Sách Công Nghệ Cấy Truyền Phôi Gia Súc | Trường đại học sư phạm kỹ thuật TP. Hồ Chí Minh

Ở loài động vật có vú, sự thụ tinh là quá trình kết hợp của tế bào tinh trùng còn gọi tắt là tinh trùng, tinh bào (spermatocyte) ở con đực với tế bào trứng còn gọi tắt là trứng (noãn bào) (oocyte) ở con cái trong cơ thể mẹ (tại 1/3 phía trên của ống dẫn trứng) để tạo ra 1 tế bào mới gọi là hợp tử (zygote) và hợp tử sẽ phát triển thành cơ thể mới. Tài liệu giúp bạn tham khảo, ôn tập và đạt kết quả cao. Mời bạn đọc đón xem!

23 12 lượt tải Tải xuống
Chia sẻ Báo cáo tài liệu

Môn: Công Nghệ Cấy Truyền Phôi Gia Súc

Trường: Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh

Thông tin:

191 trang 1 tháng trước

Tác giả:

Profile Lê Kim Dung
1
Nhóm 5 ng Th Nguyên 596417 Đặ ị
Chương I
THỤ TINH TRONG NG NGHI M Ố Ệ
I. KHÁI NIỆM
ng v t có vú,s th tinh (fertilization) là quá trình k t h c a t bào tinh Ở loài độ ậ ự ụ ế ợ ủ ế
trùng còn g i tọ ắt là tinh trùng, tinh bào (spermatocyte) ở con đực v i t bào tr ng còn g i ớ ế ứ ọ
tắt là tr ng (noãn bào) (oocyte) con m (t i 1/3 phía trên c a ng d n ứ ở cái trong cơ thể ẹ ạ ủ ố ẫ
trứng) để tạo ra 1 t bào m i g i là hế ớ ọ ợp tử (zygote) và hợp tử s phát tri ẽ ển thành cơ thể
mới. Qúa trình này bao g m hàng lo t biồ ạ ến đổi sinh lí, sinh hóa ph c t p ứ ạ ở tinh trùng và
ở tế bào tr c, trứng trướ ọ ợ ớ ớng và sau khi chúng kết h p v i nhau, cùng v i nh ng ững tác độ
của môi trường trong đường sinh d c cụ ủa cơ thể mẹ.
Th tinh trong ng nghi m (in vitro fertilization-ivf) là quá trình k t h p gi a tinh ụ ố ệ ế ợ ữ
trùng hay còn g i là giao t c v i tr ng hay còn g i là giao t t o ra h p t ọ ử đự ớ ứ ọ ử cái để ạ ợ ử ở
ngoài cơ thể mẹ - trong phòng thí nghi m - v i ệ ớ môi trường sinh h c nhân t o vọ ạ ới các điều
kiện thích h nhi , ợp như: ệt độ độ ẩm, độ nh t, ớ độ ph, áp suất th m thẩ ấu các ch t dinh ấ
dưỡ ớng, các ch t kích thích, cùng vấ các ion.v.v… i các chỉ tiêu sinh học khác g n gi ng ầ ố
như trong cơ thể mẹ (tại ống d n tr ng ). ẫ ứ
Ngày nay v i công ngh s n xu t phôi trong ng nghi m (in vitro produced-IVP), ớ ệ ả ấ ố ệ
không ch có th tinh mà t thu tr ng ,nuôi tr ng l n và chín (in vitro-matured-ỉ ụ ừ ứ ứ ớ IVM) đến
nuôi h p t phát tri n (in vitro cultured-IVC) thành phôi dâu (morula) ho c phôi nang ợ ử ể ặ
(blastocyte) cũng thự Tuy nhiên đểc hiện trong thí nghiệm trên hầu hết các loài có vú.
phôi ti p t c phát tri m i, i ta ph i ti p t c c y truy n phôi ế ụ ển và sinh ra cơ thể ớ ngườ ả ế ụ ấ ề
(embryo transfer-ET) vào t cung c a con cái nh n phôi, ử ủ ậ phôi được nuôi dưỡng, phát tri n ể
thành thai và được m sinh ra. Toàn b quá trình trên g i là công ngh s n xu t phôi trong ẹ ộ ọ ệ ả ấ
ống nghiệm-cấy phôi (hình 3)
Th tinh trong ng nghi c ti n hành nghiên c u tiên tr n th ng ụ ố ệm đượ ế ứu đầ ề ỏ và là độ
vật có vú đầu tiên ra đời vào năm 1954 do Dauzier và cộ Đến năm ng tác viên tiến hành.
1959 do Chang th c hiự ện và sau đó đã có nhiều động vât có vú khác sinh ra bằng phương
pháp này (b ng 1). u tiên ra do các nhà khoa h c ả Ở người em bé đầ đời vào năm 1978 ở ọ
Steptoc và Edward, đến nay đã có hơn 10.000 em bé được ra đờ i trên nhi c bều nướ ằng kĩ
thuật th tinh trong ng nghi m (TTTON). ụ ố ệ
ViỞ ê t Nam, nga
y 30/4/1998, ba em be
tra
o đơ
i tư
k t quê a
thu tinh trong ông nghiê
m.
Đây la
như
ng tha
nh công đâu tiên cu
a Viê t Nam. Tư
đo
đên nay, con s nô a
y đa lên đ
ên
ha
ng trăm em.
2
Nhóm 5 Bùi Th Hòa 596399 ị
Bảng 1. M t s ng vộ ố độ ật có vú ra đời bằng th tinh trong ng nghi m ụ ố ệ
Tác gi ả
ng v t Loài độ ậ
Chang, 1959
Whittingham
Toyodia và Chang, 1974
Steptoe và Edwards, 1978
Brackell và cs, 1992
Hanada, 1985
Hanada, 1985
Cheng và cs, 1986
Th ỏ
Chu t ộ
Chu t c ng ộ ố
i Ngườ
Bò
Dê Shiba
C u ừ
L n ợ
Nhi u báo cáo v k t qu u tiên c a s th tinh trong ng nghi m ng v t có ề ề ế ả đầ ủ ự ụ ố ệ ở độ ậ
vú h u h t là ầ ế ở giai đoạn tinh trùng xâm nh p vào t bào tr ng hình thành ti n nhân và b t ậ ế ứ ề ắ
đầu phân chia t bào. ế Ở giai đoạn đầu c a s th tinh t bào tr ng bủ ự ụ ế ứ ắt đầu phân chia, người
ta g i t bào này là t bào phôi hay phôi bào (blastomere) (b ng 2) ọ ế ế ả
Hi n nay th tinh trong ng nghi t nhi u thành tệ ụ ố ệm đã đạ ề ựu cao hơn trên nhiều lĩnh
vực nhi ng v t có vú t chu t, th n các gia súc l n có s ng và nhi ng ở ều loài độ ậ ừ ộ ỏ đế ớ ừ ều độ
vật quý hi m.v.v... ế
3
Nhóm 5 Bùi Th Hòa 596399 ị
Bảng 2. Những k t qu u tiên v th tinh trong ng v t có vú ế ả đầ ề ụ ở độ ậ
Tác gi ả
ng v t Loài độ ậ
K t qu ế ả đạt được
Chang, 1959
Dauzier &
Thibault, 1959
Yanagimachi &
Chang, 1964
Whittingham, 1958
Pikworth & Chang,
1969
Edward & cs, 1969
Hamner và cs,
1970
Yanaghimachi,
1972
Gould & cs, 1973
Miyamoto và
Chang, 1973
Iritani & cs, 1975
Mahi &
Yanagimachi, 1976
Iritani & Niwa,
1977
Hanada và Chang,
1978
Hanada và
Isutsumi
Thỏ
Cừu
Chuột đồng Trung Qu c ố
Chuột
Chuột đồng Trung Qu c ố
Người
Mèo
Chuột lang
Khỉ Rhesus
Chuột
Lợn
Chó
Bò
Hươu chuột
Dê
Đẻ con
Tiền nhân
Thâm nh p, ti n nhân và phân ậ ề
chia t bào ế
Phân chia t bào và thai ế
Thâm nh p và ti n nhân ậ ề
Thâm nh p và ti n nhân ậ ề
Phân chia t bào ế
Thâm nh p ti n nhân và phân ậ ề
chia t bào ế
Tiền nhân và phân chia t bào ế
Thâm nh p ậ
Thâm nh p, ti n nhân, phân ậ ề
chia
Thâm nh p, m r u ậ ở ộng đầ
Thâm nh p và ti n nhân ậ ề
Thâm nh p và ti n nhân ậ ề
Thâm nh p ậ
4
Nhóm 5 Bùi Th Hòa 596399 ị
II. Ý NGHĨA
Th tinh trong ng nghi m có r t nhiụ ố ệ ấ ều ý nghĩa thự ễn trong đờc ti i sống:
1. Khai thác được rất nhiều ti n cềm năng và sinh sả ủa con cái nh t là ấ ở
những động v t quý hiậ ếm có nguy cơ bị tiêu di t và nh ng gia súc cao s n. Vi c khai thác ệ ữ ả ệ
và s d c t bào tr nh ng nang tr ng non trên bu ng tr ng cử ụng đượ ế ứng ở ữ ứ ồ ứ ủa con cái đã
tăng hiệu suất sinh s n c a chúng, nh i v i nh ng vả ủ ất là đố ớ ững độ ật đơn thai.
