháy thiêu hủy mẫu nên không sử dụng cho sắc kí điều chế.
Các ứng dụng của SK khí
Sắc ký khí được áp dụng cho nhiều mục đích khác nhau.
-Để biết được độ tinh khiết của những hợp chất cần phân tích.
- Theo dõi phản ứng hóa học: để biết diễn tiến xảy ra của 1 phản ứng hóa học, cũng như
biết được hiệu quả của việc tinh chế một hợp chất.
- Biết được cố cấu tử hiện diện trong hỗn hợp mẫu phân tích cũng như biết được tỉ lệ tương
đối của mỗi cấu tử trong hỗn hợp. Máy SKK ghép khổi phổ (GC-MS) sẽ giúp biết được cấu
trúc của từng cấu tử (Tùy vào khả năng của thư viện mẫu).
- Tìm biết sự hiện diện 1 chất trong hh phân tích: Trong quá trình muốn biết sự hiện diện 1
hợp chất X nào đó trong 1 hh mẫu, thự hiện SKK. Sau đó, nếu có mẫu chuẩn X, thêm X vào
trong hh mẫu và thực hiện trở lại SKK với cùng điều kiện thí nghiệm, mũi của X xuất hiện với
cường độ cao hơn nhiều so với ban đầu. *Định tính:
-Định danh các chất:
+ Thông số căn bản trong định tính: Có thể thực hiện theo 3 cách:
1. So sánh thời gian lưu tR của chất phân tích với thời gian lưu của chất chuẩn đối
chiếu tring cùng đk SK. Việc so sánh sẽ tin cậy hơn nếu dùng dữ liệu thu được từ SK trên 2 cột
có độ phân cực khác nhau.
2. So sánh SK đồ của mẫu phân tích với SK đồ của mẫu phân tích đã thêm chuẩn đối chiếu.
3. Kết nối máy SKK với quang phổ hồng ngoại (IR) hoặc khối phổ (MS)
Dựa vào thư viện phổ lưu trong máy IR hoặc MS để so sánh nhận diện các chất trong mẫu phân tích.
+ Định danh 1 chất chưa biết
+ Định tính điểm chỉ. *Định lượng -So sánh với chuẩn:
+ Xác định diện tích đỉnh của các chất tách ra trong SK đồ.
+ Biến đổi diện tích thành nồng độ bằng cách so sánh với đường chuẩn.
Phương pháp dùng chuẩn ngoại: so sánh trực tiếp với đường chuẩn.
Phương pháp dùng chuẩn nội: thêm chuẩn nội vào mẫu thử và mẫu chuẩn. So sánh
kết quả của mẫu thử và đường chuẩn tính toán từ diện tích tương đối của chất chuẩn với chuẩn nội. -Khi không có chuẩn:
+ Xác định diện tích đỉnh của các chất tách ra trong SK đồ.
+Xác định tổng diện tích đỉnh của các chất trong mẫu thử.
+ Xác định % diện tích đỉnh của các cấu tử phân tích/ tổng diện tích đỉnh của mẫu thử.
+ Tính hàm lượng % của cấu tử trong mẫu thử.
Câu 18: Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình SK khí
Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tách chất - Áp suất hơi
- Đặc trưng của loại sắc ký. - Độ phân giải Rs.
Các yếu tố ảnh hưởng đến việc tách mẫu - Chuẩn bị mẫu. - Lựa chọn cột.
- Lựa chọn nhiệt độ, chương trình nhiệt độ.
Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tách chất Áp suất hơi:
Áp suất ơi là số đo cho biết khả năng của những phân tử chất lỏng có thể biến đổi từ thể
lỏng thành thể khí. Các hợp chất có trọng lượng phân tử nhỏ, tính phân cực kém sẽ có giá trị áp
suất hơi cao và ngược lại. các hợp chất có trọng lượng phân tử lớn, tính phân cực mạnh có giá trị áp suất hơi nhỏ.
Trong sắc ký khí, các hợp chất đi ra khỏi cột nhanh hay chậm tùy thuộc vào áp suất hơi và
khả năng hòa tan vào pha tĩnh của hợp chất.
