PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thiết bị và hóa chất
Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: máy ly tâm lạnh (Mikro 12-24, Hettich,
Đức), cân phân tích (AB104-S, Mettler Toledo, Thụy Sỹ), tủ sấy (BE 200, Memmert,
Đức), bể ủ (Memmert, Đức), máy vortex (ZX3, Velp, Ý), micropipette 100 µL, 500 µL,
1000 µL (ThermolLabsystems), máy đo quang phổ (Thermo Scientific Multiskan GO, Phần Lan).
Hóa chất: trolox (Sigma-Aldrich), K2S2O8 (Merck), Na2CO3 (Merck), gallic acid (Merck),
Folin-Ciocalteu’s phenol reagent (Merck), K3Fe(CN) 6 (Merck), Cl CCOOH 3 (Merck),
FeCl3 (Sigma-Aldrich), NaNO2 (Xilong), 2, 2-Diphenyl-1-Picrylhydrazyl (Sigma-
Aldrich), 2,2- azino-bis (3-ethylbanzthiazoline-6-sulphonic acid (Germany), 2, 4, 6-
tripyridyl-s-triazine (Sigma-Aldrich), NH4Mo7O .4H 24
2O (Xilong), Dimethyl sulfoxide
(Merck), enzyme α-amylase (Sigma-Aldrich), enzyme α-glucosidase (Sigma-Aldrich),
acarbose (Sigma-Aldrich), thibarbituric acid (Merck) và một số hóa chất khác.
1. Phương pháp định lượng polyphenol và flavonoid
Định lượng polyphenol
Hàm lượng polyphenol được xác định theo phương pháp của Singleton et al. (1999) có
hiệu chỉnh. Hỗn hợp phản ứng gồm 250 L cao chiết trong 250 L nước và 250 L thuốc
thử Folin-Ciocalteu, lắc đều. Sau đó, thêm vào 250 o L Na2CO
3 10% rồi ủ 30 phút ở 40 C
trong bể điều nhiệt. Độ hấp thu quang phổ của hỗn hợp phản ứng được đo ở bước sóng
765 nm. Gallic acid được sử dụng như chất đối chứng dương để xây dựng phương trình
đường chuẩn. Hàm lượng polyphenol trong các cao chiết được xác định dựa trên phương
trình đường chuẩn gallic acid.
Định lượng flavonoid
Hàm lượng flavonoid được xác định bằng phương pháp so màu AlCl 3 của Bag et al.
(2015) có hiệu chỉnh. Hỗn hợp phản ứng gồm 1 mL cao chiết pha trong 1 mL nước rồi
lắc đều. Sau đó, hỗn hợp phản ứng được thêm vào 200 µL NaNO2 5%, để yên 5 phút tiếp
tục thêm 200 µL AlCl 310%, lắc đều. Hỗn hợp phản ứng sau khi ủ 6 phút được thêm 2
mL NaOH 1M. Cuối cùng nước được thêm vào cho đủ 5 mL và đo độ hấp thu quang phổ
ở bước sóng 510 nm. Quercetin được sử dụng như chất đối chứng dương. Hàm lượng
flavonoid toàn phần trong các cao chiết được xác định dựa vào phương trình đường chuẩn quercetin.
2. Phương pháp kháng sát hoạt tính kháng oxy hóa
Phương pháp kháng oxy hóa tổng (total antioxidant capacity)
Hoạt tính kháng oxy hoá tổng của các cao chiết được đánh giá theo mô tả của Prieto et al.
(1999). Cao chiết ở các nồng độ khác nhau với thể tích là 300 µL đã được kết hợp với
900 µL dung dịch thử (0,6 M acid sulfuric, 28 mM sodium phosphate và 4 mM
ammonium molybdate). Dung dịch phản ứng được ủ ở 95°C trong 90 phút. Sau đó, độ
hấp thu quang phổ của dung dịch được đo ở bước sóng 695 nm.
