Lý thuyết thực hành môn sinh học phân tử –Trường Đại học Nguyễn Tất Thành

CHIẾT TÁCH DNA BỘ GEN VI KHUẨN
Vi khuẩn Bacillus Subtilis: + Vi khuẩn Gram dương
+ Thành tế bào: Peptidoglycan + Màng tế
bào: lớp đôi phospholipit NST: DNA trần,
không liên kết protein, nằm trong tế bào
Kích thước: DNA bộ gen B.subtilis: xấp xỉ 4,2mb = 4,2.106 bp
* Nguyên tắc: 3 bước
- Phá vỡ tế bào: phương pháp vật lý/ hóa học ( phá thành, phá màng )
- Chiết lấy axit nucleic ( loại protein ): sử dụng phenol
- Kết tủa axit nucleic: cồn tuyệt đối / isopropanol
* Phương pháp SDS – KOAC
- Enzym DNAse hoạt động để cắt đứt DNA khi có mặt của cofactor (Mg2+)
- EDTA + Mg2+ → Phức chelat → Bất hoạt DNAse
- SDS (Sodium dodecyl sulfat) + Protein → SDS – Protein: tan trong nước
- KOAC + SDS – Protein → KDS – Protein tủa
* Quy trình thực hiện:
B1: Nuôi cấy trong môi trường LB
37°C: nhiệt độ tối ưu để vi khuẩn phát triển
12 – 16h: thời gian phù hợp để đạt đủ số lượng, đảm bảo cho việc VK ở cuối pha tăng trưởng, đầu pha ổn định
B2: Ly tâm bỏ dịch → Lấy cắn tế bào
B3: Phân tán trong ĐLG – B
- NaCl: duy trì áp suất thẩm thấu → TB không đóng vón, không bị phá vỡ khi phân tán
- EDTA: Bất hoạt DNAse do cạnh tranh tạo phức với Mg2+, Ca2+ → bảo vệ DNA → Dịch đục
B4: Cho lysozyme (phá vỡ thành tb), ủ 37°C, 10 phút, ly tâm, bỏ dịch → lấy Cắn
B5: Phân tán trong ĐLG – N (đệm ly giải Nucleic) = pipet, ủ 80°C 5 phút → RT
- SDS: Phá màng TB, biến tính protein ( rửa trôi lipit )
- Tris – HCl: Ổn định pH, bảo vệ DNA được giải phóng ở
bước sau → Dịch trong B6: thêm Đệm tủa protein, ủ đá 5
phút → Ly tâm → hút dịch nổi sang eppendorf mới
KOAC: tạo phức KDS tủa – kéo theo protein tủa → Dịch nổi chứa DNA B7: Tủa với isopropanol → Ly tâm bỏ dịch nổi V iso-pro : V dịch ADN = ⅔ : 1 → Cắn DNA
B8: Rửa cắn với EtOH 70% (cồn) → Ly tâm bỏ dịch → Cắn AND đã loại muối
B9: Hòa tan cắn trong Q1 (nước khử khoáng) + Rnase ủ 37°C – 30 phút để loại bỏ ARN
→ Bảo quản mẫu ở 4°C ( trong thời gian ngắn ) hoặc -20°C ( trong thời gian dài )
CÂU HỎI THẢO LUẬN
1. Các bước trong n guyên tắc chiết AND bộ gen ? Tên hóa chất ? - Phá vỡ TB: lysozyme, SDS
- Chiết lấy axit nucleic: SDS, KOAC
- Kết tủa axit nucleic: + tủa AND: isopropanol + Làm sạch AND: cồn 70°
2. Vai trò đệm ly giải Bacillus:
- EDTA: bất hoạt DNAse → bảo vệ ADN
- NaCl: duy trì áp suất thẩm thấu → TB không bị đóng vón, vỡ khi phân tán * Vai trò Lysozyme:
- Phá vỡ thành TB * Vai trò ĐLG – N:
- SDS: phá vỡ tb, biến tính protein
- Tris – HCl: Ổn định pH, bảo vệ ADN được giải phóng ở bước sau
* Đệm tủa Protein:
- KOAC: tạo phức KDS tủa → kéo theo Pro tủa
3. Điều kiện nuôi B.subtilis để chiết DNA
- môi trường LB, 37°C, 12- 16h nuôi qua đêm
4. Hiện tượng xảy ra sau khi thêm ĐLG – N:
- dịch trong do SDS phá vỡ màng TB, thành phần bên trong tràn vào dịch tách chiết, không còn màng → Dịch trong
* Hiện tượng xảy ra khi do đệm tủa Pro:
- Có tủa trắng bởi có KOAC → theo Protein
- Trong dịch nối: (ADN, muối khoáng là thành phần có trong dịch nổi khi sau ly tâm)
- Tủa trắng: ( Protein, một số mảnh vỡ của TB )
5. Điều kiện để tủa DNA đang tan trong dung dịch
- Viso : V dịch ADN = ⅔ : 1 ( sử dụng isopropanol )
6. Vai trò cồn 70°: làm sạch ADN ( loại bỏ muối thừa )
- Vì cồn 70° là 30% H2O, 70% cồn nên H2O hòa tan muối → loại bỏ được muối khoáng
- Không sử dụng cồn thấp độ hơn được vì để giữ ADN ở trạng thái tủa, nhiều H2O sẽ làm ADN tan trong nước.
7. Bảo quản DNA trong các dung dịch: TE 0,1; H2O Q1 để bảo quản
- Bảo quản ADN trong thời gian dài: TE 0,1 vì có EDTA và Tris – HCl
8. Sử dụng nước khử khoáng trong sinh học phân tử vì:
- H2O khử khoáng là H2O đã khử hết ion KL, nếu còn ion KL các bước sau sẽ tác dụng các enzym → nên tránh
9. RNAse có vai trò: cắt đứt, loại bỏ RNA 10. Bảo quản DNA: - Thời gian ngắn: 4°C - Thời gian dài: -20°C
CHIẾT TÁCH PLASMID PBLUESCRIPT TỪ E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MẪU NHỎ
Escherichia coli: + Vi khuẩn Gram âm
+ Thành TB: màng ngoài + peptidoglycan ( tỉ lệ lipid cao )
+ Màng TB: lớp đôi phospholipit
* Nguyên tắc: 3 bước chính
1. Phá vỡ = phương pháp (vật lý, hóa học –SDS) để giải phóng DNA
2. Loại bỏ DNA bộ gen + protein + mảnh vỡ tb → Thu dịch DNA plasmid
3. Kết tủa (EtOH 100%, isopropanol) và làm sạch DNA plasmid
Phương pháp mẫu nhỏ/ minirep: chiết DNA plasmid từ lượng nhỏ thể tích dịch nuôi cấy nhỏ (1 – 2ml)
* Quy trình thực hiện:
B1: Nuôi cấy trong môi trường LB + kháng sinh Ampicillin, 37°C, 12 – 16h → Ly tâm bỏ dịch thu lấy cắn TB
B2: Phân vào trong GTE
- Glucose: Duy trì áp suất thẩm thấu, cân bằng bên trong và ngoài TB → TB không bị đóng
vón, không bị vỡ khi phân tán
- Tris base: Ổn định pH, bảo vệ DNA được giải phóng bước sau
- EDTA: bất hoạt DNAse do cạnh tranh tạo phức với Mg2+, Ca2+ → Bảo vệ DNA → Dịch đục
B3: Trộn với SDS – kiềm:
- SDS: Phá màng TB, biến tính protein ( SDS – Ptan )
- Kiềm: biến tính DNA ( loại tạp protein và ADN NST )
→ Dịch trong, nhớt do TB ly giải
B4: Trộn với KOAC – pH 4.8
- Hồi tính plasmid → Tan, DNA NST không thể hồi tính → Tủa
- K+ + SDS: Tạo phức KDS tủa → Kéo theo ADN bộ gen và protein tủa
