Kỹ thuật lên men công nghiệp - Nghiên cứu khoa học | Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh

lOMoARcPSD|45316467 lOMoARcPSD|45316467
KỸ THUẬT LÊN MEN CÔNG NGHIỆP Đặc điểm Lên men mẻ Fed – batch Lên men liên tục
Hệ thống nuôi cấy Kín Bán kín Mở Bổ sung dinh dưỡng Không Có Có Lượng môi trường Không đổi Tăng Không đổi
Loại bỏ chất thải Không Không Có Nguy cơ tạp nhiễm Thấp Trung bình Rất cao Phase tăng trưởng Lag, log, ổn định, Lag, log, ổn định, Lag và log suy vong suy vong Log phase Ngắn dài Dài nhất và được duy trì Mật độ vi khuẩn
Thay đổi theo thời Thay đổi theo thời Duy trì gian gian
Năng suất sản phẩm Thấp Trung bình Cao
Câu 1: Trình bày vắn tắt quy trình lên men công nghiệp.
I. Quy trình lên men
1. Vẽ sơ đồ quy trình Trang 25 Tuyển chọn giốống Nguyên liệu Giữ giốống
Nuối cấốy giốống gốốc Mối trường (hoạt hóa giốống) Khử trùng Nhấn giốống ơs cấốp (nuối cấốy lắốc) Nhấn giốống thứ cấốp
(nốồi nuối cấốy mấồm) Nốồi lên men ảs n xuấốt Chiêốt thu dị ch sau nuối cấốy lOMoARcPSD|45316467
2. Mô tả vắn tắt từng bước của quy trình
2.1. Tuyển chọn giống
MỤC ĐÍCH: đảm bảo sinh tổng hợp đúng sản phẩm mong muốn với hàm lượng cao.
Một số tiêu chí tuyển chọn giống chủng phục vụ sản xuất công nghiệp:
- Đặc tính dinh dưỡng của chủng (dùng cơ chất thông dụng, rẻ tiền)
- Nhiệt độ tối thích của chủng (chọn chủng có nhiệt độ tối thích cao, giảm chi phí hệ
thống giải nhiệt trong lên men công nghiệp)
- Tính ổn định của chủng trong quá trình sử dụng
- Năng suất sinh tổng hợp sản phẩm cao - Dễ thu hồi sản phẩm
Phương pháp tuyển chọn giống:
a.1 Phương pháp truyền thống
- Phân lập từ môi trường tự nhiên với môi trường chọn lọc
- Tiến hành sàn lọc chủng có đặc tính mong đợi
- Đánh giá tuyển chọn giống đáp ứng yêu cầu
a.2 Phương pháp hiện đại: Sử dụng công nghệ gene và công nghệ sinh học phân tử
để cải tạo chủng với những thuộc tính mong đợi
2.2. Giữ giống
MỤC ĐÍCH: Việc giữ giống có vai trò rất quan trọng đối với một quy trình lên men
nhằm bảo đảm được nguồn cung cấp giống ổn định cho nghiên cứu và sản xuất.
Quá trình giữ giống cần phải bảo đảm một số yêu cầu:
- Duy trì hoạt tính giống trong thời gian dài, không xảy ra hiện tượng thoái hóa
giống, giảm khả năng tăng trưởng hoặc/ và giảm năng lực sản xuất của giống. - Không bị tạp nhiễm
- Ổn định về mặt số lượng
Có nhiều phương pháp giữ giống khác nhau trong công
nghiệp: o Giữ giống ở nhiệt độ thấp
+ Giữ giống trên môi trường thạch nghiêng: nhiệt độ giữ giống từ -20 – 5oC, khoảng 6 tháng phải cấy chuyền lOMoARcPSD|45316467
+ Giữ giống trong nito lỏng (đông sâu): giữ ở nhiệt độ thấp -150 ~ -196oC, giữ trong thời gian dài
o Giữ trong điều kiện khử nước
+ Nuôi cấy khô: Áp dụng đối với bào tử nấm sợi.
+ Giữ ở điều kiện khử nước trong giá thể: cát (giữ các vsv có bào tử); đất (giữ một số vi
sinh vật có bào tử như Clostridium pastetianum); silicagel; hạt ngũ cốc như lúa, ngô, kê...
+ Phương pháp đông khô: Làm đông dung dịch tế bào trong điều kiện chân không, kéo
theo sự thăng hoa của các phân tử nước. Ưu điểm: tỉ lệ sống sót của vi sinh vật cao, các
đặc tính di truyền không bị biến đổi và thời gian giữ giống lâu, ít tốn công sức cấy chuyển nhiều lần.
2.3. Hoạt hóa giống
Là bước quan trọng nhằm mục đích khôi phục lại hoạt tính sau thời gian giữ giống.
Phương pháp cấy chuyền thường được sử dụng để hoạt hóa giống. (từ ống nghiệm đĩa petri chọn khuẩn lạc) Yêu cầu: -
Đảm bảo hoạt tính chủng cao, (dừng ở log phase) -
Tạo điều kiện tối ưu để phát triển chủng (dinh dưỡng, pH, độ thoáng khí,…) - Không bị tạp nhiễm Lưu ý:
- Bề mặt thạch cần phải đảm bảo độ ẩm nhất định.
- Phải bảo đảm ria đều (theo đường zic-zăc) trên mặt thạch, không ria quá gần mép thạch nghiêng.
- Phải kiểm soát tốt thời gian ủ để đạt được lượng sinh khối với hoạt tính tối ưu và ổn định.