Phương pháp trung hòa gốc tự do ABTS•+ (2,2-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6- sulfonic acid))
Hoạt tính kháng oxy hóa được xác định bằng phương pháp khử màu ABTS•+ mô tả bởi
Nenadis et al. (2004). ABTS•+ được tạo ra bởi phản ứng ABTS 7 mM với 2,45 mM kali
persulfate. Hỗn hợp được ủ trong bóng tối ở nhiệt độ phòng 12-16 giờ trước khi sử
dụng. Sau đó, hỗn hợp được pha loãng và đo đô r hấp thu quang phổ ở bước sóng 734 nm
là 0,70±0,05. Tiến hành khảo sát bằng cách cho 10 L cao chiết phản ứng với 990 L
ABTS•+ ở nhiệt độ phòng trong 6 phút. Sau đó, hỗn hợp phản ứng được đo độ hấp thu
quang phổ ở bước sóng 734 nm.
Phương pháp RP (Reducing power)
Khả năng khử sắt của các cao chiết được thực hiện theo phương pháp của Oyaizu (1986).
Hỗn hợp phản ứng lần lượt gồm 500 µL cao chiết, 500 µL đệm phosphate (0,2 M, pH=6,6) và 500 µL K o 3Fe(CN)
6 1%. Sau khi hỗn hợp phản ứng được ủ ở 50 C trong 20
phút, thêm 500 µL CCl3COOH 10% rồi ly tâm 3000 vòng/ phút trong 10 phút. Phần dịch
sau khi ly tâm được rút 500 µL cho vào 500 µL nước và 100 µL FeCl3 0,1%, lắc đều. Độ
hấp thu quang phổ của hỗn hợp phản ứng được đo ở bước sóng 700 nm.
Khảo sát hiệu quả trung hòa gốc tự do DPPH (2, 2-Diphenyl-1-Picrylhydrazyl)
Khả năng kháng oxy hóa của các cao chiết được xác định nhờ phương pháp trung hòa
gốc tự do DPPH của Sharma & Bhat (2009) có hiệu chỉnh. Hỗn hợp phản ứng gồm 40 µL
DPPH (1000 µg/mL) và 960 µL cao chiết. Hỗn hợp phản ứng được ủ trong tối 30 C trong o
thời gian 30 phút. Sau đó, đo độ hấp thu quang phổ của DPPH ở bước sóng 517 nm.
Phương pháp FRAP (Ferric reducing-antioxidant power)
Tiềm năng kháng oxy hoá của các cao chiết được xác định bằng cách sử dụng khả năng
khử FRAP (Benzie & Strain, 1996) có hiệu chỉnh. Nguyên tắc của phương pháp này dựa
trên việc giảm phức hợp ferric-tripyridyltriazine. Cao chiết ở các nồng độ khác nhau (10
μL) được cho phản ứng với dung dịch FRAP (990 μL) trong 30 phút trong điều kiện tối.
Xác định đô r hấp thu quang phổ ở bước sóng 593 nm.
Khảo sát khả năng trung hòa gốc tự do nitric oxide (NO•)
Khả năng trung hòa gốc tự do nitric oxide (NO•) của các cao chiết được khảo sát theo
Alisi & Onyeze (2008) có hiệu chỉnh. Hỗn hợp phản ứng gồm 200 μL cao chiết và 400
μL sodiumnitroprusside (5 mM). Hỗn hợp phản ứng được ủ 60 phút ở 25 , ℃ rồi ly tâm
11000 vòng/ phút trong 15 phút. Dịch ly tâm được bổ sung 600 μL thuốc thử Griess. Sau
đó mẫu được ủ tiếp 5 phút và tiến hành xác định độ hấp thu quang phổ ở bước sóng 546 nm.