Áp suất hơi của hợp chất
Khả năng hòa tan vào pha tĩnh Thời gian lưu Cao Thấp Nhỏ Cao Cao TB Thấp Thấp TB Thấp Cao Lớn
Các nghiên cứu cho thấy, có mỗi liên quan giữa nhiệt độ của cột và thời gian lưu của bất
kỳ 2 hợp chất ở kề sát nhau trên sắc ký đồ. Khi tăng nhiệt độ cột, thời gian lưu tương đối của 1
hợp chất sẽ giảm, khiến cho các mũi tín hiệu sát lại gần nhau hơn. Trong thực nghiệm để có thể
đạt được sự tối ưu trong việc tách các hợp chất, cần phải lựu chọn nhiệt độ cột cũng như chương
trình nhiệt thích hợp. khi thực hiện với chưng trình nhiệt độ.
Đặc trưng của các loại sắc ký cột * Có 3 loại cột SKK :
- Sắc ký khí – lỏng với cột sắc ký là nhồi cột, trong đó pha tĩnh là 1 chất lỏng bao phủ lên
trên những hạt trơ sử dụng chất mang.
- Sắc ký ký cột mao dẫn với cột sắc ký là 1 ống hình trụ, pha tĩnh là chất lỏng hoặc chất rắn
phủ lên bề mặt bên trong của thành ống.(loại này được gọi với nhiều từ ngữ khác nhau như:
ống mao quản hoặc ống trụ hở với mặt trong của thành ống được tráng phủ bởi 1 lớp mỏng 0,2-
0,5um. cột được nhồi bởi chất rắn là những hạt có lỗ rỗng, ống trụ hở với bề mặt thành ống
được tráng phủ 1 lớp)
- Sắc ký khí –rắn với cột sắc ký là cột nhồi; cột được nhồi đầy bằng những hạt rơ rắn. các
hạt này có thể là alumin Or những hạt polymer có nối mạng ngang.
* Trong cả 3 trường hợp, luôn luôn có pha động khí chuyên chở các hợp chất ở thể khí đi
ngang qua pha tĩnh. Việc tách riêng từng cấu phần của hỗn hợp tùy thuộc vào sự tương tác của
các cấu phần đố đối vỡi pha tĩnh, hệ quả là thời gian lưu của mỗi cấu phần sẽ khác nhau. Có hệ
số phân bố K như sau: K=CSP/CMP trong đó:
+ CSP :nồng độ của cấu phần trong một đơn vị thể tích pha tĩnh 24
+ CMP: nồng độ của một cấu phần trong 1 đơn vị thể tích pha động
Trong sắc ký khí, tỉ lệ phân bố của mỗi cấu phần của hỗn hợp và 2 pha đông và tĩnh
tùy thuộc vào áp suất hơi của cấu phần đó, vào tính chất nhiệt động học chung của toàn thể cấu
phần có trong mẫu khảo sát và vào ái lục của mỗi cấu phần đối với pha tĩnh. Sự cân bằng này
tùy thuộc vào nhiệt độ vì thế, cột chứ pha tĩnh cần phải được điều chỉnh sao cho thật đúng và chuẩn xác.
Một cấu phần nào đó bị lưu giữ lâu trong cột sắc ký, nghĩa là thể tích lưu lại trong cột của
ní sẽ thay đổi theo nhiệt độ.
Thời gian lưu tương đối của 1 cấu phần sẽ giảm khi tăng nhiệt độ của pha tĩnh và cấu tử
của hỗn hợp sẽ được giải ly ra khỏi cột với thời gian lưu gần sát nhau.
Độ phân giải R s
Một sắc ký đồ lý tưởng đạt được khi tất cả các chất phân tích trong hỗn hợp mẫu được tách
rời riieeng biệt với độ phân giải cao, trong 1 khoảng cách thời gian tối thiểu. độ phân giải tuyd
thuộc vào đặc trưng của các cấu phàn, hiệu năng tách của cột.
2(𝐭𝐑’𝐁 − 𝐭𝐑’𝐀) R𝐬 = 𝑊𝐴 + 𝑊𝐵 Trong đó : * tM: thời gian chết
* tRA,tRB:thời gian lưu trong cột của hợp chất A(hay B) tính từ lúc tiêm mẫu ( thời gian
của hợp chất A (hay B) đi ngang qua cột rồi ra khỏi cột)
* t’RA,t’RB: thời gian lưu đã được hiệu chỉnh của hợp chất A(hay B)
* WA,WB: chiều ngang của mũi tại đây.
Một sắc ký đồ được coi là phân giải tốt khi các tín hiệu mũi ở gần bên nhau tách rời nhau,
nghĩa là tín hiệu đường nền cảu các mũi tách rời ra.
Độ phân giải RS là một hàm biến đổi theo các đặc trưng của các cấu phần trong hỗn hợp
phân tích, hiệu năng tách của cột.. những việc này được thể hiện bằng hệ số lưu K của cột và
hiệu năng tách của cột,N.N còn được gọi là số mâm lý thuyết có trong cột.