2.4. Nhân giống cấp 1,2,...
Mục đích: tạo một lượng sinh khối đủ lớn để đưa vào quy trình sản xuất. lOMoARcPSD|45316467
Quá trình nhân giống thường dừng lại ở giai đoạn cuối của log phase (khi hoạt tính giống tốt nhất). Yêu cầu: -
Đảm bảo hoạt tính chủng cao, (dừng ở log phase) -
Tạo điều kiện tối ưu để phát triển chủng (dinh dưỡng, pH, độ thoáng khí,…) - Không bị tạp nhiễm
Phương pháp: gồm hai giai đoạn:
a. Nhân giống sơ cấp
Được thực hiện trong phòng nhân giống (clean room) ở quy mô 100 – 500 ml với thiết bị:
- Máy lắc với bình tam giác có đủ không gian để lắc trộn dịch nuôi cấy và cung cấp
đủ lượng oxy cần thiết. Tốc độ lắc là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến tăng
trưởng của chủng trong quá trình nhân giống.
- Nồi lên men nhân giống với kích thước nhỏ, có đầy đủ các yếu tố bảo đảm cho
chủng phát triển tốt nhất
b. Nhân giống thứ cấp
Tùy theo quy trình mà hệ thống nhân giống thứ cấp được thực hiện qua một hoặc nhiều
bậc. Được thực hiện trong nồi nuôi cấy mầm với thể tích nạp giống tăng dần, khoảng 5 –
10% cho mỗi bậc. Thực hiện ở xưởng sản xuất.
2.5. Lên men sản xuất
Mục đích: Đây là công đoạn chính của quy trình, tạo ra sản phẩm chính của quá trình lên
men (sinh khối hoặc chất trao đổi)
Yêu cầu: đảm bảo điều kiện tối ưu như lượng tế bào cần thiết cho sản xuất, nhiệt độ, pH,
hàm lượng oxy hòa tan, nồng độ các cơ chất giới hạn để đạt hiệu quả lên men cao nhất
a. Các phương pháp lên men công nghiệp Lên men mẻ
Đây là một hệ thống nuôi cấy khép kín, giới hạn về dinh dưỡng, cơ chất dinh
dưỡng không được bổ sung trong suốt quá trình lên men, trải qua bốn phase khác
nhau (lag phase, log phase, phase ổn định và phase suy vong). Lên men liên tục lOMoARcPSD|45316467
Log phase được duy trì bằng cách bổ sung nguyên liệu vào nồi lên men và quá
trình này được lặp đi lặp lại cho đến khi nồi lên men đầy. Dịch lên men cũng có
thể được chiết ra liên tục trong quá trình nuôi cấy nhằm giữ thể tích của dịch lên
men trong nồi luôn ở mức ổn định cao nhất (tốc độ nạp liệu và tốc độ chiết dịch cân bằng). Phân loại: -
Hệ thống lên men liên tục thông thường -
Hệ thống lên men có thu hồi sinh khối -
Hệ thống lên men liên tục đa tầng
Lên men mẻ - bổ sung (fed – batch)
Là phương pháp nuôi cấy mà nguyên liệu được bổ sung vào nồi lên men liên tục
hay gián đoạn, dịch lên men có thể được chiết ra (hoặc không) trong quá trình nuôi
cấy. Ban đầu nuôi cấy theo mẻ, sau đó nguyên liệu được nạp vào nồi lên men. Phân loại -
Lên men mẻ bổ sung thay đổi thể tích -
Lên men mẻ bổ sung không thay đổi thể
tích b. Kiểm soát lên men Kiểm soát tăng trưởng
Mục đích: Hạn chế sự tăng trưởng của chủng trong những giai đoạn cần thiết của
quá trình lên men. Bất kỳ một hệ thống lên men nào cũng có sự giới hạn về công
suất thiết kế. Để đảm bảo cung cấp đủ nguồn dinh dưỡng, nguồn oxygen... cho vi
sinh vật giới hạn lượng tế bào tham gia sản xuất ở một mức nhất định, phù hợp với
công suất thiết kế. Ngoài ra, việc theo dõi mật độ tế bào theo thời gian còn giúp
nhận diện tình trạng bình thường hay bất thường của quá trình lên men, có xảy ra tạp nhiễm hay không.
o Các phương pháp định lượng lượng sinh khối hiện diện trong từng thời điểm của
quá trình nuôi cấy (theo dõi tăng trưởng):
- Phương pháp đếm trực tiếp: áp dụng đối với các vi sinh vật đơn bào có kích thước
lớn như nấm men, tảo,... Gồm phương phương pháp đếm trực tiếp dưới kính hiển
vi (sử dụng buồng đếm hồng cầu hoặc buồng đếm Breed) và phương pháp đếm
trực tiếp bằng kính hiển vi huỳnh quang.
- Phương pháp đếm khuẩn lạc: được thực hiện thông qua việc nuôi cấy mẫu trên môi trường đặc trưng.
- Thông qua máy đo mật độ quang (OD): là phương pháp gián tiếp rất thông dụng
để đánh giá nhanh sự biến động nồng độ tế bào trong quá trình nuôi cấy.
- Phân tích trọng lượng tế bào khô lOMoARcPSD|45316467
- Thông qua các thông số chỉ cường độ trao đổi chất: xác định lượng O2 hấp thụ
hoặc lượng CO2 sinh ra trong quá trình lên men. o
Phương pháp kiểm soát tăng trưởng:
- Bổ sung các chất ức chế tăng trưởng (Tween 40, 60, penicilin)
- Thay đổi yếu tố sinh lý (nhiệt độ, độ pH của môi trường lên men)
- Giới hạn hàm lượng cơ chất giới hạn Kiểm soát pH
Mục đích: bảo đảm pH sinh lý của tế bào trong quá trình phát triển và sinh tổng
hợp các chất . Tạo pH tối thích cho hệ enzyme của chủng nuôi cấy.
Tác nhân hiệu chỉnh pH: acid (H2SO4, HCl,...) hoặc kiềm (NaOH, KOH, NH3,
urea...). Các tác nhân này phải rẻ tiền, dễ hấp thụ, không làm thay đổi đáng kể thể
tích dịch lên men, không làm tăng đáng kể áp suất thẩm thấu trong môi trường, dễ tự động hóa.