{ các phương pháp khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa trolox được sử dụng làm đối chứng
dương. Khả năng kháng oxy của các cao chiết được so sánh với chất chuẩn trolox bằng
cách sử dụng nồng độ (µg/mL) mà tại đó chất chuẩn hay cao chiết khử hoặc trung hòa
được 50% gốc tự do (EC -effective concentration 50 of 50%). Giá trị EC của 50 các cao chiết
và trolox được xác định theo mô tả của Piaru et al. (2012).
3. Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng khuẩn
Phương pháp khuếch tán giếng thạch được sử dụng để xác định đường kính vòng kháng
khuẩn. Mỗi loại cao cân 0,01 g được hòa tan trong 1000 µL DMSO 10% (nồng độ của
các cao chiết lúc này là 10.000 µg/mL). Sau đó các cao được pha loãng với dung môi
DMSO 10% thành các dung dịch có nồng độ: 160, 320, 640, 1280, 2560 µg/mL. Dịch vi
khuẩn sau khi pha loãng trong nước muối sinh lý có mật độ quang tại bước sóng 600 nm là 0,5 (OD =0,5). Sau đó 600
cấy trải 100 µL dịch vi khuẩn lên bề mặt đĩa petri có chứa môi
trường thạch Luria Bertani (LB), để khô, đục 5 giếng có đường kính 9 mm. Bổ sung 50
µL cao chiết ở các nồng độ 160, 320, 640, 1280, 2560 µg/mL vào các giếng trên đĩa petri
có chứa môi trường thạch LB và dịch vi khuẩn thử nghiệm. Mẫu thử nghiệm được ủ ở nhiệt độ 37 C o
trong 24 giờ. Sau 24 giờ, đường kính vòng kháng khuẩn xuất hiện xung
quanh giếng trên đĩa thạch được ghi nhận (Trần Chí Linh , 2020). và ctv
4. Phương pháp khảo sát hoạt tính ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase
Khảo sát hoạt tính ức chế enzyme α-amylase của các cao chiết
Khả năng ức chế sự thủy phân tinh bột của các cao chiết được thực hiện theo phương
pháp của Xiao-Ping et al. (2010) có hiệu chỉnh. Hỗn hợp phản ứng gồm có 50 μL dung
dịch đệm phosphate (pH=7) với 50 μL cao chiết và 50 μL enzyme α-amylase (3 U/mL)
được đem ủ ở nhiệt độ 37oC trong 5 phút. Sau đó, 50 μL tinh bột (2 mg/mL) được cho
vào hỗn hợp trên và tiếp tục ủ 37oC trong 15 phút. Tiếp theo, 200 μL dung dịch HCl đậm
đặc được thêm vào để ngừng phản ứng. Cuối cùng, 300 µL dung dịch thuốc thử iod được
thêm vào để nhận biết lượng tinh bột còn dư sau phản ứng dựa trên phản ứng màu xanh
đặc trưng. Hỗn hợp trên được đo độ hấp thu quang phổ của phức hợp tinh bột-iod ở bước
sóng 660 nm. Acarbose được sử dụng như đối chứng dương. Phần trăm bị ức chế (%) = 100–((A –A o 1)/Ao×100). Với: A :
o đô r hấp thu quang phổ của dung dịch đối chứng. A1: đô r
hấp thu quang phổ của dung dịch sau phản ứng. Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase của
các cao chiết cây cò sen được xác định dựa vào nồng đô r mà tại đó cao chiết hay chất
chuẩn ức chế được 50% sự biến tính (IC50- inhibitory concentration of 50%).