2. Con v i b ng t i có th làm ch ật đầu tiên ra đờ ằng kĩ thuật này đã chứ ỏ con ngườ ể ủ
công ngh sinh h c sinh s n cệ ọ ả ủa động v t. Tr i qua nhi u th p niên, nh ng nghiên cậ ả ề ậ ữ ứu v ề
sinh lý t bào tr ng, sinh lý c a s th tinh, tìm hi u siêu c u trúc nh ng bi i t bào ế ứ ủ ự ụ ể ấ ữ ến đổ ế
trong quá trình chín, th i t i và ngo y, c ch các ụ tinh cũng như tác nhân nộ ạ ại lai thúc đẩ ứ ế
quá trình này.v.v... Nhi u nhà khoa h c không ch c này mà trên ề ọ ỉ thành công trên lĩnh vự
nhiều độ ều ý tưở ền đề khác cao hơn, sâu hơn vềng vật có vú mà còn tạo nên nhi ng ti bản
chất và mục tiêu c a công ngh sinh s n và công ngh gen ủ ệ ả ệ ở độ ậng v t. Trong nghiên c u, ứ
thí nghi m v s th tinh trong ng nghi m, v t bào tr ng, t bào phôi, nhi u nghiên ệ ề ự ụ ố ệ ề ế ứ ế ề
cứu, thí nghi m khác v nhân phôi, lai ghép phôi, nhân b n vô tính, c y ghép nhân-ệ ề ả ấ
gen.v.v... cũng đan xen, mắ ận xét ban đầ ệu ban đầu, bước đi c nối và dựa vào nh u, vật li
ban đầu của k thu t s n xu t phôi trong ng nghi m mà mỹ ậ ả ấ ố ệ ột thành tựu có ý nghĩa lịch s ử
làm ch n th gi i c a c u Dolly. Con cấn động dư luậ ế ới đó là sự ra đờ ủ ừ ừa Dolly ra đời năm
1997 đã tạ XX, đếo nên một cuộc cách mạng trong công nghệ sinh học vào cuối thế kỷ n
nay đã nhân bản thành công năm loài động vật.
3. Trong chăn nuôi gia súc, sản xuất phôi trong ống nghiệm cùng v i c y truy n phôi ớ ấ ề
(IVP-ET) đã góp phần tham gia vào quá trình chọn lọc, nhân giống lai tạo giống, nhanh
chóng đạt được năng suất cao v s a, thề ữ ịt, tăng hiệu qu công tác giông do tả ạo được nhi u ề
phôi c a các củ ặp đực cái cao sản mà có nhi ki m tra, giúp cho vi ánh giá ều đời sau để ể ệc đ
con v t s n kho ng cách gi a các th h , nh t là i và ậ ớm hơn, rút ngắ ả ữ ế ệ ấ ở gia súc có vòng đờ
chu kì sinh sản dài như trâu, bò, ngựa v.v... Sự th tinh trong ụ ống nghi m cùng v i nh ng ệ ớ ữ
phương pháp kỹ thuật xác đinh giới tính và nhân phôi, người ta có th tể ạo đàn gia súc đực-
cái theo ý muốn như trong chăn nuôi lấy sữa có th tể ạo đàn bò cái cho sữa có s ố lượng và
chất lượ ật đông lạng theo yêu cầu. Với kỹ thu nh, các sản phẩm sinh học ngày càng hiện
đại, ngườ ản đông lại ta có thể xây dựng ngân hàng gen thông qua việc bảo qu nh tế bào
trứng cũng như tế bào phôi v.v... tạo điều ki n thu n l i cho việ ậ ợ ệc trao đổi v t li u sinh hậ ệ ọc
sinh s n, v t li u di truy n ph c v cho công tác gi ng, sinh s n trên ph m vi r ng lả ậ ệ ề ụ ụ ố ả ạ ộ ớn.
5
Nhóm 5 Lê Th Hà 591313 ị
4. S th tinh trong ự ụ ống nghiệm giúp cho người làm công tác k thuỹ ật đánh giá nhanh
được khả năng thụ c con đự tinh cá c giống khác nhau.
5. S làm ch v nuôi tr ng chín (in vitro maturation IVM) là s th tinh trong ng ự ủ ề ứ – ự ụ ố
nghiệm c cho các nhà nghiên c(IVF) đã cho phép cung cấp đượ ứu m t sộ ố lượng lớn các
phôi v i giá thành h (Louis-Marie Houdebine, 1992). ớ ạ
6. Ở người th tinh trong ng nghiụ ố ệm đã giúp cho những v chợ ồng không có kh ả năng
sinh đẻ năng đả ảo các điề do ống dẫn trứng không có khả m b u kiện thụ tinh hoặc trúng
không g c tinh trùng do viêm t c chai c ng v.v... trong bu ng tr ng v n ho ng ặp đượ ắ ứ ồ ứ ẫ ạt độ
bình thường và t ử cung có đầy đủ điều ki n ti p nhệ ế ận và nuôi dưỡng phôi - thai và đẻ con.
Nguyên nhân vô sinh có th i ch ng ho t ể do ngườ ồng như khả năng sinh tinh kém, số lượ ạ
động quá thấp v.v... không đảm bảo số lượng tinh trùng/tr ng (kho ng 50000 tinh ứ ả
trùng/trứng), người ta có thể tiến hành công nghệ vi tiêm tinh trùng vào tế bào trứng
(intracytoplasmic sperm injection-ICSI).
7.S th tinh trong ng nghi m có th th c hi n b t c lúc nào n u có tr ng và tinh ự ụ ố ệ ể ự ệ ấ ứ ế ứ
trùng đủ ới nhau đẻ ử. Đế điều kiện kết hợp v hình thành hợp t n nay, ở người có tỉ lệ sinh
con ra còn s ng do th tinh trong ng nghi t t 15-17% s u tr , nh ng b nh ố ụ ố ệm đạ ừ ố ca điề ị ữ ệ
viện có thi t b hoàn h o và có nhi u kinh nhi m có th n 25%. ế ị ả ề ệ ể đạt đế
III. SO SÁNH S THỰ Ụ TINH THÔNG THƯỜNG, TỰ NHIÊN VÀ SỰ Ụ TH TINH
TRONG NG NGHI M. Ố Ệ
S th tinh ng v c nghiên c u trên nhi u m t c a nhiự ụ ở độ ật cái đã đượ ứ ề ặ ủ ều loài khá kĩ
lưỡng về s bi i cự ến đổ ủa các tế bào sinh dụ ục trong quá trình th tinh v u ki n thích ới điề ệ
hợp c a chúng. ủ
Sau khi r ng, t bào tr ng và d ch nang tr c hút vào loa kèn r i v n chuy n ụ ế ừ ị ứng đượ ồ ậ ể
nhanh đế loài độ ật có vú như trâu, bò, dê, lợn chỗ phình của ống trứng. Ở một số ng v n,
cừ ựu,ng a v.v... khi r ng, tr ng tr ng thái phân bào gi m nhi m thụ ứ ở ạ ả ễ ứ II, đang hình thành
thoi nhi m s c (th c c I c a phân bào gi m nhiễ ắ ể ự ủ ả ễm I đã ở bên ngoài ch t nguyên sinh). ấ Ở
chó, mèo, th , chu t v.v... tr ng r ng tr ng thái s m howncuar phân bào gi m nhi m ỏ ộ ứ ụ ở ạ ớ ả ễ
thứ I như chó cái, mèo cái. Trong thời gian di chuyển, dịch ống phấn có tác động nhất
định đối v i t bào tr ng v ớ ế ứ ề cơ chế hóa h c, l p t bào vành phóng x c a trọ ớ ế ạ ủ ứng cũng mất
đi một phần, bởi tế bào hình tr trên niêm m c ng d n tr ng bào mòn. ụ ạ ố ẫ ứ
Sau khi ph i gi ng hay d n tinh, t bào tinh trùng d n nhanh qua t ố ố ẫ ế ẫ ử cung đến 1/3 phía
trên c a ủ ố ẫng d n tr ng trong vòng 5-15 giứ ờ, tùy theo loài, nh ờ nhu động của t cung, ử ống
dẫn tr ng và ho t l c ti n th ng c a tinh trùng. ứ ạ ự ế ẳ ủ
6
Nhóm 5 Lê Th Hà 591313 ị
Trong quá trình di chuy n này,d ch c t cung và c t cung, d ch ng d n tr ng v i ể ị ổ ử ổ ử ị ố ẫ ứ ớ
nồng độ ất hòa tan, các ion v.v.. cao đã “hoạ các ch t hóa” tinh trùng, mặt khác số lượng
tinh trùng gi t nhi u tùy theo loài t hàng 100 tri u, th m chí m t t n ch ảm đi rấ ề ừ ệ ậ ộ ỷ khi đế ỗ
thắt, ch phình c a ỗ ủ ống d n chúng ch c và khi th tinh ch có ẫ ỉ còn hàng trăm, hàng chụ ụ ỉ
một tinh trùng chui đượ thay đổc vào tế bào trứng. Có một số i ở đầu tinh trùng (sau khi
được ho c lúc thâm nh p vào tạt hóa) ngay trướ ậ ế bào tr c g i là phứng và đượ ọ ản ng ứ
acrosome. S xâm nh u do nhi u tinh trùng chui qua l p t bào vành phóng x ự ập ban đầ ề ớ ế ạ
bằng độ c ng cứ ủa đầu và các ph n ả ứng acrosome để gi i phóng ra các enzim hyaluroisidae. ả
Như vậy sự thụ tinh c n có s ầ ố lượng tinh trùng tăng hơn và sự chọn lọc của s th tinh là ự ụ
rất cao. bò, mèo, chu t, tinh trùng xâm nh p vào toàn b t bào tr ng. các gia súc Ở ộ ậ ộ ế ứ Ở
khác ch u, c tinh trùng còn ph n t ngoài và b thoái hóa. ỉ có đầ ổ ầ đuôi tinh trùng bị đứ ở ị
Thực chất c a sủ ự thoái hóa là kích thích tế bào trứng phân chia gi m phân II hoàn thành ả
quá trình chia c a tr ng. Sau khi xâm nh p vào ch t nguyên sinh c a t bào tr u ủ ứ ậ ấ ủ ế ứng, đầ
tinh trùng biến hình, tăng thể tích và hình thành các nhân nguyên chui qua màng nhân c a ủ
tế bào trứng. Trong các nhân nguyên đực (của tinh trùng)
Xu t hi n các nhân nguyên cái (c u tr ng ) ấ ệ ầ ứ cũng đồng th i xu t hi n (bu c muờ ấ ệ ộ ộn hơn).