Trong quy trình lên men công nghiệp thường sử dụng hệ thống kiểm soát pH tự động, gồm:
- Điện cực đo pH gắn trực tiếp vào bồn lên men
- Hệ thống trung chuyển và khuếch đại tín hiệu - Hệ thống điều khiển - Van tự động Kiểm soát nhiệt độ
Mục đích: cần duy trì nhiệt độ tối ưu cho chủng vsv phát triển vì nhiệt lượng có
thể thay đổi trong quá trình lên men Nhiệt sinh ra do:
- Hoạt động của vi sinh vật.
- Nguồn gốc vật lý: do khuấy trộn, nhiệt từ không khí sục vào,... (nhiệt lượng này không lớn).
Trong thực tế, người ta thường dùng nước nhiệt độ thấp (5~27 oC) để giải nhiệt
Thiết bị trao đổi nhiệt
- Hệ thống làm lạnh nước giải nhiệt hoặc hệ thống gia nhiệt
- Bơm cung cấp nước giải nhiệt
- Bộ cảm biến nhiệt tự động
Kiểm soát hàm lượng oxy hòa tan
Tùy theo chủng vi sinh vật và giai đoạn phát triển mà nhu cầu sử dụng oxygen là
khác nhau. Chủng kỵ khí không cần cung cấp oxygen trong quá trình lên men.
Chủng hiếu khí không bắt buộc thì trong từng giai đoạn của quá trình, nhu cầu sử
dụng oxygen khác nhau. Đối với chủng hiếu khí bắt buộc thì cần cung cấp oxygen
trong suốt quá trình nuôi cấy. lOMoARcPSD|45316467
o Oxygen từ không khí đi vào vi sinh vật thông qua 3 giai đoạn:
- Từ không khí vào dịch lên men
- Từ dịch lên men vào tế bào
- Sự sử dụng oxygen bởi tế bào vi sinh vật
o Vai trò của oxygen: tạo ATP và tái tạo NAD(P) từ NAD(P)H2.
o Hàm lượng oxygen hòa tan trong môi trường lên men phụ
thuộc: - Khả năng cung cấp không khí hoặc oxygen dạng khí
- Độ khuấy trộn dịch men
- Áp suất khí trong nồi lên men
o Hai chỉ số được quan tâm trong quá trình lên men:
- OTR (oxygen transfering rate): khả năng cung cấp oxygen tối đa của hệ thống, bị
giới hạn bởi công suất thiết kế của hệ thống.
- OAR (oxygen absorption rate) (B-ab): tốc độ sử dụng oxygen của chủng nuôi
cấy. Kiểm soát tốc độ bổ sung môi trường dinh dưỡng Mục đích:
- Tăng nồng độ sản phẩm.
- Hạn chế sự ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu lên vi sinh vật
- Duy trì nồng độ cơ chất giới hạn (thường là nguồn C) trong quá trình nuôi cấy. o Lưu ý:
- Chỉ nạp bổ sung đủ theo nhu cầu sử dụng của chủng, không nạp lượng quá dư
thừa dẫn đến việc thiếu oxygen cung cấp.
- Không nạp bổ sung thiếu làm hạn chế tốc độ tăng trưởng và tốc độ sản xuất của chủng.
o Các thành phần môi trường thường phải nạp bổ
sung: - Nguồn C: glucose, fructose, sucrose,... - Nguồn N: NH3, Urea,...
o Các phương pháp nạp bổ sung (thực hiện trong điều kiện vô trùng):
- Bổ sung liên tục: khó thực hiện, đòi hỏi hệ thống thiết bị hiện đại, nhân viên kỹ
thuật phải có trình độ tay nghề cao.
- Bổ sung gián đoạn: đơn giản hơn Kiểm soát bọt
o Hai quan điểm căn bản trong việc kiểm soát bọt:
- Kiểm soát trước quá trình: Xử lý nguyên liệu, làm giảm khả năng tạo bọt trước khi đưa vào quy trình.
- Ngăn chặn sự tạo bọt: loại trừ các yếu tố gây nên như thay đổi pH, nhiệt độ, thành
phần môi trường và kiểm soát bọt.
o Những trở ngại do bọt gây ra lOMoARcPSD|45316467
- Hiện tượng tự phân xảy ra mạnh, mất sinh khối tham gia sản xuất và tạo sự bền vững cho bọt.
- Gây suy giảm hoạt tính giống.
- Giảm thể tích nồi lên men.
- Bọt trào ra ngoài gây thất thoát một lượng lớn tế bào, giảm hiệu suất và sản lượng
lên men; gây ô nhiễm môi trường làm việc. -
o Ba loại phương pháp chống bọt:
- Phương pháp hóa học: Sử dụng các chất phá bọt vào môi trường nuôi cấy. Yêu cầu
của các chất phá bọt trong lên men công nghiệp:
+ Độ hòa tan thấp trong môi trường có bọt + Sức căng bề mặt kém
+ Khả năng khuếch tán trong môi trường lỏng cao
+ Không độc hại đối với vi sinh vật
+ Không được sử dụng bởi vi sinh vật
+ Không gây ảnh hưởng ngược đến nguồn cung cấp oxygen + Bền đối với nhiệt
+ Không gây trở ngại đối với các quy trình sau đó
+ Không gây ảnh hưởng xấu đối với sản phẩm
+ Hoạt động tốt ở nồng độ thấp
+ Duy trì hoạt tính tốt trong thời gian dài Phân loại: + Chất béo tự nhiên
+ Cồn có mạch C cao (8C – khả năng phá bọt tương đối thấp) + Các dẫn xuất sorbitol + Polyether (M>2000) + Dầu silicon - Phương pháp nhiệt
- Phương pháp cơ học: thông thường kết hợp thiết bị cơ khí với dùng các chất phá
bọt. Phương tiện cơ học phá bọt cần: + Hao tốn năng lượng ít + Cấu trúc đơn giản
+ Dễ vệ sinh, dễ khử trùng
+ Không cần bảo trì nhiều
II. Hệ thống thiết bị 1. Bồn lên men vẽ hình chú thích lOMoARcPSD|45316467 Trang 28
2. Thiết bị cảm biến bao gồm ở mục trên
Hệ thống các đầu dò cảm biến (sensor) để điều khiển pH, nhiệt độ, độ oxygen hòa tan
(DO2), phá bọt tự động,...