Các yếu tố ảnh hưởng đến việc tách mẫu: -
Mẫu chất: trước khi tiêm mẫu vào máy, các mẫu càn được tinh chế sơ bộ, không có
các vết nhờn, không bị ẩm. không sử dụng cột vượt quá mức nhiệt độ cho phép với từng loại
cột. ống tiêm mẫu cần được rửa nhiều lần bằng đ mẫu phân tích, để loại bỏ hết các tạp bẩn. -
Tìm hiểu, ghi nhận số lượng các hợp chất hiện diện trong hỗn hợp mẫu phân tích;
khoảng nhiệt độn sôi,áp suất hơi của các cấu phần này. -
Xác định tính chất phân cực không phân cực của các cấu phần trong hỗn hợp mẫu. -
Lựa chọn hệ thống pha tĩnh: loại pha tĩnh, chiều dày của pha tĩnh tráng cột. -
Tối ưu hóa tốc độ dòng của khí mang để có thể hoàn tất việc phân tích mẫu trong
khoảng thời gian ngắn nhát, thời gian chết ngắn nhất. -
Tối ưu hóa chương trình nhiệt độn hoặc lựa chọn 1 nhiệt độ tốt nhất cho chương trình đẳng nhiệt. -
Kiểm tra hệ thống máy bằng cách cho phân tích thử 1 bộ mẫu chuẩn hoặc phân tích1 hoonnx hợp gồm nhau.
Lựa chọn loại cột (lựa chọn pha tĩnh)
Sự lựa chọn pha tĩnh giữ vai trò quan trọng. Lựa chọn loại pha tĩnh có độn phân cực gần
với độn phân cực của mẫu chất cần phân tích.
Muốn phân tích 1 hỗn hợp các chất phân cực, cần chọn pha tĩnh phân cực bởi các chất phân
cực này hòa tan tốt và được pha ĩnh giữ chặt, và thứ tự ly giải ra khỏi cột của các hợp chất đồng
đẳng sẽ theo thứ tự nhiệt độ sôi chủa chúng.
Nếu hỗn hợp những chất phân cực có lẫn nhưng hợp chất kém phân cực, các chất kém phân
cực sẽ ít hòa tan, nên bị giữ bởi pha tĩnh phân cực và hệ quả là chúng bị giải ly ra khỏi cột trước
các hợp chất phân cực coa cùng nhiệt đô sôi với chúng.
Tương tự, hiện tượng xay ra ngược lại với pha tĩnh không phân cực: các chất kém phân cực
hòa tan tốt và đượ pha tĩnh không phân cưc giữ chặt và thứ tự giải ly ra khỏi cột của các hợp
chất dồng đẳng sẽ theo thứ tự nhiệt độ của chúng. Nếu hỗn hợp có lẫn những chất phân cực,
các chất phân cực mạnh bị giải ly ra khỏi cột trước các hợp chất kém phân cực có cùng nhiệt độ sôi với chúng.
Lựa chọn nhiệt độ, chương trình nhiệt độ:
Về tổng quát, các hợp chất bây hơi nhất( do có áp suất hơi lớn) sẽ là hợp chất nhanh chóng
được giải lya ra khỏi cột.
Nếu chỉnh nhiết độ của cột sắc ký quá cáo, các cấu phần của hỗn hợp chưa kịp đạt đến sự
cân bằng trong quá trính phân bố giữa 2 pha tĩnh và động hệ quả là tất cả các tạp chất sẽ được
giải ly ra khỏi cột cùng 1 thời điểm ( có cùng thời gian lưu). Ngược lại, nếu điều chỉnh nhiệt
độ của cột sắc ký quá thấp, quá trình phân bố của các cấu phần giữa 2 pha tĩnh và động sẽ kéo
dài, hệ quả là 1 số cấu phần sẽ có thời gian lưu quá lấu, các tín hiệu mũi của các hợp chất đó bị
mất cân đối hoặc bị biến dạng. Vì thế cần phải thực hiện nhiều lần sắc ký khí với nhiệt độ khác
nhau để tìm ra được nhiệt độ phù hợp, để tách các hợp chất của hỗn hợp 1 cách tốt nhất, sắc ký
đổ cho thấy sõ các mũi.
Nếu các cấu phần của hỗn hợp có nhiệt độ sôi khác biệt nhau nhiều, nên sử dụng chưng
trình nhiệt độ của lò lên từ từ, tách rời các hợp chất của hỗn hợp 1 cách tốt nhất.