Sau đó chúng đồ hình thành cơ thểng hóa lẫn nhau, thực hiện AND của cha và mẹ di
truyền c mủa cơ thể ới mà hợp t là tử ế bào đầu tiên (hình 5)
y là gi a s th ng t nhiên và s th tinh trong ng nghi m Như vậ ữ ự ụ tinh thông thườ ự ự ụ ố ệ
(Invitro), trên th c t hi n nay v nhự ế ệ ề ững điều kiện chung như nhiệt độ, độ pH, áp su t c a ấ ủ
O2 và c a CO2, áp su t th m th u, s cân b ng nuôi là r t g n ủ ấ ẩ ấ ự ằng v,v,…trong môi trườ ấ ầ
với điều ki n v n có trong ng d n tr ng c a con cái m i loài. Tuy nhiên m t s vệ ố ố ẫ ứ ủ ở ỗ ộ ố ấn đề
khác bi t c a th tinh trong ng nghi m v i th ng c c quan tâm là ệ ủ ụ ố ệ ớ ụ tinh thông thườ ần đượ
số lượng tinh trùng đượ ủa cường độc sử dụng, sự thiếu vắng c chọn lọc tự nhiên, sự kéo
dài th i gian c n thi t cho s ti p xúc gi a tinh trùng v i tr c khi tinh trùng xâm ờ ầ ế ự ế ữ ớ ứng trướ
nhập vào tr ng, s c i bi n 1 cách sâu s c nhứ ự ả ế ắ ững điều ki n th tinh ệ ụ ở g n bên t bào tr ng, ầ ế ứ
kết qu ngay c s th ả ả ự ụ tinh cũng không thể th c hiự ện được ho c làm h n ch s phát tri n ặ ạ ế ự ể
tiếp theo c a phôi, thai ho c c ủ ặ ả đến khi sinh đẻ
1. Tăng số lượng tinh trùng c n thi t ầ ế
S khác bi t quan tr ng nh t là s ự ệ ọ ấ ố lượng tinh trùng c n thi t k sát v i t bào trầ ế ề ớ ế ứng để
thụ tinh trong ng nghi c th c hi n phố ệm đượ ự ệ ải tăng lên nhiều lần.
Trong quá trình th tinh c a con cái ,t t c nh ng nghiên c u cho r ng s ng tinh ụ ủ ấ ả ữ ứ ằ ố lượ
trùng có mặt ở ch phình c a ỗ ủ ống dẫn tr ng lúc trứ ứng r ng c a h u hụ ủ ầ ết các lo i là kho ng ạ ả
vài ch c. c xác nh n loài r ng tr ng nhi u b i có nh ng tr ng không còn ụ Điều đó đượ ậ ở ụ ứ ề ở ữ ứ
thụ tinh giở ữa nh c th tinh sau rững trúng đã đượ ụ ụng trứng. Ki m tra trên kính hi m vi ể ể
vì l a tr ng thô trong gi ti p t c r ng thì t t c tr ng không còn th ứ ứ ờ ế ụ ụ ấ ả ứ ụ tinh cũng không có
7
Nhóm 5 Nguy n Thễ ị Hương Anh 591307
1 tinh trùng nào ở vành phóng x co rút l i sát t bào tr ng. S th tinh xạ ạ ế ứ ự ụ ảy ra bình thường
ở lúc d n tinh là 1\ẫ 10.000 hay ít hơn và chỉ cho phép r t ít tinh trùng trong ấ ống d n tr ng, ẫ ứ
với 375.000 tinh trùng s ng b ng d n tinh t l th thai x p s 60% (57% c a 521 bò cái) ố ằ ẫ ỉ ệ ụ ấ ỉ ủ
và s tinh trùng t y ch n i s ng t cung v i ng d n tr ng là 130, ch ố ối đa tìm thấ ở ỗ ố ừ ử ớ ố ẫ ứ ở ỗ
thắt ng dố ẫn tr ng là 25 là ch phình cứ ở ỗ ủa ống d n tr ng là vài tinh trùng (Jondet, 1973) ẫ ứ
(bảng 3)
Bảng 3 : S ố lượng tinh trùng ng d n tr ng g n lúc r ng tr ng ố ẫ ứ ầ ụ ứ ở m t s ộ ố loài động vật
Loài động
vật
Số
giờ
sau
khi
phối
hay
dẫn
tr nứ
g
Chỗ phình
của ng ố
dẫn trứng
Số
lượng
tinh
trùng
/trứng
Sự
thụ
tinh
Tác gi ả
Chuột
Chuột
Chuột
Chuột
Nhắt
Chuột
Ghine
Chuột
Đồng
Chuột
Đồng
Thỏ
Dơi
Bò
Bò
Cừu
Cừu
Cừu
Cừu
Lợn
>12
3
8
4-8
9-10
12
12-
16
18
12
10
36
8-14
24
24
30
5-16,X=25
0-
134,X=24
2-
75,X=16,9
25-50
1-
172,X=17
4-10
121-135
>10
17-25
4-25
5800
<1
<1
1-25
4
15
13,4
109
<50%
100%
1/2
(50%
)
100%
100%
72%
Shalgi, Kraicer
1978
Takeuchi, CS,
1970
Braden,Austin,19
54
Braden,Austin,19
54
Bladau,1969
Cumin,yanagica-
chi,1982
Cumin,yanagica-
chi,1982
Overstreet,cooper
1978
Mori,uchida,1982
Dauzier,1958
Thibault và cs
1973
Thibault và
cs,1967
Hunter,1980
Lang,oh,1970
8
Nhóm 5 Nguy n Thễ ị Hương Anh 591307
Lợn
Lợn
Lợn
1037
Dauzier ,1958
Dursel và cs,1978
Rigby, 1966
Dumesdy và cs,
1955
Hunter,1972
Ngươc la i thu tinh trong ông nghiê m s ô lương tinh tru
ng so vơ
i thu tinh thông thươ
ng
trong tư nhiên no
i chung tăng hơn nhiêu ơ
đô ng vâ t co
t m vâ o
c lơ
n (ba
ng 4).