3. Các thiết bị phụ trợ - Thiết bị giải nhiệt
- Hệ thống phân phối khí
- Hệ thống thoát khí và hồi lưu dịch bọt tan
- Các đường ống: nạp liệu, nạp giống, lấy mẫu, đường xả dịch...
- Hệ thống cung cấp oxygen
- Hệ thống chuẩn bị và khử trùng môi trường liên tục - Lò hơi - Tháp lưu lOMoARcPSD|45316467
Câu 2: Trình bày vắn tắt các vấn đề liên quan đến việc chuẩn bị môi trường trong lên men công nghiệp.
1. Mục đích và yêu cầu môi trường nuôi cấy Mục đích
Thiết kế môi trường chứa thành phần thích hợp, bảo đảm đủ lượng cho chủng vi
sinh vật sinh trưởng, phát triển, tăng sinh khối, tạo các chất trao đổi và cung cấp
đủ năng lượng cho việc duy trì mật độ tế bào và sự sinh tổng hợp tạo sản phẩm. Yêu cầu
- Tăng cường tối đa hiệu suất tạo sinh khối hoặc/ và sản phẩm
- Tăng cường tối đa nồng độ sinh khối hoặc sản phẩm
- Cho phép tạo được tốc độ sản xuất tối đa
- Hạn chế đến mức tối thiểu hiệu suất tổng hợp các sản phẩm không mong
muốn, thành phần rẻ, dễ chuẩn bị, sẵn có quanh năm
- Ổn sịnh chất lượng và sẵn sàng cho sử dụng quanh năm
- Hạn chế đến mức tối thiểu việc xảy ra các vấn đề trong quá trình chuẩn bị
và khử trùng môi trường
- Hạn chế đến mức tối thiểu các vấn đề nảy sinh như gây trở nảy cho việc
khuấy trộn, chiết tách, tinh sạch và xử lý chất thải
Lưu ý: việc chọn môi trường có liên quan mật thiết đến việc thiết kế nồi lên men,
ảnh hưởng đến quá trình thu hồi sản phẩm và quá trình xử lý chất thải sau lên men
và các yếu tố liên quan đến pháp luật, văn hóa, tôn giáo,...
2. Vẽ sơ đồ quy trình chuẩn bị môi trường lên men công nghiệp lOMoARcPSD|45316467
Xác định chủng vi sinh vật (nhu cấồu dinh dưỡ ng), phươ ng phá lên men và sản phẩm mục têu
Khảo sát nhu cấồu dinh dưỡ ng ủc a chủ ng, nguốồnơc chấốtự tr c
têốp ạt o ra ảs n phẩ m và hệ
thốống thiêốtị b - cống nghệ menlên Thiêốt kêố mốiườtr ng lên men Chuẩn bị mối trường Pha mối trường Khử trùng mối trường Đánh giá mối trường
3. Thiết kế môi trường lên men a. Phản ứng
[C và E] + [N2] + O2 + [Khoáng/vi lượng] + H2O Sinh khối + Sản phẩm (P) + CO2 + H2O + Nhiệt (Q)
Thành phần môi trường bao gồm các yếu tố đa lượng, trung lượng và vi lượng:
- Yếu tố đa lượng: nguồn nước, nguồn carbon, nguồn nito.
- Yếu tố vi lượng: nguồn muối khoáng, nguồn vitamin, các chất hỗ trợ tăng trường, chất kiểm soát,...
b. Công thức ước định chung của vi sinh vật
Trong tính toán kỹ thuật, sử dụng công thức ước định chung của vi sinh vật là
CH1,8O0,5N0,2 với trọng lượng phân tử tế bào được xác định là 24,6
4. Các thành phần của môi trường
a. Nguồn đa lượng: C/N ... lOMoARcPSD|45316467
- Nước: tế bào vi sinh vật chứa 70% là nước, đây là yếu tố quan trọng trong môi trường
lên men. Nguồn nước cung cấp phải ổn định, sạch, bảo đảm độ pH, muối khoáng, mức độ
tạp khuẩn. Có thể tái sử dụng nguồn nước thu hồi từ một số quá trình khác cho quá trình
lên men nhằm giảm tải cho quá trình xử lý nước thải.
- Năng lượng: năng lượng cho sự tăng trưởng của vi sinh vật bắt nguồn từ sự oxy hóa các
thành phần dinh dưỡng trong môi trường hoặc từ ánh sáng. Các chủng thường dùng trong
công nghiệp là hóa dưỡng. Trong đó, chu trình TCA cung cấp acid hữu cơ là khung C,
cung cấp các chất mang năng lượng lớn như NADH, FADH, tổng hợp ATP cung cấp năng lượng cho tế bào.
- Nguồn C có ảnh hưởng đến sự tổng hợp sinh khối hay các hợp chất sơ cấp, thứ cấp.