- K+: tăng hiệu suất tủa ADN plasmid ở bước sau
→ Dịch đục với nhiều tủa trắng B5: Ly tâm bỏ tủa
→ Dịch nổi chứa ADN plasmid
B6: Tủa với EtOH tuyệt
đối, lạnh ( cation hóa trị I ) V EtOH : V dịchADN = 2,5 : 1
→ Ly tâm bỏ dịch thu lấy cắn AND plasmid
B7: Rửa cắn với EtOH 70% ( 30% nước đủ để rửa loại muối )
→ Cắn ADN plasmid đã loại muối
B8: Hòa tan cắn trong Q1 + Rnase. ủ 37°C – 30phut để loại bỏ ARN
→ Bảo quản mẫu ở 4°C ( thời gian ngắn ) và -20°C ( thời gian dài ) * DNA plasmid:
- DNA nhỏ, mạch kép, dạng vòng
- Kích thước ≤ 8% ADN bộ gen
- Số lượng: 1 hay nhiều bản sao tùy loại plasmid
- Có khả năng nhân đôi độc lập với ADN bộ gen
* So sánh ADN plasmid và ADN bộ gen
- Giống: bản chất là ADN sợi đôi, dạng vòng ADN plasmid ADN bộ gen ( NST ) Kích thước
Nhỏ, plasmid lớn nhất = 8% NST Lớn Số lượng bản sao Nhiều Một
Tính bắt buộc có trong TB Không bắt buộc Bắt buộc
* Tách DNA plasmid và DNA NST
Phương pháp ly giải kiềm: loại DNA NST ra khỏi DNA plasmid dựa vào kích thước và cấu dạng
- Kiềm: biến tính DNA plasmid và DNA NST ( cắt đứt liên kết hydro giữa 2 mạch DNA)
- Dung dịch có tính axit: trung hòa pH dung dịch, hồi tính DNA (liên kết hydro giữa 2
mạch được hình thành): DNA plasmid kích thước ngắn, cấu dạng gọn nên hồi tính dễ, tan
trong dung dịch; DNA NST kích thước lớn, cấu dạng cồng kềnh nên khó hồi tính, bị tủa trong dung dịch. * Cấu trúc DNA plasmid:
- Có yếu tố đánh dấu để chọn lọc dòng tái tổ hợp ( thường là 1 hay nhiều gen đề kháng kháng sinh )
- Có điểm khởi đầu sao chép (Ori) cho nhân bản plasmid trong TB chất không phụ thuộc
NST. Trình tự của Ori quyết định số bản sao của plasmid trong TB
- Có vùng tạo dòng (Multipe Cloning Site – MCS): là 1 trình tự ADN ngắn, mang nhiều
trình tự nhận diện duy nhất của các RE khác nhau nằm liên tiếp ( picly linker ), cho phép cắt
mở vòng plasmid và nối đoạn gen mong muốn vào *DNA plasmid pBluescript:
- Plasmid nhân tạo, thế hệ F3
- Kích thước: 3000bp = 3kb
- Mang gen đề kháng Ampicillin - Dùng để tạo dòng
CÂU HỎI THẢO LUẬN
1. Plasmid là gì ? Đặc điểm của plasmid pBluescript ?
- Plasmid là phân tử ADN sợi đôi, mạch kép dạng vòng, kín, có kích thước rất nhỏ, không
mang hệ gen chính của bộ gen, có thể nhân bản độc lập với NST tế bào
- Plasmid pBluescript: plasmid nhân tạo, thế hệ F3, mang gen đề kháng Ampicillin, dùng để
tạo dòng Điều kiện nuôi vi khuẩn E.coli chiết plasmid pBluescript
2. Vai trò Ampicillin ?
- Ampicillin đóng vai trò là 1 yếu tố, áp lực bắt buộc vi khuẩn phải sản xuất và duy trì ra
plasmid mình mong muốn
- Điều kiện nuôi VK E.coli chiết plasmid:
Nuôi cấy trong môi trường LB + kháng sinh Ampicillin, 37°C, 12 – 16h
3. Tại sao cần phân tán cắn hoàn trong GTE ?
- Tại phân tán trong GTE giúp TB không bị đóng vón cục, nếu mà đóng vón thì ở bước sau chỉ tác
động tới mấy TB đóng vón mà ở bên ngoài còn bên trong không tác động được nhiều → hiệu suất
thấp hơn. Nên phân tán hoàn toàn trong GTE để tất cả TB ko bị đóng vón tác động được hiệu quả hơn ở những bước sau
4. Nguyên tắc loại DNA NST ra khỏi DNA plasmid
- Phương pháp ly giải kiềm: loại DNA NST ra khỏi DNA plasmid dựa vào kích thước và cấu dạng
- Kiềm: biến tính DNA plasmid và DNA NST ( cắt đứt liên kết hydro giữa 2 mạch DNA)
- Dung dịch có tính axit: trung hòa pH dung dịch, hồi tính DNA (liên kết hydro giữa 2
mạch được hình thành): DNA plasmid kích thước ngắn, cấu dạng gọn nên hồi tính dễ, tan
trong dung dịch; DNA NST kích thước lớn, cấu dạng cồng kềnh nên khó hồi tính, bị tủa trong dung dịch.
5. Hiện tượng gì xảy ra sau khi thêm SDS – kiềm/KOAC ? Giải thích ? Thành
phần có trong dịch nổi và tủa trắng sau khi ly tâm KOAc
- SDS: phá màng TB, biến tính protein
- Kiềm: biến tính DNA
→ Dung dịch trong, vì tế bào bị vỡ. Độ nhớt tăng vì ADN protein bọc lộ ra ngoài ( TB ly giải )
6. Biến tính/ hồi tính DNA là gì ? Các phương pháp biến tính DNA ?
- Biến tính là tách sợi đôi thành sợi đơn, cắt đứt liên kết hidro DNA plasmid
- Hồi tính là ghép hai sợi đơn lại với nhau tạo thành sợi đôi, hình thành liên kết hidro
- Các phương pháp biến tính DNA:
+ Phương pháp biến tính: dùng kiềm biến tính DNA NST và DNA plasmid ( cắt đứt liên kết hidro giữa hai mạch DNA )
7. Điều kiện để tủa DNA đang tan trong dung dịch ? Tính thể tích cồn tuyệt đối
cần để tủa 500ul dịch chứa DNA
- Điều kiện: TE 0,1; H2O Q1 để bảo quản
- Bảo quản ADN trong thời gian dài: TE 0,1 vì có EDTA và Tris – HCl
8. Kích thước plasmid tỉ lệ nghịch với hiệu suất chiết plasmid ? Giải thích
đúng vì plasmid có kích thước càng lớn thì hiệu suất chiết tách càng giảm vì plasmid KT lớn thì
khó hồi tính, lúc cho KOAc vào sẽ ly tâm thu dịch thì dịch chứa lượng plasmid ít do nằm nhiều ở
pha tủa nên pha tan chứa ít lượng plasmid → hiệu suất chiết tách thấp BUỔI 4:
PHẦN CÂU HỎI THẢO LUẬN:
1. Các bước trong nguyên tắc chiết DNA bộ gen? Kể tên hóa chất tương ứng mỗi bước?
- Phá vỡ tb: lysozym phá thành, sarcosyl phá màng
- chiết lấy axit nucleic: phenol
- kết tủa axit nucleic: cồn tuyệt đối
2. Thành phần của đệm BB? Vai trò của BB và từng chất trong đệm BB
- Thành phần đệm BB gồm EDTA: bất hoạt DNAse do cạnh tranh tạo phức
với cation2+ ( BẢO VỆ ADN) NaCl: duy trì áp suất thẩm thấu – vai trò: để tế bà
o không đóng vón, không vỡ khi phân tán
- vai trò đệm BB: GIÚP PHÂN TÁN TB
3. Điều kiện nuôi vi khuẩn B.subtilis để chiết DNA?