Ba
ng 4. S ô lương tinh tru
ng th ch hi
ơp vơ
i ty
lê
thu tinh trong ng nghiô ê m
Loa
i đông
vâ t
Số tinh
trùng/ml
Sô tinh
tru
ng/trư
n
g
Thu tinh,%
Ta
c gia
Bo
Bo
Cư
u
Lơn
Chuô t
Chuô t
nhăt
Tho
Tho
Chuô t
Ghine
Chuô t
hang
Chuô t
hang
0,25 10
×
6
0,2 10
0×
6
3
× 10
6
0,5-1
× 10
6
0,15-0,5×
10
6
0,1-0,6
× 10
6
0,11
× 10
6
0,25
× 10
6
2-3
× 10
5
2-10
× 10
6
1-5
× 10
6
1 10 -10
×
4 5
3
× 10
5
25-40×
10
3
2-54
× 10
3
1
× 10
3
1
15/75=20%
510/575=89%
(bo
ca
i vu
ng
lạnh)
> 14%
10/116=8%
268/304=94%
212/273=78%
18-44%
234/620=38%
32/32=100%
99/116=84%
13/31=42%
Brackett,cs,1980
Fulka,Pavlok,1982
Bodioli,Wright,1980
Inritani,Niwa,Imai,1
978
Niwa,Chang,1973
Tsunoda,Chang,197
5
Reyes va
cs,1978
Brackett
Oliphant,1975
Yanagimachi,1972
Niwa,1980
Bvister,1979
Như
ng s liô ê u ơ
ph n lâ ơ
n ca
c loa
i đươc nghiên cư
u trong ba
ng 4 đa
ch ra ri
ăng, đê thu
đươc k t quê a
ty
lê thu tinh (%) trong ng nghiô ê m x p x vâ i
ơ
i thu tinh trong tư nhiên, mâ t
đô
tinh tru
ng không the
gia
m dươ
i 1× 10
5
-1× 10
6
/ml hoă
c 10 tinh tr
4
-10
5
u
ng/trư
ng trong
điêu kiê n nuôi cây thông thươ
ng. R ro
a
ng la
sô lương tinh tru
ng vơ
i thu tinh trong ng ô
nghiê m tăng la
c n thiâ êt. Đê ti n hê a
nh thu tinh, vươt qua ma
ng trong su t tinh trô u
ng c n â
pha
i co
sư hoa
t đô
ng trao đôi ch t mâ a nh me
va
tang vâ
n đô
ng. Sư tăng chuyên đô ng na
y
9
Nhóm 5 Đào Thị Minh Nguyệt 591328
xu t hiâ ê n mô t ca
ch tư đô ng invitro sau khi đươc sa
n sinh ra sư hoa t ho
a tinh tru
ng nhưng
chi
khi na
o mât đô cu
a tinh tru
ng co
n la i tăng lên. Trong con ca
i, như
ng y u tê ô ch ng hoô a t
hóa đa
bi loa i bo
trong qua
tr nh tinh tri
u
ng đi qua cô, thân va
sư
ng tư
cung. Trong ông
nghiê m, ngươ
i ta b t buă ô c pha
i loa i bo
ca
c y u t trên b ng ly tâm vê ô ă a
rư
a nhưng đông thơ
i
cu
ng la
m nghe
o tinh tru
ng b ng nhă ư
ng y u tê ô vân đô ng ma
tư
lâu ngươ
i ta đa
bi t r ng, ê ă
pha loa
ng môi trươ
ng ke
o theo sư m t mâ a
t nhanh cho
ng sư
c hoa
t đô
ng cu
a tinh tru
ng. Như
vâ y la
thu tinh trong ng nghiô ê m co
nông đô tinh tru
ng tăng tương ư
ng nêu không như
ng
yêu t cô u
a sư vâ
n đô
ng se
không tăng lên trong môi trươ
ng thu tinh. Điêu đo
ch i
đa t đươc
trong ng nghiô ê m khi ca
i ti n sê ư pha lo ng môi a
trươ
ng hoa t ho
a mô t ca
ch hơp ly
nhât, đo
la
la
m tăng ca
c y u t ê ô tăng vâ
n đô
ng.v.v.. giông như trong tư nhiên (in vivo).
2. Sư thiêu vă
ng cươ
ng đô
cho n lo c tư nhiên
giĐa
a
i th ch si
ư c n thi t câ ê o
sô lương tinh tru
ng tăng đê thu tinh trong ng nghiô ê m,
điêu ma
thươ
ng đươc ti n hê a
nh trong qua
tr nh tinh tri
u
ng di chuyên tư
âm đa
o hay tư
cung
đên ông dân trư
ng hoă
c ch ph nh cô i
u
a ng d n trô â ư
ng, Cohen va
Ne Naughton (1974) đa
thi
nghiê m d n tinh cho thâ o
b ng tinh tră u
ng cu
a sư pho
ng tinh đê sinh ra mô t tho
con pha
i
c
o
1,6× 10
7
tinh tru
ng, tinh tru
ng ơ
tư
cung la
2,7 v× 10
5
a
tinh tru
ng ơ
ng dô ân trư
ng chi
c
o
1,04× 10
2
. Điêu na
y ch ra r ng, thi
ă u tinh trong tư nhiên (in vivo) đa
co
sư cho
n lo c r t â
ma nh. Sư chon lo c na
y co
vai tro
v chuyê ê ho
a h nh thi
a
i va
v sê ư
c hoa
t đô
ng, no
cu
ng co
như
ng đă c ti
nh cu
a kha
ng nguyên, ch nhi
ư
ng tinh tru
ng đơi ơ
ng d n trô â ư
ng không ki
p cô
đi
nh nhanh cho
ng vơ
i lgG đê ba ch c u không nhâ â n ra la
vâ t la va
nhơ
đo
ma
tinh tru
ng
cu
a mô t s loô a
i như tho
co
thê ơ
chô ph nh vi
a
loa ke
n 54 nga
y sau khi giao ph i (theo ô
Gerad, Levasseur va
Thibault). Ơ
bo
ca
i tơ, bo
ca
i, dê ca
i va
chuô
t hang, sư co
mă t cu
a
tinh tru
ng đa ch đô
ki
ng ba ch c u lan trâ a
n trong tư
cung nhưng không sa
y ra ơ
ông d n â
trư
ng. Ơ
bo
ca
i, ba
ch c câu đa
o
mă t ơ
tuy n tê ư
cung va
thưc ba
o tinh tru
ng nhưng không
co
ba ch c u nâ a
o trong ca
c nêp g p câ u
a chô n i tô ư
cung – ông dân trư
ng hay trong chô
tharwstneen ơ
đo
tđa
ư thi t lê â p dư trư
tinh tru
ng.
3. Ke
o da
i thơ
i gian gă p nhau giư
a tinh tru
ng vơ
i trư
ng
Sư thu tinh in vitro (trong ng nghiô ê m) cu
ng la
mô t kha
c biê t so vơ
i in vivo (trong cơ
thê me hay trong tư nhiên). Ơ
bôn loa
i đô
ng vâ t co
vu
(cư
u ca
i, bo
ca
i, lơn ca
i, tho
ca
i)
co
thơ
i gian da
i kha
c thươ
ng đê tinh trung gă p trư
ng vơ
i thu tinh in vitro (ba
ng 5).
Trong thơ
i gian na
y, môt ph n quan trâ o ng cu
a tinh tru
ng đa
gia
i pho
ng ra ca
c enzyme
ư
ng acrosomic hay la
chêt) đang trông qua
tr nh phân hi
u
y t bê a
o hoă
c sinh sa
n vô t nh ci
u
a
trư
ng. Ngươc la
i, ơ
như
ng loa
i gă m nh m nhâ o
, thơ
i gian gă p nhau cu
a ca
c t bê a
o sinh duc
đên khi thu tinh in vitro la
bi
nh thươ
ng.
Như vâ y la
như
ng kha
c biê
t trên, đă
c trưng nhât la
mâ t đô cao, tinh tru
ng la i r t hoâ a t
đô
ng trong mô t môi trươ
ng “giam ha
m v.v c”. … u
a thu tinh in vitro (so vơ
i in vivo), cu i ô
10
Nhóm 5 Đào Thị Minh Nguyệt 591328
cu
ng la
cơ chê tư điêu ch nh si
ư cân băng giư
a ca
c phân tư
trong môi trươ
ng đa
gây nên
ha
ng loa t r i loô a n va
đê cu i cô u
ng co
va
i tinh tru
ng may măn do nhi u tinh trê u
ng kha
c ta o
nên thưc hiê n như
ng điêu kiê n cho phe
p xâm nhâ p qua ma
ng trong su t (zona pellucida) ô
va
k t hê ơp vơ
i trư
ng ta
o nên m m câ u
a mô t cơ thê mơ
i trong pho
ng th nghii
ê m.