Nguồn C được lựa chọn dựa trên sản phẩm chính của quy trình, giá thành và độ tinh
khiết. Nguồn C thường dùng là carbonhydrate, mật rỉ đường, dầu, mỡ, hydrocarbon và dẫn xuất,…
- Nguồn N: Hầu hết các chủng vi sinh vật trong công nghiệp có thể dùng cả nguồn vô cơ
(ammonia, nitrate, nitrite) và hữu cơ (amino acid, protein, cao nấm men, urea, dịch chiết
thịt,…). Các muối của ammonium thường gây nên tính acid khi vi sinh vật sử dụng NH4+
và giải phóng gốc acid tự do. Mặt khác, khi gốc nitrate được sử dụng thì gây nên sự thay
đổi dần sang điều kiện kiềm. Tuy nhiên vẫn có một số ngoại lệ tùy thuộc vào chủng vi
sinh vật. Trong nhiều trường hợp, sự tăng trưởng của chủng sẽ nhanh hơn nếu chúng ta
cung cấp nguồn N là hữu cơ, và một số chủng vi sinh vật đòi hỏi một số amino acid nhất
định cho tăng trưởng (ví dụ như các chủng đột biến khuyết dưỡng amino acid trong lên
men amino acid công nghiệp). Các amino acid dùng để bổ sung vào môi trường nuôi cấy
là nguồn N hữu cơ phức tạp, thường không đồng nhất, rẻ tiền, ổn định. Hợp chất N làm
nguồn cung cấp amino acid là dịch chiết cao bắp, dịch đậu nành, cao nấm men,….; ngoài
ra còn bổ sung các yếu tố khác như vitamin, khoáng. Tuy nhiên, trong sản xuất vaccines
cho người cần sử dụng amino acid tinh khiết.
b. Nguồn vi lượng/ khoáng
Hầu hết vi sinh vật cần nguyên tố trung – vi lượng cho sự tăng trưởng, trao đổi chất và
sản sinh các hợp chất thứ cấp. Các chất này thường rất ít nhưng cũng là những nguyên tố
đóng vai trò quan trọng và được bổ sung sau vào bồn lên men với các nồng độ khác nhau
tùy vào môi trường và nhu cầu của vi sinh vật nuôi cấy, tránh gây độc cho tế bào. Trong
thực tế, hàm lượng của các nguyên tố này trong nguyên liệu không ổn định (vì nguồn gốc
tự nhiên) nên cần phân tích môi trường để bổ sung theo nhu cầu của vi sinh vật. Khi dùng
môi trường tổng hợp, cần phải bổ sung một lượng chính xác các nguyên tố vi lượng. lOMoARcPSD|45316467
Ngoài những vai trò trên, phosphate còn được bổ sung với vai trò là chất đệm, giảm sự thay đổi pH.
c. Nguồn bổ sung/ kiểm soát tăng trưởng/ cảm ứng
- Chelator (Chất kìm): các chất chelator nồng độ thấp như ethylene diamine tetraacetic
acid (EDTA), citric acid, polyphosphates … được bổ sung dần vào môi trường trong quá
trình nuôi cấy nhằm ngăn chặn sự hình thành các phosphate kim loại không tan, tránh
lắng cặn làm giảm nồng độ các chất cần thiết và cản trở quá trình thu hồi sản phẩm, vệ
sinh thiết bị. Đối với môi trường dùng ở qui mô công nghiệp, không cần phải bổ sung
chelator, do các thành phần phức sẽ tạo phức với kim loại và bảo đảm rằng kim loại được giải phóng dần.
- Nhân tố tăng trưởng: Nhân tố tăng trưởng là những tiền chất như vitamin, amino acid,
acid béo,… được bổ sung khi chủng vi sinh vật không thể tổng hợp. Chúng thường có
trong nguồn nguyên liệu tự nhiên cung cấp C, N hoặc được bổ sung thêm nếu môi trường không đủ.
- Chất đệm pH: Một số hợp chất khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy ngoài vai trò là
thành phần dinh dưỡng, còn đóng vai trò đặc trưng là chất đệm nhằm điều chỉnh pH ở
một giá trị ổn định ở giá trị tối ưu. Một số hệ đệm được sử dụng như CaCO3, đệm phosphate,…
- Chất tiền thân (precusor): hóa chất được bổ sung vào một số loại môi trường lên men hỗ
trợ trực tiếp cho việc tổng hợp một sản phẩm mong muốn.
- Chất kìm hãm: Khi bổ sung các chất kìm hãm vào môi trường lên men, một sản phẩm
đặc trưng nhất định sẽ được tổng hợp nhiều hơn, hoặc một chất trao đổi trung gian theo
con đường thông thường sẽ được tích lũy dần.
- Chất cảm ứng: Được bổ sung để cảm ứng sinh tổng hợp enzyme. Hầu hết các chất cảm
ứng là các cơ chất tương đồng với chất cảm ứng tự nhiên của enzyme nhưng cũng có khi
là chất trao đổi trung gian hoặc sản phẩm làm chất cảm ứng. Đối với các sản phẩm
protein gây độc cho tế bào, việc chất cảm ứng được bổ sung sau khi đã tạo đủ lượng sinh khối trong bồn lên men.
* Yêu cầu về oxy: oxygen đóng vai trò rất quan trọng đối với sự tăng trưởng và sự sinh
tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật. Tính chất của môi trường có thể ảnh
hưởng lên hàm lượng oxy khi hoạt động đường hóa của vi sinh vật có sử dụng oxy, độ
nhớt của môi trường ảnh hưởng đến khả năng sục khí và sự hiện diện các chất tạo bọt ảnh hưởng sự hòa tan oxy. lOMoARcPSD|45316467
5. Khử trùng môi trường
Mục đích: Loại bỏ các yếu tố gây tạp nhiễm sinh học (như nấm mốc, nấm men, vi
khuẩn, phage) nhằm nâng cao hiệu quả của quá trình lên men sản xuất hoặc thí nghiệm. Yêu cầu khi khử trùng
- Loại bỏ một phần hoặc toàn bộ tác nhân gây nhiễm sinh học (tế bào sinh dưỡng và bào tử)
- không gây nên những biến đổi đáng kể về chất –lượng của môi trường. Không
tạo ra các chất độc hại có thể gây kìm hãm hay ức chế sự phát triển của chủng
- Tác nhân khử trùng không độc hại đối, thao tác đơn giản, rẻ tiền, dễ áp dụng cho
qui mô sản xuất lớn, dễ tự động hóa.