- B. subtilis/LB 37°C, 12-16h
4. Hiện tượng xảy ra sau khi thêm BB? Giải thích? - Dịch đục
- Do cắn té bào phân tán thành từng tế bào riêng lẻ
5. Hóa chất phá thành và màng tế bào vi khuẩn trong bài? Giải thích cơ chế?
- Lysozym: phá vỡ thành TB bằng cắt liên kết giữa NAG và NAM của peptidoglycan
- Sarcosyl: phá màng TB vì có có khả năng nhũ hóa
6. Hiện tương sau khi cho PCI? Giải thích (Dịch nổi trên cùng)
- Chia thành 3 pha rõ rệt: lớp dưới cùng là phenol, lớp giữa là tủa protein biến tính, trên cùng là lớp DNA- RNA
- Bởi vì PCI có các tính chất:
+ Phenol, chloroform: biến tính, kết tủa protein + Chloroform: loại phenol
+ Isoamyl alcohol: giảm tạo bọt, ổn định pha
7. Giải thích cơ chế loại tạp protein ra khỏi DNA bằng PCI?
Phenol có độ phân cực kém hơn nước → ADN kém tan trong phenol, tan tốt trong nước.
+ Gây biến tính protein → Kéo protein tan trong phenol
- phenol trộn với lớp nước sẽ tạo thành nhũ tương giọt dầu trong nước. Các protein có trong
nước sẽ bị biến tính và hòa vào trong phenol, trong khi ADN vẫn ở nguyên trong nước.
- Sau khi hỗn hợp được đem ly tâm, hai lớp phenol và nước lại tách nhau ra. Lớp nước bên trên
chứa ADN được hút ra và phần dịch phenol có protein sẽ bị loại bỏ.
8. Tính thể tích NaOAc 3M và EtOH 100% thêm vào để kết tủa 500 μl dịch nổi chứa DNA?
+ 50 μl NaOAc 3M (VNaOAc:Vdịch ADN = 1:10) +1000 μl cồn tuyệt đối, lạnh (Vcồn:Vdịch
ADN = 2,5:1) Úp ngửa, ly tâm, bỏ dịch 500:10=50
9. Bảo quản DNA trong các dung dịch nào? Để bảo quản DNA trong thời gian dài
nên sử dụng dung dịch nào? Giải thích?
- TE 0,1 ; H2O Q1 để bảo quản - Thời gian dài : TE 0,1 vì có EDTA và Tris-HCl
10. Tại sao sử dụng nước khử khoáng trong sinh học phân tử?
H2O khử khoáng là H2O để khử hết ion kim loại, nếu còn ion kim loại các bước sau sẽ tác dụng các enzym 11. Vai trò RNAse?
- Cắt đứt, loại bỏ RNA
12. Nhiệt độ bảo quản DNA trong thời gian ngắn, thời gian dài?
- Thời gian ngắn 4 độ C, thời gian dài -20°C
PHẦN CÂU HỎI BÀI TẬP:
Câu 1: Bước nào trong quy trình dùng để đánh giá độ tinh khiết và xác định nồng độ DNA
plasmid? Phương pháp dùng để định lượng DNA plasmid là gì?
Bước 1 vì muốn đánh giá độ tinh khiêt phải lập tỉ số
A= 0D260/OD280 , SAU ĐÓ ĐÁNH GIÁ ĐỘ TINH KHIẾT Pp đo quang
Câu 2: Giải thích và nhận xét độ tinh khiết của mẫu Y? Trong trường hợp không tinh
khiết, hãy đề xuất cách xử lý mẫu?
Dung dịch DNA sạch, không cần xử lý
Câu 3: Tính nồng độ DNA sợi đôi trong mẫu Y? OD260: OD280 = 1.86 TINH SẠCH KH CẦN XỬ LÝ [DNA]= OD260xAx Độ pha loãng 0.28x50x25=
Câu 4: mục đích của bước 2 trong quy trình là gì?
Hỗ trợ trong việc định danh con vi khuẩn
Câu 5: mục đích của bước 3 trong quy trình là gì?