Bảng 5. Thời gian các t bào sinh s n gế ả ặp nhau đến khi thụ tinh
in vivo và in vitro
Loài
độ ậng v t
Hoạt
hóa
Phương
pháp
thụ tinh
Thời
gian
kiểm
tra
(giờ )
Trạng thái th ụ
tinh
Tác
giả
Phương
pháp
thời gian
(giờ)
11
Nhóm 5 Đào Thị Minh Nguyệt 591328
Lợn
Lợn
Bò
Bò
Bò
Cừu
Cừu
Thỏ
Thỏ
Thỏ
Chuột
hang
Chuột
hang
In vitro
trong t ử
cung
In vitro
In vitro
(HIS)
In vitro
trong t ử
cung
In vitro
In vitro
In vitro
In vitro
In vitro
In vitro
In vitro
In vitro
5
3-5.7
4-6
5
12-18
3
12-24
14
13
<5
0.5-1.5
5
In vitro
In vitro
In vitro
In vitro
In vitro
In vitro
In vitro
In vitro
In vitro
In vitro
In vitro
In vitro
17
3-5.7
20-
24
18-
21
1-3
48
2,25
3-5
0.5-1
10-
12
2-4
0.3-
0.6
Trong kì II s m ớ
nhiều tiền nhân
Tiền nhân s m ớ
Tiền nhân -> 4
tế bào
Trung kì II ->
tiền
nhân s m ớ
Tiền nhân đực
sớm
Đầu tinh trùng
phình ra -> l n ớ
hơn 2 tế bào
Đầu tinh trùng
phình ra
Trạng thái s m ớ
Trạng thái s m ớ
Trạng thái s m ớ
Tinh trùng ở
trong ch t ấ
nguyên sinh c a ủ
trứng
Tinh trùng đag
xâm nh p ho c ậ ặ
ở trong chất
nguyên sinh c a ủ
trứng
1
2,3
4
5
6
7
8
9 10
11
12-13
14
15
Ghi chú : (1) Iritani, Niwa, Imai, 1978; (2) Hunter, 1974; (3) Thibault, 1959; (4) Brackett
và cs 1980; (5) Iritani, Niwa, 1978; (6) Thibault tài li u không công b ; (7) Bondioli, ệ ố
wright, 1980; (8) Dauzier, Thibault, 1959; (9) Hosui và cs, 1981; (10) Soupart, Chhibault,
1967; không công b (11) Thibault, Dauzier, 1961; (12) Thibault, 1967, (13) Brackett, ố
1979; (14) Yanagimachi, 1972; (15) Tsunoda, Chang, 1977.
12
Nhóm 6 Ph m Th Tuy n 581060 ạ ị ế
IV. PHƯƠNG PHÁP
Nguyên t c chung c tinh trong ng nghi m là khai thác thu ắ ủa các phương pháp thụ ố ệ
nhặt bu ng tr ng t con cái, tinh hồ ứ ừ oàn con đực, sau đó những t bào tr ng và tinh trùng ế ứ
được x lí, ch n l c, phân lo i, hoử ọ ọ ạ ạt hóa, nuôi l i t u ki n ớn, nuôi chín.v.v…rồ ạo điề ệ
cho chúng gặp nhau trong môi trường tối ưu để th tinh x y ra, h p t ụ ả ợ ử được hình thành,
sau đó hợp tử phát tri n thành phôi. ể
1. Khai thác thu th p tậ ế bào tr ng ứ
Để ứ ử ậ ừ ứ có được tế bào tr ng còn gọi là giao t cái, người ta thu th p t ống dẫn tr ng sau
khi tr ng r ng, t nang tr ng c a buứ ụ ừ ứ ủ ồng tr ng b ng n i soi - siêu âm ho c b ng gi i ph u ứ ằ ộ ặ ằ ả ẫ
những con vật đang còn sống, từ nang trứng bu ng tr ng nh ng con v gi t ( lò ở ồ ứ ữ ật đã bị ế ở
mổ).
1.1. Thu trứng từ ng d n tr ng cố ẫ ứ ủa con cái
Sau khi tr ng r ng t nhiên ho c sau khi s d ng các hoocmon kích thích tr ng phát ứ ụ ự ặ ử ụ ứ
triển chín và rụng, tr c bứng thu đượ ằng cách này có tỷ l chín (phân chia gi m nhi m, ệ ả ễ
chuẩn b th nh chính xác th i gian thu ị ụ tinh) cao hơn ( hình 5a). Tuy nhiên việc xác đị ờ
trứng ở ống dẫn tr ng, n u mu n quá tr m th ứng có ý nghĩa quan trọ ế ộ ứng đã qua thời điể ụ
tinh thích h p và hoàn toàn ph thu c vào th i gian r ng tr ng m i loài. bò cái sinh ợ ụ ộ ờ ụ ứ ở ỗ Ở
sản, r ng tr ng sau kụ ứ ết thúc động đực 10 - 14 gi , ờ ở cái tơ là 9 - 10 gi . ờ Ở ng a r ng tr ng ự ụ ứ
vào kho ng 24 gi c khi k c, l n t gi n cu c, dê, ả ờ trướ ết thúc động đự ở ợ ừ ữa đế ối động đự ở
cừu vào lúc cao điểm của động đực (Lubos Holy, 1980). Để thu đượ c tr i ta ph i ứng ngườ ả
phẫu thuật để bộc lộ ống d n trẫ ứng và s d ng ử ụ ống thông để bơm dung dị ch PBS vào ng ố
dẫn tr ng d i r a vài l ng dung d ch r a và phân lo i các tr ng thu ứ ộ ử ần, sau đó tìm trứ ở ị ử ạ ứ
được. Cách thu trứng này thường đượ các độc sử dụng ở ng v t thí nghi m. ậ ệ
1.2. Thu trứng từ các nang tr ng c a buứ ủ ồng tr ng ứ
Ở động vật đang sống, thường được khai thác tr ng nhi u lứ ề ần để tận d ng triụ ệt để ti m ề
năng sinh sản của bu ng trồ ứng nhất là nh ng con v t có giá tr di truy n c c b o t n ữ ậ ị ề ần đượ ả ồ
hoặc nh ng v t có chu kì sinh sở ững độ ậ ản dài. Nh t cao và ững con gia súc có năng suấ
những t bào tr ng này bao gi ế ứ ờ cũng có nguồn g c cố ủa con m . Sau khi ch n con cái theo ẹ ọ
yêu c i ta tiêm các hoocmon kích thích nhi u nang trầu, ngườ ề ứng chín và thường tr ng thu ứ
được ở tr ng thái th c p. Bạ ứ ấ ằng kĩ thuật n i soi - ộ siêu âm, người ta s d ng kim dài xuyên ử ụ
qua thành âm đạ ứng chín để ứng. Đây là phương pháp o chọc và tìm nang tr hút tế bào tr
được s d ng r ng rãi ử ụ ộ ở ngườ ớ ặi, gia súc l n, trên nhi c hoều nướ c nội soi qua thành bụng
đố ộ ứ ởi v ng với độ ật nhỏ cũng như giải phẫu bộc l buồng tr ng gi ng ống như cách thu trứ
ống dẫn trứng đố ới đội v ng vật thí nghi m. ệ
13
Nhóm 6 Ph m Th Tuy n 581060 ạ ị ế
Đối với nh ng v t s p ch t ho c gia súc lò mững độ ậ ắ ế ặ ở ổ, người ta thu buồng trứng ngay
sau khi m ổ trong điề môi trườu kiện vệ sinh vô trùng và bảo quản trong ng thích h p, v n ợ ậ
chuyển nhanh v phòng thí nghi m và ti n hành thu tr ng. ề ệ ế ứ Ở phương pháp này, trứng thu
được t nang tr ng còn non c t tr ng thái có th th tinh. Vì ừ ứ ần được nuôi chín đến khi đạ ạ ể ụ
vậy, tận thu được số lượng l n t bào trớ ế ứng hơn các phương pháp khác, nhưng đa số tr ng ứ
không rõ ngu n g c con m . T l nuôi chín và th tinh trong ng nghi m cao hay th p ồ ố ẹ ỷ ệ ụ ố ệ ấ
phụ thu c nhiộ ều vào ch ng và tr ng thái cất lượ ạ ủa trứng trong nang trứng. Những nang
trứng có đườ bò kích thướng kính lớn nên thu trứng, ở c nang trứng 2 - 6mm trở lên, ở
người > 17mm.v.v… Phương pháp thu trứ ện đang đượng từ buồng trứng bò hi c sử dụng
là:
a. Phương pháp chọc hút (follicle puncturing): dùng kim 18G và sơ ranh 5ml chọc vào
nang tr ng r i hút tr ng ra. ứ ồ ứ
b. : dùng dao ph u thu t r ch nang tr ng Phương pháp rạch - múc (follicle dissection) ẫ ậ ạ ứ
rồi múc tr ng ra (d ng c nh gi ng chi c thìa). ứ ụ ụ ỏ ố ế
Hình 5a. S phát tri n c a nang trự ể ủ ứng
c. Phương pháp cắt-nghiền bu ng tr ng (ovary slicing)ồ ứ
14
Nhóm 6 Nguy n Th Thu 581042 ễ ị
Trong ba phương pháp trên phương pháp rạch múc s tr c nhi l ố ứng thu đượ ều hơn, tỷ ệ
thụ tinh và h p t ợ ử phân chia cao hơn (bảng 6).