Câu 19: SK khí ghép khối phổ (GC-MS)
Một trong những phương tiện hữu ích giúp các nhà hóa học xác định cấu trúc hóa học của
hợp chất cần khảo sát là máy sắc ký khí ghép khối phổ. 1. Nguyên tắc
-Dòng khí thoát ra khỏi máy sắc ký khí được cho đi ngang qua một khóa để vào một ống,
nơi có một lỗ phân tử và dẫn đến buồng ion hóa của máy khối phổ. Người ta có thể có một khối
phổ đồ của mỗi cấu phần chứa trong hỗn hợp đã được chích vào máy săc ký lúc ban đầu.
-Hệ máy GC-MS có thể khảo sát một đơn chất hoặc một hỗn hợp.
-Trước tiên, máy sẽ tách mẫu, phân tích mẫu, kế đó, bộ phận máy tính của máy khối phổ
so sánh các dữ kiện vừa thu được với các số liệu phổ chuẩn đang chứa sẵn trong thư viện của
máy, để đề nghị cấu trúc hóa học của hợp chất (đơn chất hoặc hỗn hợp ) khảo sát, mỗi hợp chất
đề nghị này đều có ghi kèm độ tương hợp.
-Độ tương hợp càng lớn, trên 90%, cấu trúc của hợp chất khảo sát càng có khả năng là chất mà máy đề nghị. 26
-Để có thể khẳng định hơn về cấu trúc hóa học của hợp chất khảo sát, cần có thêm các loại
phổ khác như: IR; NMR…Máy đo khối phổ ghép vào máy sắc ký khí phải tương đối chặt chẽ và có hiệu năng cao. 2.
Thuận lợi và khó khăn khi kết hợp 2 loại máy Thuận lợi:
+ Tính bay hơi: cả 2 loại máy đều có thể phân tích tất cả các hợp chất khí, lỏng, rắn nếu
các hợp chất này có đặc tính áp suất hơi lớn.
+ Độ nhạy: máy khối phổ có độ nhạy cao, nên có thể phân tích những hợp chất khí đi ra từ một cột sắc ký.
+ Nhiệt độ: cột sắc ký khí và hệ thống nhận mẫu của máy khối phổ có thể hoạt động ở
khoảng nhiệt độ giống nhau.
+ Thời gian quét: máy khối phổ có vận tốc quét rất nhanh, đủ để ghi nhận hết các tín hiệu
đi ra từ một cột sắc ký khí. Khó khăn:
+ Áp suất: mỗi máy hoạt động trong một điều kiện áp suất khác nhau, nên sự kết hợp hai
máy với nhau là trở ngại lớn nhất.
+ Loại cột sắc ký: chỉ có một số loại cột sắc ký có thể sử dụng trong máy GC-MS. Các
loại cột polymer hữu cơ sẽ bị đứt mảnh khi nhiệt độ gia tăng, mảnh nhỏ này sẽ đi vào cột khối
phổ làm xuất hiện trên khối phổ những mũi rất đặc trưng, có thể gây nhầm lẫn là các mảnh ion của mẫu khảo sát.
+ Giá thành của máy cao: các phòng thí nghiệm bình thường không đủ tài chính để trang
bị loại máy này cho những hoạt động thường nhật.
+ Cần điều chế chất dẫn xuất cho mẫu khảo sát: nhiều loại hợp chất khảo sát, do tính
chất không thể bay hơi, nên cần phải được biến đổi thành các dẫn xuất bay hơi được, trước khi thực hiện sắc ký khí.
Câu 20: Nguyên tắc hoạt động và cấu tạo của máy SK lỏng hiệu năng cao 1. khái niệm:
HPLC là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha
tĩnh. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha, tức là
liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các
chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó. Thành phần pha động đưa chất phân tích
di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý.
2. Nguyên lý hoạt động, cơ chế tách chất:
Nguyên tắc hoạt động, cơ chế:
-là kĩ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh với pha động là chất lỏng.
-Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha, tức liên
quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các chất
ra khỏi cột phụ thuộc vào yếu tố này.
-Thành phần pha động đưa chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa
giải các chất phân tích với thời gian hợp lí.
3. Cấu tạo các bộ phận của máy HPLC 1.
Bình chưa dung môi giải ly cột.
Pha động trong sắc ký lỏng thường là dung môi hòa tan vào nhau để có khả năng tách với
độ phân giải phù hợp. Hệ dung môi ly giải cột được hút ra từ hai bình chứa dung môi.