Có 2 phương pháp khử trùng môi trường trong nuôi cấy vi sinh vật:
- Phương pháp dùng hơi nước: thuận lợi, dễ áp dụng.
+ Gia nhiệt gián tiếp: như trong trường hợp của autoclave, khử trùng liên tục.
+ Gia nhiệt trực tiếp như trong trường hợp của khử trùng theo mẻ.
- Phương pháp lọc: dành cho môi trường lỏng, đồng nhất, cặn bã thô trong
môi trường ít; thành phần môi trường có các chất kém bền với nhiệt độ
hoặc chiếu xạ, hoặc môi trường có chứa các thành phần dễ bay hơi.
Hai dạng khử trùng môi trường:
- Khử trùng theo phương pháp liên tục: thường được dùng Ưu điểm:
+ Duy trì tốt chất lượng môi trường sau khử trùng.
+ Dễ dàng nâng cấp quy mô sản xuất.
+ Dễ dàng kiểm soát tự động.
+ Giảm sự tăng thể tích môi trường do hơi nước ngưng tụ.
+ Lượng tiêu thụ của hơi nước nóng ổn định trong suốt quá trình.
+ Giảm thiểu sự ăn mòn nồi lên men.
Gồm hai giai đoạn: khử trùng thiết bị của hệ thống và khử trùng môi trường
- Khử trùng theo phương pháp mẻ: toàn bộ các thành phần môi trường được
chuẩn bị trong nồi lên men, sau đó gia nhiệt trực tiếp vào bồn đến khi đạt
nhiệt độ nhất định cần cho khử trùng (121 – 125oC).
Ưu điểm: thao tác đơn giản, dễ thực hiện, dễ kiểm soát quá trình khử trùng
và hiệu quả khử trùng tốt.
Nhược điểm: thời gian gia nhiệt dài, làm nguội môi trường chậm tổng thời
gian chịu nhiệt của môi trường cao, gây ảnh hưởng đến chất lượng của môi
trường sau khi khử trùng; thể tích môi trường sau khử trùng tăng lên lOMoARcPSD|45316467
rất đáng kể giảm nồng độ các chất trong môi trường; tính tự động hóa kém.
6. Đánh giá môi trường Mục đích:
- Bảo đảm về mặt kỹ thuật: phù hợp, hiệu quả cao, môi trường dùng được,
môi trường thích hợp tăng sinh khối/ thu sinh khối.
- Yếu tố kinh tế: giá thành sản xuất thấp, tính ổn định.
- Yếu tố an toàn cho sản phẩm
Đánh giá môi trường dựa trên các tiêu chí:
- Thành phần các chất môi trường.
- Hàm lượng nguyên liệu.
- Chất lượng nguyên liệu.
- Giá cả của nguyên liệu.
- Tính ổn định của nguồn nguyên liệu.
Câu 3: Trình bày vắn tắt phương pháp thu hồi – tinh sạch sản phẩm lên men công nghiệp.
1. Nêu nguyên tắc/ các điểm lưu ý thu hồi sản phẩm lên men
Nguyên tắc: Thu dịch lên men → loại dần các thành phần không phải mục
tiêu → thu hồi sản phẩm mục tiêu hoặc trực tiếp thu sản phẩm mục tiêu ra
khỏi tạp chất từ dịch lên men.
Chọn lựa quy trình thu hồi dựa trên các tiêu chí:
- Xác định loại môi trường lên men (rắn, bán rắn hay môi trường lỏng).
- Sản phẩm thu nhận là nội bào hay ngoại bào.
- Nồng độ sản phẩm trong dịch lên men.
- Đặc tính lý – hóa của sản phẩm (giúp cho việc lựa chọn phương án tách)
- Mục đích sử dụng của sản phẩm
- Độ tinh khiết thấp nhất có thể chấp nhận được
- Tầm quan trọng của độc tính sinh học của sản phẩm và của dịch lên men
- Độ tạp chất trong dịch lên men
- Giá cả thị trường của sản phẩm Lưu ý
Lên men và thu hồi sản phẩm là hai giai đoạn liên tục của một quá trình và có sự tác động tương hổ. lOMoARcPSD|45316467
- Các thông số liên quan trong quy trình thu nhận enzyme: thời gian thu
hoạch, sự sản xuất các phân tử màu, lực ion và thành phần môi trường nuôi cấy.
- Dịch nổi có chứa enzyme cần phải được xử lý ngay sau khi thu nhận dịch lên men.
- Sự sản xuất ra các chất màu gây trở ngại lớn cho quy trình thu hồi do chứng
liên kết với resin giống như các enzyme.
- Chất phá bọt còn lại trong dịch lên men gây ảnh hưởng đến hệ thống lọc
tinh hoặc nhựa trao đổi.
- Hàm lượng các ion trong môi trường sản xuất có thể quá cao dẫn đến việc
cần phải pha loãng dịch nổi sau ly tâm với nước đã được khử khoáng trước
khi đưa dịch nổi vào công đoạn xử lý.
2. Lập sơ đồ thu hồi sản phẩm
3. Mô tả vắn tắt các bước của quy trình + 4. Nêu các công cụ (phương pháp) cho từng
bước cụ thể (vắn tắt)
a. Tách chiết tế bào
Tế bào vi sinh và các nguyên liệu không tan có thể được tách ra ngay khi thu nhận dịch
lên men bằng cách lọc hoặc ly tâm. Do kích thước của tế bào vi sinh rất nhỏ nên có thể
dùng thêm các hệ thống hỗ trợ nhằm tăng cường tốc độ tách loại.
Công cụ tách chiết tế bào:
Phương pháp lắng tủa: chỉ phù hợp thu nhận dịch nổi lOMoARcPSD|45316467
Dựa trên sự kết lắng do trọng lực của chất rắn trong môi trường nước.