Bảng 6. Phương pháp thu trứng từ nang tr ng trên bu ng tr ng bò ứ ồ ứ
Phương pháp chọc-hút
Phương pháp rạch-múc
Số ng bò lượ
Số tr ng IVF/bò ứ
Số ng bò lượ
Số trứng IVF/bò
11
28
25
14
8
∑86
11,4
6,5
6,9
7,1
7,2
7,2
10
15
9
4
11
49
19,1
10,8
9,7
17.3
13,6
13,4
2. Phân loại và ch n lọ ọ ức tế bào tr ng
Sau khi thu th p xong, t bào tr c phân lo i và ch n l nuôi chín và th ậ ế ứng đượ ạ ọ ọc để ụ
tinh theo hình dáng, kích thướ ứng, độc tr dày c a l p t bào cumulus còn g i là t bào g ủ ớ ế ọ ế ờ
trứng (cumulus cell) bao quanh trứng. Phân lo i t bào tr n l p t bào ạ ế ứng theo đặc điể ớ ế
cumulus bao quanh tr ng là th c t và hi u qu . T bào tr c thu nh n t bu ng ứ ự ế ệ ả ế ứng đượ ậ ừ ồ
trứng c c phân loủa bò đượ ại như sau:
- Loại A: T bào tr ng hoàn h o, trế ứ ả ứng có đám tế bào cumulus chắc, dày đặc bao quanh
vòng trong su t tròn rõ, ch t nguyên sinh hoan h o. ấ ấ ả
- : T bào tr ng có các t bào cumulus bao b c mLoại B ế ứ ế ọ ột phần quanh tr ng. ứ
- : T bào tr ng g n tr i v i m t l p m ng ho c ch còn d u v t c a Loại B’ ế ứ ần như trầ ụ ớ ộ ớ ỏ ặ ỉ ấ ế ủ
tế bào cumulus.
- : Không có t bào cumulus bao quanh t bào tr ng mà ch có các s i huy t Loại C ế ế ứ ỉ ợ ế
(fibrin).
Thông thường ch dùng t bào tr ng loỉ ế ứ ại A và B để nuôi tới chín, sau đó thụ tinh thành
hợp t phát tri n thành phôi (b i v bào tr ng khác ử để ể ảng 7). Đố ới các phương pháp thu tế ứ
và trên các lo i gia súc khác nhau s có tiêu chu n phân lo ng. ạ ẽ ẩ ại tương ứ
15
Nhóm 6 Nguy n Th Thu 581042 ễ ị
Bảng 7. Sự ạ ứ phân chia tế bào sau khi thụ tinh ở các lo i tế bào tr ng của bò theo tính
chất của lớp t bào cumulus (Shioya, Y, và cs, 1988) ế
Loại t bào ế
trứng
Số t bào trế ứng nuôi c y ấ
Số t bào trế ứng phân chia
sau khi th tinh, % ụ
A,B
B’
C
364
122
158
232 (63.7)
36 (29.5)
28 (17.7)
3. Nuôi chín t bào tr ng ế ứ
Khi s d ng t bào tr ng d n tr ng ho c s p r ng nang tr ng ử ụ ế ứng đã rụng đang ở ố ẫ ứ ặ ắ ụ ở ứ
chín (giai đoạ ảy ra bình thường. Nhưng đốn phân chia chín thứ cấp) quá trình thụ tinh x i
với tế bào tr ng khai thác ứ từ nang trứng non, để có th th ể ụ tinh được phải nuôi l n và ớ đạt
đến kịch thước cuối cùng, chín đến metaphase II (hình 6 và 7). Ch ng h n, tr ng chu t t ẳ ạ ứ ộ ừ
đường kính 15-20µm bằng môi trường nhân t o có th nuôi lạ ể ớn đến kích thước cu i cùng ố
70-75µm (Pedersen T, peter H, 1968) tr ng l n và bò t n 120-125µm (Motlik ứ ợ ừ 30µm đế
J, và cs, 1984; Hyttel P; Fairt và cs, 1997). Ngày nay người ta còn có th nuôi lể ớn và chín
tế bào nang-tr ng t bu ng tr ng không ch ứ ừ ồ ứ ỉ ở chu t mà còn ộ ở bò…trong phòng thí nghiệm
với h thệ ống nuôi hai bước. Ở quá trình l n-chín này, t bào tr ng ph i nhớ ế ứ ả ận được những
thông tin và v t ch t c n thi t chính trong qu n th các t bào nang trậ ấ ầ ế ầ ể ế ứng, môi trường nuôi
để ế ấ ti n hành chín trong nhân và trong tế bào ch t nh m bằm đả ảo quá trình thụ tinh phân
chia t bào, h p t phát tri n thành phôi-thai. Vì v y trong nh t nuôi l n-chín ế ợ ử ể ậ ững kĩ thuậ ớ
hiện nay, t bào trế ứng cùng nuôi (co-cultrure) với các t bào trong nang trế ứng .v.v…đã
đem lại hiểu quả cao v chín, th tinh và phân chia t bào sau th tinh. ề ụ ế ụ
4. Thu th p và hoậ ạt hóa tinh trùng
Tinh trùng s d ng trong th tinh ử ụ ụ ống nghiệm có th c khai thác t tinh hoàn, phó ể đượ ừ
dịch hoàn (d ch hoàn ph ) c ng phóng tinh ho c b ng ph u thu t. ị ụ ủa con đực qua con đườ ặ ằ ẫ ậ
Bằng đường phóng tinh, tinh trùng hòa vào các dịch của các tuyến phụ rồi vào bộ máy
sinh d c l y d ch và ki m tra pha ch b o t gia súc. Tinh trùng ục cái đượ ấ ị ể ế ả ồn như với đa số
từ ngu n nào và khai thác b ng cách nào s không có kh tinh nồ ằ ẽ ả năng thụ ếu như không
được ho ng sinh dạt hóa trong đườ ục cái hoặc trong phòng thí nghiệm bằng hàng lo t ạ
những biến đổi hóa sinh h c, t bào h c khi xâm nh p qua màng trong suọ ế ọc.v.v…trướ ậ ốt để
kết h p v i nhân c a t bào trợ ớ ủ ế ứng
16
Nhóm 6 Nguy n Th Hoa 580996 ễ ị
Hình 6. So sánh s phân chia t bào gi a gi m phân (meiosis) và nguyên phân (mitosis) ự ế ữ ả
17
Nhóm 6 Nguy n Th Hoa 580996 ễ ị
Hình 7. So sánh quá trình t o giao t (quá trình t o tr ng và quá trình t o tinh ạ ử ạ ứ ạ
trùng).
Có nhiều gi thi t v ho t hóa tinh trùng. Thuy t v màng sinh h c cho rả ế ề ạ ế ề ọ ằng, màng
của t ế bào tinh trùng khi chưa hoạt hóa r t v ng chấ ữ ắc để bảo v tinh trùng và ch ng l i ệ ố ạ
tất c các ng x ng sinh dả ảnh hưở ấu trong đườ ục cái; còn tinh trùng đã hoạt hóa thì tính
bền v ng c c l i. Gi thi t khác l i cho r ng, ho t hóa tinh trùng là ữ ủa màng thì ngượ ạ ả ế ạ ằ ạ
quá trình xóa b enzyme c ch c a acrosome. m i loài ho t hóa tinh trùng hoàn ỏ ứ ế ủ Ở ỗ ạ
thành vào lúc ph n l n tinh trùng g p t bào tr ng. Có ý ki c n màng ầ ớ ặ ế ứ ến khác đề ập đế
tinh trùng và cho r ng ho i lo i tr các y u t c ch c hình thành ằ ạt hóa đòi hỏ ạ ừ ế ố ứ ế đã đượ
ở dịch hoàn phụ, tuy n ph c a cế ụ ủ on đực và đã phủ xung quanh màng tinh trùng.
