Sắc ký cột và sắc ký bản mỏng- Môn Hóa học | Đại học Y dược Cần Thơ

PHÚC TRÌNH Dược – K48
BÀI: SẮC KÝ CỘT VÀ SẮC KÝ BẢN MỎNG
I. Dụng cụ - Hóa chất Dụng cụ Hóa chất Erlen 50, 250ml 1 Aceton Becher 100ml, 250ml 1 Silica gel Ống đong 10, 25ml 1 Acetat ethyl Phễu nhỏ, phễu lớn 1 Natri sulfat khan Bình lóng 125ml 1 Eter dầu hỏa 60-90 Cột sắc ký 1 Bông gòn Muỗng inox 1 Dung dịch FeCl3 Ống nhỏ giọt 1 Dung dịch H2SO4 đđ Cọng kẽm 1 Dung dịch vanillin Ống nghiệm 2 Dung dịch β-naptol Bản mỏng silica gel 2 Lá cây Ly thủy tinh 1 Mặt kính đồng hồ 1 Giấy lọc 1 Ống vi quản 1 Kẹp 1 Cối - chày 1 II. Thực hành A. Sắc ký cột
1. Chuẩn bị cột sắc ký
Dùng cọng kẽm nhồi một lớp bông gòn dầy khoảng 1-2mm vào dưới đáy cột (không nhồi
cứng). Ráp cột sắc ký vào giá.
Cho 15ml dung môi eter dầu hỏa vào becher 100ml, thêm từ từ 5g silica gel và khuấy đều.
Cho silica gel vào cột sắc ký, mở khóa cho dung môi chảy (không nên gõ đều cột). Lưu
ý dung môi luôn ngập trên silica gel. Sau khi cho hết silica gel, vẫn mở khóa để dung
môi chảy từng giọt cho đến khi lớp dung môi nằm trên silica gel khoảng 1mm thì khóa cột lại.
2. Trích ly sắc tố của lá cây
Cho 5g lá cây đã rửa sạch, lau thật khô, cắt nhỏ vào cối rồi dùng chày nghiền nát.
Pha 50ml hỗn hợp eter dầu hỏa : aceton (tỉ lệ 3:2)
Chuyển lá cây đã giã nát vào erlen 250ml có chứa sẵn 50ml hỗn hợp eter dầu hỏa
Dược – K48 : aceton
với tỷ lệ 3:2, lắc đều trong 10 phút, lọc lấy dịch trích và cho vào becher 100ml.
Cho dịch trích vào bình lóng, rửa bằng (20ml x 2 lần) nước cất, chuyển dịch trích vào
erlen 50ml, làm khan bằng Na2SO4 khan, lọc.
Đun cách thủy dịch trích đã làm khan để loại bớt dung môi, thu được một dung dịch sắc
tố đậm đặc (khoảng 2ml). Dịch sắc tố này được dùng để sắc ký bản mỏng và nạp vào cột sắc ký.
3. Nạp sắc tố vào cột sắc ký
Cho một ít mẫu sắc tố vào lọ đựng riêng để làm sắc ký bản mỏng, dùng ống nhỏ giọt để
đưa mẫu sắc tố vào đầu cột sắc ký, dùng eter dầu hỏa rửa thành cột và ống mao quản. Sau
khi nạp xong, để yên trong 2 phút để mẫu được cân bằng với chất hấp thụ (silica gel) và
dung môi giải ly (eter dầu hỏa). 4. Giải ly cột
Mở khóa cho dung môi chảy đến khi hỗn hợp dung dịch sắc tố bằng với lớp chất hấp phụ
thì nhẹ nhàng thêm dung môi eter dầu hỏa vào đầu cột (thêm thật nhẹ để tránh xáo trộn hỗn
hợp ở đầu cột, dung môi phải trong), mở khóa và hứng phần dung môi chảy ra khỏi cột.
Liên tục cho dung môi eter dầu hỏa vào, sắc tố β-caroten màu vàng sẽ di chuyển nhanh ra
khỏi cột trước tiên, hứng lấy phần sắc tố đó bằng một ống nghiệm.
Sau khi sắc tố màu vàng ra khỏi cột, thay dung môi eter dầuu hỏa bằng hệ dung môi eter
dầu hỏa : etyl acetat (7:3). Lúc này sắc tố chlorophyl màu xanh lục sẽ bắt đầu di chuyển
xuống dưới cột, hứng lấy phần sắc tố đó bằng một ống nghiệm khác. B. Sắc ký bản mỏng
1. Chuẩn bị bản mỏng
Dùng bút chì đánh dấu mép trên (vạch tiền tuyến), dưới (vạch xuất phát) để xác định mức
hệ dung ly thấm ướt (trên 0,2cm, dưới 0,5cm).
Các dung dịch chấm bản gồm 3 loại: dung dịch vanillin, dung dịch β-naphtol, dung dịch sắc tố lá cây.
Dùng ống vi quản lần lượt chấm từng dung dịch lên trên mép dưới tấm bản mỏng thành 3
chấm: vết bên trái là vanillin (chấm 2 lần), vết ở giữa là β-naphtol (chấm 2 lần), vết bên phải
là sắc tố lá cây (chấm 4 lần). Để yên cho vết chấm khô. Lưu ý kỹ thuật chấm vết sao cho vết
càng nhỏ, gọn càng tốt. (Chuẩn bị hai bản giống nhau)
2. Chuẩn bị bình triển khai
Lau thật sạch và khô bình triển khai (ly thủy tinh). Cắt một tấm giấy lọc đặt vào trong ly.