Các phương pháp thúc đẩy quá trình lắng:
- Phương pháp tạo keo tụ:
+ Thay đổi pH (nếu không ảnh hưởng đến các bước tiếp theo)
+ Bổ sung các chất có khả năng làm đông tụ: Muối calcium, muối Fe, acid
tanic, titan chloride, chất đa điện phân, hàn the,...
+ Bổ sung các loại keo có điện tích nghịch
- Gia nhiệt dung dịch lên men
Phương pháp ly tâm: Dựa vào trọng lực của tế bào, lực ly tâm phụ thuộc vào tốc
độ quay của rotor và bán kính thùng quay. Thiết bị được sử dụng máy ly tâm liên tục
Phương pháp lọc: là quá trình phân riêng hỗn hợp không đồng nhất về mặt kích
thước qua lớp lọc. Sử dụng để thu sinh khối các chủng vi sinh vật có kích thước tế
bào lớn. Hiệu quả nhất khi dùng thu nhận sinh khối tảo (kích thước lớn).
Các phương pháp lọc thường sử dụng:
- Lọc chân không thùng quay - Lọc khung bản - Lọc tiếp tuyến
Yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lọc: -
Chênh lệch áp suất: độ lệch áp (P) trước và sau màng lọc chính là động lực của quá
trình lọc, P càng lớn thì tốc độ lọc càng cao. -
Chất trợ lọc: Tăng cường tốc độ lọc và hiệu quả lọc. Các bột trợ lọc thường dùng:
diatomit, perolit, amiang, mùn cưa, than hoạt tính,... Bột trợ lọc thường sử dụng bằng 2
cách: hòa bột trợ lọc vào huyền phù (dùng cho hệ thống lọc liên tục) và phủ một lớp bột
trợ lọc lên bề mặt của màng lọc.
- Vật ngăn lọc: ngăn cản và giữ lại pha rắn, bề dày của vật ngăn lọc và tính chất của nó
ảnh hưởng quan trọng đến tốc độ lọc. Vật ngăn lọc thường phải xốp, mỏng và dễ thay thế
như vải lọc, màng xốp, tơ nhân tạo hay cát sỏi...
Phương pháp tạo bọt: Phân tách tế bào ra khỏi dịch lên men dựa trên sự khác nhau
về độ hoạt động bề mặt của các chất. Hiện nay không áp dụng phương pháp này trong công nghiệp. b. Phá tế bào
Để thu nhận các sản phẩm được tạo ra bên trong tế bào vi sinh vật, sau khi được thu
nhận, tế bào được phá màng bằng các phương pháp vật lý, hóa học hoặc sinh học để giải phóng các chất nội bào.
Công cụ phá tế bào: lOMoARcPSD|45316467 Phương pháp vật lý
- Đông lạnh – giải đông: Ly giải tế bào vi khuẩn và tế bào động vật hữu nhũ.
Phương pháp này không gây biến tính protein mục tiêu, không bổ sung bất kỳ loại
hóa chất nào, tuy nhiên cho hiệu quả ly giải thấp, tốn nhiều thời gian.
- Phương pháp trượt rắn: Ít sử dụng ở quy mô công nghiệp vì không thể dùng một
lượng lớn nguyên liệu để phá vỡ tế bào.
- Phương pháp trượt lỏng: Đặc biệt thuận lợi cho phá vỡ tế bào vi khuẩn và nấm
men, sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và quy mô công nghiệp.
- Phương pháp nghiền: Tế bào được phá vỡ bằng phương pháp cơ học nhờ hệ thống
chứa một dãy đĩa quay và hạt nhỏ (bằng thủy tinh, alumina ceremide hay các hợp chất titan).
- Phương pháp siêu âm: Sử dụng sóng có tần số cao để phá tế bào. Phương pháp này
đơn giản, dễ thực hiện và không cần bổ sung chất vào hỗn hợp cần tách nhưng chi phí
đầu tư cao và lực tác động mạnh nên có thể làm vỡ các sản phẩm nhạy cảm với lực. Phương pháp hóa học
- Dùng áp suất thẩm thấu: Chỉ áp dụng cho những tế bào không có vách như tế bào
động vật. Đối với các tế bào có vách phải xử lý thêm bằng các enzyme phá vách
như lysosyme, celluloase, pectinase, hemicellulase... để loại vách tế bào trước khi
xử lý bằng phương pháp áp suất thẩm thấu.
Ưu điểm: thực hiện nhanh chóng, dễ làm, ít tốn chi phí, không cần tốn thời gian và
công sức để loại bỏ các tạp chất hóa học, không cần dụng cụ hay máy móc phức tạp.
Nhược điểm: khi phá màng tế bào trực tiếp trong dịch lên men, lượng dung dịch
cần dùng là rất lớn khó thu lại dịch tế bào với nồng độ cao, đậm đặc
- Dùng các tác nhân acid và base: Dùng acid thủy phân các thành phần tế bào là
phương pháp hóa học phổ biến nhất. Trong trường hợp enzyme ổn định ở giá trị
pH cao có thể dùng dung dịch kiềm để phân giải các tế bào vi khuẩn
- Dùng chất phá màng: Phá vỡ các tương tác lipid, protein xung quanh tế bào
+ Phá màng bằng chất tẩy rửa: Gồm ba loại: cation, anion và ion. + Dùng dung môi
Phương pháp sinh học – enzyme
- Đơn giản, hiệu quả nhưng tốn kém và sự hiện diện của enzyme có thể làm phức
tạp các quá trình tách chiết phía sau.
- Nguyên tắc: enzyme hoạt động phân hủy peptidoglycan và thủy phân các liên kết glucosid lOMoARcPSD|45316467
- Lysozyme: phá hủy thành tế bào vi khuẩn thông qua xúc tác sự thủy phân của liên
kết 1,4-β giữa các tiểu phâng N-acetylmuranic acid và N-acetyl-D-glucosamid trong chitodextrins.
c. Thu sản phẩm thô
Chiến lược thu hồi được quyết định từ khi chọn giống. Dịch lên men được phân đoạn
hoặc được chiết tách nhờ đưa vào hệ thống phân đoạn chính thu được phân đoạn có chứa sản phẩm mục tiêu.