Tinh trùng đã hoạ thu đượt hóa có thin vivo ể c ở đường sinh dục con cái sau khi
phối (tử cung, ống dẫn trứng) v a b ng thích h p; ới phương pháp bơm, rử ằng môi trườ ợ
đường sinh d c con cái có th cùng lo i ho c khác loài v i tinh trùng (bò, th , dê, c u). ụ ể ạ ặ ớ ỏ ừ
Trong phòng thí nghi m v i chuệ ớ ột nh t, chu t cắ ộ ống, thỏ, người tinh trùng có th cể đượ
18
Nhóm 6 Đặng Thị Nga 581021
ho t hóa b ng cách r a vài lạ ằ ử ần để lo i b tinh thanh và nuôi c y mạ ỏ ấ ột th i gian trong ờ
môi trường nuôi. bò, t Ở ế bào tinh trùng đượ ều phương pháp khác c hoạt hóa bằng nhi
nhau: cho tinh trùng vào trong dung d ch ch a n t ị ứ ồng độ ion cao đó là HIS có áp suấ
thẩm thấu khoảng 380 mOsm/kg trong 5 phút r i r a và nuôi ti n 5 ồ ử ếp trong 45 phút đế
giờ (Brackett và ctv, 1982); b ổ sung vào môi trường nuôi c y t ng h p cafein và Ca++ ấ ổ ợ
giúp cho tinh trùng tăng cường ph n ả ứng acrosome (Hanada và ctv, 1986) ho c heparin ặ
(Parrish, 1986) có điều chỉnh độ pH đạt 7,4. Ở ngựa, người ta s dử ụng môi trường tyrod
cải tiến (PALP) v i albumin huyớ ết thanh bò có b sung heparin ho c cafein hoổ ặ ặc
calcium ionophore để ạt hóa tinh trùng.v.v… rửa và ho
Trong công ngh s n xu t phôi b ng th tinh ệ ả ấ ằ ụ ống nghi m ệ ở một s loài gia súc, vi c ố ệ
sử d ng tinh d o qu nh - gi ho ụ ịch đã qua bả ản đông lạ ải đông đề ạt hóa tinh trùng đã trở
thành ph bi n nh i v i bò.Vì v t hóa c c quan ổ ế ất là đố ớ ậy, các phương pháp hoạ ần đượ
tâm hơn về mối quan hệ khả năng thụ tinh và đô ng l nh tinh trùng. ạ
5. Th ụ tinh và sự phát tri n sau th tinh ể ụ
T bào tr ng chín và tinh trùng ho c chuy ng th ế ứ ạt hóa đượ ển sang môi trườ ụ tinh để
thực hiện quá trình xâm nhập, hình thành tiền nhân, kết hợp hai tiền nhân tạo thành
hợp t th c hi n quá trình này c n ph i có s ử. Để ự ệ ầ ả ố lượng tinh trùng , th i gian ti p xúc ờ ế
và một môi trường thích h p cho tợ ừng loài để đạt đượ c hi u qu th tinh thành h p t . ệ ả ụ ợ ử
Sau th tinh, hụ ợp t phát tri n thành phôi v i t l cao. ử ể ớ ỷ ệ
N -10
ồng độ ạt hóa để tinh trùng ho thụ tinh ở động vật có vú vào khoảng 10
5 6
tinh
trùng/ml. Tuy nhiên, tùy theo loài mà n tinh trùng ho t hóa có th ồng độ ạ ể thay đổi như
sau:
Bò: 5-100 x 10 /ml, trung bình > 50 x 10 /ml
5 5
Ng a: 5 x 10 /ml, 25 x 10 / tr ng
ự
6 4
ứ
L n: 4-5 x 10 /ml
ợ
8
-10
9
Người: 5 x 10 / tr ng
4
ứ
Dê: 10 /ml
5
-10
6
Cũng như thụ con đự tinh , tin vivo ỷ lệ thụ tinh còn phin vitro ụ thuộc cá thể c, có
cá th này s n xu t ra tinh trùng kh ể ả ấ ả năng thụ tinh cao hơn cá thể kia.
19
Nhóm 6 Đặng Thị Nga 581021
Bảng 8. ng c a cá th c gi ng vẢnh hưở ủ ể bò đự ố ới t l th i v i các ỷ ệ ụ tinh đố ớ
nồng độ heparin khác nhau trong môi trườ ng BO-BSA
Heparin trong
môi trường
(µl/ml)
Tỷ l thệ ụ tinh (s tr ng có tinh trùng sâm nh ố ứ ập/số
trứng ki m tra), % ể
Bò đực Oo
Bò đực atsu
Bò đực satu
0
5
10
20
50
13,0 (3/23)
100,0 (21/21)
90,5 (19/21)
90,9 (20/22)
91,3 (21/23)
100,0 (11/11)
100,0 (14/14)
100,0 (13/13)
100,0 (14/14)
100,0 (14/14)
54,5 (12/22)
94,4 (17/18)
100 (10/10)
95,2 (20/21)
94.1 (16/17)
Vì v y, phát hiậ ện ưu điểm này cùng v i nhớ ững điều kiện c n thi t khác s mang l i ầ ế ẽ ạ
lợi ích kinh t cế ủa công ngh sệ ản xu t phôi trong ấ ống nghiệm trên động vật chăn nuôi. Bò
đực Atsu cho tinh trùng để IVF có tỷ l th tinh cao mà không c n ho t hóa (b ng 8). ệ ụ ầ ạ ả
Th i gian ti p xúc gi a tinh trùng và tr ng (thờ ế ữ ứ ời gian ủ) phụ thu c vào th i gian và ộ ờ
phương thức ho t hóa, chạ ất lượng trứng khi nuôi chín.v.v…thông thường đạt t l th tinh ỷ ệ ụ
cao khi ch ng tr t hóa t t ho c th i gian ho t hóa dài. ất lượ ứng chín cao, phương pháp hoạ ố ặ ờ ạ
Chẳng h n, tinh d ch bò sau gi c r a và ly tâm v ng BO có cafein ạ ở ị ải đông đượ ử ới môi trườ
và tinh trùng đượ ạt hóa trong môi trườc tách ra và ho ng BO-BSA-heparin thì thời gian ủ
trứng là 6-8 giờ; ng c pha loãng và ng TALP-BSA-ở ựa tinh trùng đượ ủ trong môi trườ
calcium ionophore v i trớ ứng 12 giờ.v.v…
K t qu c a th c nâng lên khi công gh tiêm tinh trùng vào t bào tr ng ế ả ủ ụ tinh đượ ệ ế ứ
(intracytoplasmic sperm injection - ICSI) đạt được thành công đáng kể. Phương pháp này
còn đượ ọi là kĩ thuậ ật nuôi ra đờc g t vi tiêm (microinjection). Những con v i không chỉ ở
bò, dê, c u mà c ừ ả ở người. Trong nhiều trường hợp tinh trùng không có đủ s ố lượng, ch t ấ
lượng để ụng kĩ thuậ người, để tự xâm nhập vào trứng thì có thể áp d t này. Chẳng hạn ở
giải quy ng h i chết trườ ợp vô sinh có nguyên nhân do ngườ ồng, tinh trùng ít và kém ho t ạ
động, có th chể ọn tinh trùng để tiêm vào tr ng cứ ủa người vợ. Ngoài ra, phương pháp ICSI
còn được th c hi n ự ệ ở trường hợp do tinh trùng ít (dưới 500.000/ml). Những đôi vợ ch ng ồ
đã áp dụng kĩ thuật TTTON bình thườ ột đế ần nhưng thấ ại cũng đượng từ m n hai l t b c áp
dụng phương thứ năng thụ ủa ISCI cao hơn thụ TTTON bình thườc này. Khả tinh c ng ở
người.
Sau khi th tinh, t bào trụ ế ứng được chuyển sang môi trường nuôi để h p t ti p t c ợ ử ế ụ
phát tri ng nuôi hi n nay nhi u lo ng v t có vú là TCM-199 b xung ển. Môi trườ ệ ở ề ại độ ậ ổ
huyết thanh bê và l c vô trùng b ng màng l c 20- u ki n ọ ằ ọc có kích thướ 22 µm, trong điề ệ
20
Nhóm 6 Đặng Thị Nga 581021
thích h p c a t m CO u thí nghi t k t qu , phôi phát tri n t t khi tách ợ ủ ủ ấ
2
v.v… Nhiề ệm đạ ế ả ể ố
tế bào cumulus ra kh i t bào tr ng trong 20-24 gi sau th tinh và n u cùng nuôi v i t ỏ ế ứ ờ ụ ế ớ ế
bào h n chu kì phân bào th 4 là thích h p cho kh n thành ạt (granulosa) đế ứ ợ ả năng phát triể
phôi dâu-phôi nang. Tuy nhiên, th i gian nuôi h p t phát tri n dài hay ng n tùy thu c ờ ợ ử ể ắ ộ
theo loài và theo yêu cầu kĩ thuật. Ch ng hẳ ạn ở trâu, bò, dê, c u, ngừ ựa đến tr ng thái phôi ạ
dâu phôi nang v i 32-64 t ớ ế bào để đông lạnh ho c c y phôi; ặ ấ ở người, phôi có t 4-8 t bào ừ ế
để ử cấy vào t cung v.v…
M t s ch ộ ố ỉ tiêu đánh giá TTTON như sau:
1. S ự sâm nh p c a tinh trùng vào tr ng ậ ủ ứ
2. S ự hình thành ti n nhân trong trề ở ứng
3. S ự phân chia hợp tử thành t n b n ho c tám t bào ừ hai đế ố ặ ế
4. S ự hình thành phôi nang
5. Có th nhi m s c Y trong m t s phôi bi u hi n th ể ễ ắ ộ ố ể ệ ụ tinh đa tinh trùng
6. Có đuôi tinh trùng ở xoang tế bào ch t ấ
Trong các ch tiêu trên, ỉ chỉ tiêu có ý nghĩa hơn cả là sự phân chia tế bào và hình
thành phôi nang, đối v i công ngh sớ ệ ản xuât phôi cũng như công nghệ gen, phôi dâu, phôi
nang s mang l i hi u quẽ ạ ệ ả cao, đem lại đầy đủ ý nghĩa củ a lợi ích thụ tinh trong ống
nghiệm. Và để đánh giá kế ấy phôi để con non ra đờ t quả chọn vẹn, nhất là c i là chỉ tiêu
cao nh t và có s c thuy t ph c mấ ứ ế ụ ạnh mẽ nhất.