Bình được làm bằng chất liệu trơ, thường là thủy tinh.
Bình luôn luôn có một cái nắp bảo vệ để không cho bụi rơi vào trong bình, nắp có lổ hở để
còn thông với khí trời.
Trong bình có một ống dẫn dung môi từ bình vào ống dẫn sắc ký, ở đầu này có gắn một nút
lọc bằng kim loại với mục đich lọc dung môi và cũng để giữ ống luôn ở dưới mặt thoáng của chất lỏng
Trước khi sử dụng, cần lọc (màng lọc 0,45um) và đổi khí hòa tan trong pha động, gọi là
khử bọt khí ( degassing).
Dung môi dùng cho HPLC: Máy bơm hút hai dung môi trong hai bình, đưa vào hộp phối
trộn.Có hai kiểu pha động trong việc giải ly : giải ly đơn nồng độ ( đẳng dong ), giải ly nồng độ
tang dần tuyến tính ( gradient)
Có hai kiểu thực hiện chương trình dung môi: 1.
Chương trình dung môi áp suất thấp.
− Ưu điểm: chỉ dùng một bơm
− Nhược điểm: Hệ thống ba vang lấy ba van phức tạp và chi phí cũng không kém
nhiều so với chương trình thứ 2 DM 1 Bơm DM 2 Bộ phận hòa Van mẫu trộn DM 3 a, áp suất thấp 2.
Chương trình dung môi áp suất cao. −
Ưu điểm: Điểm khác là chủ yếu một dung môi có một bơm riêng, việc hòa trộn được
thực hiện ở áp suất cao, có nồng độ đúng và độ lặp lại cao hơn
Nhược điểm : Tốn kém và cồng kềnh 28 DM 1 Bơm 1 Bộ phận Van mẫu DM 2 Bơm 2 hòa trộn Bơm 3 DM 3 b. áp suất cao.
Dung môi dùng trong HPLC: nước, các dung dịch loại đệm ( pha trong nước ).methanol, acetonitrile 1. Máy bơm
Là loại máy bơm đặc biệt, với áp suất cao lên đén 7000psi( 43,3 MPa) để bơm một dung
môi (pha động ) để xuyên ngang qua pha tĩnh.
Vận tốc thương khoảng 0,5-4,0ml/phút
Cấu tạo bằng chất liệu để chịu đựng được dung môi hữu cơ và các dung dịch đệm. 2.
Cột sắc ký ( và cột bảo vệ): Thường được chế tạo bằng thép không gỉ, thủy tinh
hoặc chất dẻo có chiều dài 10-30, đường kính trong 4-10mm.
Cột nhồi thường có hạt cỡ 5 hoặc 10um. Số đía lý thuyết giao động 40000 đến 60000/m
Điều nhiệt cột : Vận hành thiết bị thường ở nhiệt độ phòng không cần điều nhiệt cột. 3.
Bộ phận tiêm mẫu vào máy.
Máy HPLC có hệ thống tiêm mẫu đặc biệt: ống chứa mẫu ( sample loop).là van có hai cổng,
giúp định hướng dòng chảy của pha động chỉ có thể đi trên một trong hai con đường khác nhau.
Khi máy hoạt động đồng đều, pha động lỏng đi xuyên ngang qua cột sắc ký nhờ một máy bơm tạo áp suất cao.
Mẫu khẩu sát ( ở bên ngoài máy, áp suất thường) được tiêm vào máy nhờ một kiêm tiêm. 4. Đầu dò ( Detector)
Hoạt động của đầu dò nhằm theo dõi dòng chảy của dung môi giải ly cột để biết khi nào thì
các hợp chất đi ra khỏi cột.
Mức độ đắp ứng của đầu dò phải tỷ lệ với số lượng của mỗi chất phân tích hiện diện trong
hỗn hợp mẫu phân tích.
Một đầu dò HPLC lý tưởng đạt một số tiêu chuẩn như sau: − Độ bền cao −
Có độ nhạy cao và cho kết quả có tính lặp lại( reproducible ) −
Cho đáp ứng tương đồng đối với những chất phân tích có cấu trúc hóa học tương đồng −
Không thay đổi khi không có sự thay đổi nhiệt hoặc áp suất −
Có thời gian đáp ứng ngắn, độc lập với vận tốc của dòng chảy của dung môi giải ly − Dễ sử dụng −
Đầu dò theo dõi một tích chất hóa học đặc trưng −
Đầu dò theo dõi sự hiện diện một khối vật chất trong dung môi giải ly. − Đầu dò kết hợp.