Công cụ/ phương pháp thu sản phẩm thô
- Phương pháp chiết lỏng – lỏng: Tách dựa trên sự chuyển pha giữa các chất từ pha
lỏng này sang pha lỏng khác do tính tan của chúng khác nhau trong hai pha lỏng
riêng biệt (một pha chứa chất cần thiết, pha còn lại là dung môi chiết).
- Chiết tĩnh: Có thể chiết một lần hoặc nhiều lần. Phương pháp chiết nhiều lần
dùng cùng một loại dung môi để thu được hoàn toàn lượng chất cần thiết. Áp
dụng trong phòng thí nghiệm hóa học nhỏ, thiết bị là phễu chiết.
- Chiết ngược dòng: Được ứng dụng nhiều trong chiết sản xuất công nghiệp đạt
hiệu quả cao. Hai pha lỏng không trộn được vào được bơm liên tục và đi ngược
chiều nhau. Hoặc chỉ một dung môi chuyển động, pha còn lại đứng yên. Chất
phân tích được phân bố vào hai dung môi theo tính chất để đạt đến trạng thái cân bằng.
Ưu và nhược điểm chung:
+ Dùng cho cả chiết phân tích và sản xuất tách chiết lượng lớn
+ Lấy riêng chất phân tích, loại được các chất ảnh hưởng
+ Thích hợp làm giàu lượng nhỏ chất phân tích (10-50 lần)
+ Chiết được cả chất vô cơ và chất hữu cơ
+ Sản phẩm chiết phù hợp cho nhiều phương pháp phân tích
Phương pháp thẩm tích: Dùng để loại các phân tử lượng thấp như muối khoáng và
đường nhưng không phân biệt được các loại protein với nhau. Thẩm tích là sự
khuếch tán vi phân qua màng vốn không thấm đối với những chất keo hòa tan
(protein, một số polysaccharide) nhưng thấm đối với các dạng dịch tinh thể (muối,
hợp chất hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp...).
Phương pháp kết tủa: Để thu nhận các phân tử sinh học, nhất là protein và enzyme.
- Kết tủa bằng muối: Là phương pháp phổ biến để tủa protein và enzyme. Các muối
(NH4)2SO4 và NaCl được dùng để tủa protein do vừa làm trung hòa điện vừa loại
bỏ lớp vỏ hydrate của phân tử protein mà không làm ảnh hưởng đến hoạt tính và
cấu trúc. Các protein khác nhau có thể bị kết tủa với nồng độ muối khác nhau lOMoARcPSD|45316467
có thể dùng muối ở các nồng độ khác nhau để tách riêng protein ra khỏi hỗn hợp.
Ở nồng độ muối thấp, tính tan của protein tăng nhẹ (salting in); ở nồng độ muối
cao, tính tan của protein giảm mạnh (salting out).
- Kết tủa bằng dung môi hữu cơ: Dựa vào quá trình solvat hóa của nước đối với
những protein mang điện tích và sự ưa nước sẽ giảm khi nồng độ dung môi tăng,
do sự giảm hằng số điện môi trong dung dịch. Các phân tử xung quanh vùng kỵ
nước của protein bị thay thế bởi các phân tử dung môi, làm cho các protein tiến
gần nhau hơn tạo nên lực tương tác tĩnh điện và lưỡng cực, các protein tập hợp lại và kết tủa.
- Phương pháp điểm đẳng điện (pI): Mức độ tủa của protein phụ thuộc vào pH của
dung dịch protein. Ở pH thấp, protein tích điện dương; ở pH cao, protein tích điện
âm. Tại giá trị pI, protein không tích điện, làm giảm tính tan của protein, protein
tách ra khỏi môi trường và kết tủa.
- Tủa bằng non-ionic polymer: Cho thêm non-ionic (dextrans, polyethylene
glycols...) vào dung dịch protein làm cho số lượng phân tử nước tương tác với protein giảm.
- Tủa bằng ion kim loại: Ion kim loại gắn lên một phần của phân tử protein. Có 3
nhóm ion kim loại: (1) các ion như Mn2+, Fe2+, Co2+, Zn2+ và Cd2+ gắn chặt vào các
acid carboxylic và các hợp chất có chứa nitrogen; (2) các ion như Ca2+, Ba2+, Mg2+ và
Pb2+ gắn với nhóm chức acid carboxylic; (3) các ion như Ag+, Hg+ và Pb2+ gắn chặt
với nhóm có chứa lưu huỳnh.
Ưu điểm: có thể tủa protein trong dung dịch rất loãng.
d. Thu sản phẩm tinh
Sản phẩm thô được tinh sạch để loại tạp chất để thu được sản phẩm với độ tinh sạch đạt
yêu cầu của sản phẩm. Sản phẩm thô sẽ được tinh chế bằng cách đông tụ phân đoạn, sắc
ký để đạt được độ tinh sạch cao và sau đó kết tinh thu hồi sản phẩm.
Công cụ/ phương pháp thu sản phẩm tinh
Phương pháp sắc kí: quá trình phân tách từng phần hỗn hợp các chất do sự phân bố
không đều trong pha động và pha tĩnh. Sắc kí lọc gel, sắc ký ion và sắc ký ái lực là các
phương pháp được dùng phổ biến để tinh sạch sản phẩm.
Sắc ký lọc gel: dựa trên sự di chuyển khác nhau của các chất hòa tan trong hỗn
hợp. Cơ sở của phương pháp là dựa vào sự khác nhau về kích thước, hình dạng và
phân tử lượng của phân tử. Pha động là dung môi chứa hỗn hợp chất cần phân tách
và pha tĩnh là cột chứa gel. Phân tử có kích thước lớn len lõi qua khoảng không