Bản 1: gải ly với hệ 5ml eter dầu hỏa: acetat etyl (4:1) Dược – K48
Bản 2: giải ly với hệ 5ml eter dầu hỏa: acetat etyl (2,5:2,5)
Cho 5ml hệ dung ly vào bình. Đậy bình lại bằng tấm kiếng thủy tinh và để yên cho hệ
dung dịch thấm ướt hết giấy lọc.
Cho bản mỏng vào bình triển khai, đậy nắp lại. Khi hệ dung ly thấm ướt đến mức đánh
dấu ở trên thì lấy bản mỏng ra. Để yên cho bản khô tự nhiên, ghi nhận màu sắc các vết trên bản mỏng. Bản 1:
- Dung dịch vanillin không màu.
- Dung dịch β-naptol không màu.
- Dung dịch chiết sắc tố lá cây có một vệt màu gồm nhiều màu (chủ yếu là vàng và xanh). Bản 2:
- Dung dịch vanillin không màu.
- Dung dịch β-napton không màu.
- Dung dịch chiết sắc tố lá cây có một vệt màu gồm nhiều màu (chủ yếu là vàng và xanh).
3. Hiện hình bản mỏng và tính giá trị Rf
▲ Bản 1: Hiện vết bằng dung dịch FeCl3 rồi sấy khô, các vết dần hiện rõ ra.
-Dung dịch vanillin: có màu đen. Rf = 0,6/4,1 = 0,15
-Dung dịch β-naphtol có màu trắng. Rf = 1,2/4,1 = 0,29
-Dung dịch chiết sắc tố lá cây có một vệt màu gồm nhiều màu (chủ yếu là vàng và xanh).
▲ Bản 2: Hiện vết bằng dung dịch H2SO4 50%, hơ trên bếp nóng.
-Dung dịch vanillin có màu đỏ. Rf = 3,4/4,3 = 0,79
-Dung dịch β-naphtol có màu trắng. Rf = 3,9/4,3 = 0,90
-Dung dịch chiết sắc tố lá cây có một vệt màu gồm nhiều màu (chủ yếu là vàng và xanh). III. Câu hỏi
1. Tại sao phải đặt tờ giấy lọc vào bình sắc ký?
Để kiểm tra độ bão hòa của dung môi trong bình sắc ký.
2. Tại sao phải vạch lằn “mức tiền tuyến dung môi”? Để tiết kiệm (nhằm chấm được
nhiều vết) có thể chấm các vết sát lề bản mỏng được không? Tại sao?
Vạch lằn “mức tiền tuyến dung môi” để làm chỗ ta lấy bản sao cho không ảnh hưởng đến Dược – K48
lớp silica gel trên bản, nếu không có mức tiền tuyến ta sẽ chạm vào đường đi của bản mỏng
và vô tình cung cấp tạp chất ảnh hưởng đến hướng di chuyển của các chất.
Không thể chấm các vết sát lề bản mỏng được vì nếu chấm sát lề bản mỏng thì lúc này
diện tích tiếp xúc chính của chất là mặt bên bản mỏng. Nó rất nhỏ nên lực hút các chất vì
vậy cũng nhỏ theo làm cho các chất bên mặt bên cao hơn chất ở trên mặt trước làm cho giá trị Rf không chính xác.
3. Hai hệ dung môi trên, hệ nào tốt hơn? Giải thích.
Hệ dung môi dùng với bản 1 hiện vết bằng cách phun dung dịch FeCl3, còn hệ dung môi
dùng với bản 2 hiện vết bằng cách phun dung dịch H2SO4 đậm đặc và hơ bản trên bếp nóng.
Nên hệ dung môi dùng với bản 1 tốt hơn.
4. Tại sao hỗn hợp mẫu chất sau khi nạp lên đầu cột cần được giải ly ngay, tránh ngưng
quá trình giải ly một thời gian?
Vì nếu ngưng thì trật tự sắp xếp của các chất trong hỗn hợp sẽ bị xáo trộn làm cho sự
tách không còn hiệu quả nữa.
5. Tại sao phải làm khan dịch trích trước khi nạp lên cột sắc ký?
Vì trong quá trình chuẩn bị ta sử dụng rất nhiều dung môi hữu cơ nên cần làm khan để
loại bớt dung môi và đồng thời để thu được một sắc tô đậm đặc.
6. Trình bày công thức cấu tạo của β-caroten và clorophyl. β-caroten Clorophyl Dược – K48
7. Dự đoán thứ tự ra khỏi cột của ba chất A, B, C. (A) 2-(3,4- (B) (3aS,9S,10aS)-3,9- (C) (2S,3S,4R,5R,6R)-2- dihydroxyphenyl)- dimethylldecahydro- ((1,3-dihydroxypropan-2- 5-hydroxy-3,7- 2H-6a,9- yl)oxy)-6-ethoxytetrahydro- dimethoxy-4H- epidioxyxepino[4,3,2- 2H-pyran-3,4,5-triol chromen-4-one ij]isochromen-2-one
Vì bản chất hóa học của bề mặt silica gel là những nhóm silanol-OH nên những chất
phân cực hơn sẽ bị silica gel giữ chặt lại và giải ly muộn hơn so với những chất khác vì có
khả năng tạo nối hydrogen mạnh.
Thứ tự ra khỏi cột là: B → A → C.