Điện di: ktra sản phẩm có đúng kích thước không
Định tính DNA , XÁC ĐỊNH KÍCH THƯỚC BẰNG CÁCH CHẠY TRÊN ĐIỆN DI TRÊN Câu 6: Marker là gì?
MARKER ( HỖN HỢP CỦA CÁC DNA KHÁC NHAU)
Câu7: Chứng dương, vi khuẩn B có phải là
A.baumanii không? Giải thích? SO SÁNH MẪU Y VỚI CÁI BẢNG ĐIỆN DI
CHỨNG DƯƠNG: LÀ CHỨNG MÀ BIẾT TRC CON ĐÓ
CHIẾU LÊN BẢNG ĐIỆN DI RỒI SO SÁNH RA 2 BĂNG THÌ NÓ LÀ
CON ABAUMANII KHÔNG THẤY BĂNG THÌ NÓ KH PHẢI
Câu 8: Vì sao băng 250 bp cách giếng xa hơn so với băng 500bp?
NGUYÊN LÍ ĐIỆN DI, VÌ CÙNG 1 VTRI XUẤT PHÁT KÍCH THƯỚC NHỎ HƠN THÌ
TỐC ĐỘ NHANH HƠN, QUÃNG ĐƯỜNG GIẾNG XA HƠN
PHỤ THUỐC VÀO KÍCH THƯỚC VÀ CẤU DẠNG Tuần 5
1. Các bước trong nguyên tắc chiết DNA bộ gen? Kể tên hóa chất tương ứng mỗi bước 2. Vai trò của TE?
3. Vai trò của proteinase K?
4. Vai trò của NaCl 5M? Dùng NaCl 0,1 M được không? Giải thích. 5. Vai trò của CTAB?
6. Hiện tương sau khi cho Choroform – isoamyl acohol (24:1) và ly tâm? Thành phần trong lớp nước?
7. Hiện tương sau khi cho Phenol - Choroform – isoamyl acohol (25:24:1) và ly tâm? Thành phần lớp chloroform?
8. Lớp phân cách giữa lớp
chloroform và nước chứa gì? Protein 9Hóa chất tủa DNA?
9. Hóa chất để loại muối trong quy trình?
10. Câu 1: Bước nào trong quy trình dùng để đánh giá độ tinh khiết và xác định nồng độ
DNA? Phương pháp dùng để định lượng DNA plasmid là gì?
11. Câu 2: Giải thích và nhận xét độ tinh khiết của mẫu Y? Trong trường hợp không tinh
khiết, hãy đề xuất cách xử lý mẫu?
12. Câu 3: Tính nồng độ DNA sợi đôi trong mẫu Y?
13. Câu 4: Phân tích các bước trong chương trình nhiệt phát hiện gen blaTEM
14. Câu 5: Biết thể tích cho 1 phản ứng PCR phát hiện gen tetB là 25 μl, nồng độ cuối của
mồi TetB – F là 1 μM. Tính thể tích mồi TetB – F 10 μM dùng cho 1 phản ứng PCR?
15. Câu 6: Biết thể tích cho 1 phản ứng PCR phát hiện gen tetB là 25 μl, nồng độ cuối của Tag DNA polymerase là 1
U. Tính thể tích Tag DNA polymerase 5U/ μl dùng để pha master mix cho 6 phản ứng PCR?
16. Câu 7: Đặc điểm của mồi trong PCR? 1 phản ứng PCR đơn thuần cần bao nhiêu cặp mồi?
17. Câu 8: Vi khuẩn B có đề kháng với kháng sinh nhóm Tetracyclin không? Có khả năng
sinh enzyme ESBL không? Giải thích?
18. Câu 9: Vì sao phải chạy marker song song với mẫu thử?
19. Câu 10: Tốc độ di chuyển của DNA phụ thuộc vào các yếu tố nào? Bằng DNA nào
(gen BlaTEM và TetB ) có quãng đường di chuyển xa hơn? Giải thích?