Khảo sát hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các cao chiết
Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các cao chiết được thực hiện theo phương
pháp của Shai et al. (2011) có hiệu chỉnh. Hỗn hợp phản ứng chứa 100 μL dung dịch đệm
phosphate (100 mM, pH=6,8), 20 μL enzyme α-glucosidase (1 U/mL), và 40 μL cao
chiết. Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 37°C trong 15 phút. Sau đó, 40 μL p-nitro-phenyl-α-D-
glucopyranoside (5 mM) được thêm vào và ủ thêm ở 37°C trong 20 phút. Phản ứng được
dừng lại bằng cách thêm 100 μL Na2CO3 (0,1 M). Độ hấp thu quang phổ của hợp chất p-
nitrophenol giải phóng được đo tại bước sóng 405 nm. Acarbose được sử dụng như chất
chuẩn. Kết quả được biểu thị dưới dạng phần trăm ức chế, được tính bằng công thức:
Hoạt động ức chế (%) = (1–Ao/A1)×100. Với: A :
o đô r hấp thu quang phổ của dung dịch
đối chứng. A1: đô r hấp thu quang phổ của dung dịch sau phản ứng. Hoạt tính ức chế
enzyme α-glucosidase của các cao chiết cây cò sen được xác định dựa vào nồng đô r mà tại
đó cao chiết hay chất chuẩn ức chế được 50% sự biến tính (IC50- inhibitory concentration of 50%)
Tài liệu tham khảo:
Bag, G.C., Devi, P.G., Bhaigyabati, T., 2015. Assessment of total flavonoid content and
antioxidant activity of methanolic rhizome extract of three Hedychium species of
Manipur Valley. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research. 30(1): 154-159.
Alisi, C.S., Onyeze, G.O.C., 2008. Nitric oxide scavenging ability of ethyl acetate
fraction of methanolic leaf extracts of Chromolaena odorata (Linn.). African
Journal of Biochemistry Research. 2(7): 145-150.
Benzie, I.F.F., Strain, J.J., 1996. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a
measure of ‘antioxidant power’: the FRAP assay”. Analytical Biochemistry. 239(1): 70-76.
Nenadis, N., Wang, L.F., Tsimidou, M., Zhang, H.Y., 2004. Estimation of scavenging
activity of phenolic compounds using the ABTS•+ assay. Journal of Agricultural
and Food Chemistry. 52: 4669-4674.
Oyaizu, M., 1986. Studies on product of browning reaction prepared from glucoseamine.
The Japanese Journal of Nutrition and Dietetics. 44(6): 307-316.
Piaru, S.P., Mahmud, R., Abdul Majid, A.M.S., Mahmoud Nassar, Z.D., 2012.
Antioxidant and antiangiogenic activities of the essential oils of Myristica
fragrans and Morinda citrifolia. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 5(4): 294-298.
Prieto, P., Pineda, M., Aguilar, M., 1999. Spectrophotometric quantification of
antioxidant capacity through the formation of a phosphomolybdenum complex:
Specific application to the determination of vitamin E. Analytical Biochemistry. 269: 337-341.
Shai, L.J., Magano, S.R., Lebelo, S.L., Mogale, A.M., 2011. Inhibitory effects of five
medicinal plants on rat alpha-glucosidase: Comparison with their effects on yeast
alpha-glucosidase. Journal of Medicinal Plants Research. 5: 2863-2867.
Sharma, O.P., Bhat, T.K., 2009. DPPH antioxidant assay revisited. Food chemistry. 113: 1202-1205.
Singleton, V.L., Orthofer, R., Lamuela–Raventos, R.M., 1999. Analysis of total phenol
and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent. Method Enzymol. 299: 152-178.
Trần Chí Linh, Lưu Thái Danh, Trần Thanh Mến, Đái Thị Xuân Trang, Phạm Khánh
Nguyên Huân, Võ Thị Tú Anh. Khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết từ rễ cây
cò sen (Miliusa velutina). Báo cáo khoa học - Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc 2020. 225-231.
Xiao-Ping, Y., Chun-Qing, S., Ping, Y., RenGang, M., 2010. α-Glucosidase and α-
amylase inhibitory activity of common constituents from traditional Chinese
medicine used for diabetes mellitus. Chinese Journal of Natural Medicines, 8, 349- 352.