t ng quát quá trình th tinh trong ng nghiSơ đồ ổ ụ ố ệm như sau:
SƠ ĐỒ QUY TRÌNH TH TINH TRONG NG NGHI MỤ Ố Ệ
| 1/191
| | Tải xuống

Có thể bạn quan tâm:

Preview text:

Chương I
THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM I. KHÁI NIỆM
Ở loài động vật có vú,sự thụ tinh (fertilization) là quá trình kết hợ của tế bào tinh
trùng còn gọi tắt là tinh trùng, tinh bào (spermatocyte) ở con đực với tế bào trứng còn gọi
tắt là trứng (noãn bào) (oocyte) ở con cái trong cơ thể mẹ (tại 1/3 phía trên của ống dẫn
trứng) để tạo ra 1 tế bào mới gọi là hợp tử (zygote) và hợp tử sẽ phát triển thành cơ thể
mới. Qúa trình này bao gồm hàng loạt biến đổi sinh lí, sinh hóa phức tạp ở tinh trùng và
ở tế bào trứng trước, trọng và sau khi chúng kết hợp với nhau, cùng với những tác động
của môi trường trong đường sinh dục của cơ thể mẹ.
Thụ tinh trong ống nghiệm (in vitro fertilization-ivf) là quá trình kết hợp giữa tinh
trùng hay còn gọi là giao tử đực với trứng hay còn gọi là giao tử cái để tạo ra hợp tử ở
ngoài cơ thể mẹ - trong phòng thí nghiệm - với môi trường sinh học nhân tạo với các điều
kiện thích hợp như: nhiệt độ, độ ẩm, độ nhớt, độ ph, áp suất thẩm thấu các chất dinh
dưỡng, các chất kích thích, các ion.v.v… cùng với các chỉ tiêu sinh học khác gần giống
như trong cơ thể mẹ (tại ống dẫn trứng ).
Ngày nay với công nghệ sản xuất phôi trong ống nghiệm (in vitro produced-IVP),
không chỉ có thụ tinh mà từ thu trứng ,nuôi trứng lớn và chín (in vitro-matured-IVM) đến
nuôi hợp tử phát triển (in vitro cultured-IVC) thành phôi dâu (morula) hoặc phôi nang
(blastocyte) cũng thực hiện trong thí nghiệm trên hầu hết các loài có vú. Tuy nhiên để
phôi tiếp tục phát triển và sinh ra cơ thể mới, người ta phải tiếp tục cấy truyền phôi
(embryo transfer-ET) vào tử cung của con cái nhận phôi, phôi được nuôi dưỡng, phát triển
thành thai và được mẹ sinh ra. Toàn bộ quá trình trên gọi là công nghệ sản xuất phôi trong
ống nghiệm-cấy phôi (hình 3)
Thụ tinh trong ống nghiệm được tiến hành nghiên cứu đầu tiên trền thỏ và là động
vật có vú đầu tiên ra đời vào năm 1954 do Dauzier và cộng tác viên tiến hành. Đến năm
1959 do Chang thực hiện và sau đó đã có nhiều động vât có vú khác sinh ra bằng phương
pháp này (bảng 1). Ở người em bé đầu tiên ra đời vào năm 1978 ở do các nhà khoa học
Steptoc và Edward, đến nay đã có hơn 10.000 em bé được ra đời trên nhiều nước bằng kĩ
thuật thụ tinh trong ống nghiệm (TTTON).
Ở Viê t Nam, ngay 30/4/1998, ba em be trao đơi tư k t
ê qua thu  tinh trong ông nghiê m.
Đây la nhưng thanh công đâu tiên cua Viê t Nam. Tư đo đên nay, con sô nay đa lên đên hang trăm em. 1
Nhóm 5 Đặng Thị Nguyên 596417
Bảng 1. Một số động vật có vú ra đời bằng thụ tinh trong ống nghiệm Tác giả Loài động vật Chang, 1959 Thỏ Whittingham Chuột Toyodia và Chang, 1974 Chuột cống Steptoe và Edwards, 1978 Người Brackell và cs, 1992 Bò Hanada, 1985 Dê Shiba Hanada, 1985 Cừu Cheng và cs, 1986 Lợn
Nhiều báo cáo về kết quả đầu tiên của sự thụ tinh trong ống nghiệm ở động vật có
vú hầu hết là ở giai đoạn tinh trùng xâm nhập vào tế bào trứng hình thành tiền nhân và bắt
đầu phân chia tế bào. Ở giai đoạn đầu của sự thụ tinh tế bào trứng bắt đầu phân chia, người
ta gọi tế bào này là tế bào phôi hay phôi bào (blastomere) (bảng 2)
Hiện nay thụ tinh trong ống nghiệm đã đạt nhiều thành tựu cao hơn trên nhiều lĩnh
vực ở nhiều loài động vật có vú từ chuột, thỏ đến các gia súc lớn có sừng và nhiều động vật quý hiếm.v.v... 2
Nhóm 5 Bùi Thị Hòa 596399
Bảng 2. Những kết quả đầu tiên về thụ tinh trong ở động vật có vú Tác giả Loài động vật Kết quả đạt được Chang, 1959 Thỏ Đẻ con Dauzier & Cừu Tiền nhân Thibault, 1959 Yanagimachi &
Chuột đồng Trung Quốc Thâm nhập, tiền nhân và phân Chang, 1964 chia tế bào Whittingham, 1958 Chuột Phân chia tế bào và thai
Pikworth & Chang, Chuột đồng Trung Quốc Thâm nhập và tiền nhân 1969 Edward & cs, 1969 Người Thâm nhập và tiền nhân Hamner và cs, Mèo Phân chia tế bào 1970 Yanaghimachi, Chuột lang
Thâm nhập tiền nhân và phân 1972 chia tế bào Gould & cs, 1973 Khỉ Rhesus
Tiền nhân và phân chia tế bào Miyamoto và Chuột Thâm nhập Chang, 1973 Iritani & cs, 1975 Lợn
Thâm nhập, tiền nhân, phân chia Mahi & Yanagimachi, 1976 Chó
Thâm nhập, mở rộng đầu Iritani & Niwa, Bò Thâm nhập và tiền nhân 1977 Hanada và Chang, Hươu chuột Thâm nhập và tiền nhân 1978 Hanada và Dê Thâm nhập Isutsumi 3
Nhóm 5 Bùi Thị Hòa 596399 II. Ý NGHĨA
Thụ tinh trong ống nghiệm có rất nhiều ý nghĩa thực tiễn trong đời sống:
1. Khai thác được rất nhiều tiềm năng và sinh sản của con cái nhất là ở
những động vật quý hiếm có nguy cơ bị tiêu diệt và những gia súc cao sản. Việc khai thác
và sử dụng được tế bào trứng ở những nang trứng non trên buồng trứng của con cái đã
tăng hiệu suất sinh sản của chúng, nhất là đối với những động vật đơn thai.
2. Con vật đầu tiên ra đời bằng kĩ thuật này đã chứng tỏ con người có thể làm chủ
công nghệ sinh học sinh sản của động vật. Trải qua nhiều thập niên, những nghiên cứu về
sinh lý tế bào trứng, sinh lý của sự thụ tinh, tìm hiểu siêu cấu trúc những biến đổi tế bào
trong quá trình chín, thụ tinh cũng như tác nhân nội tại và ngoại lai thúc đẩy, ức chế các
quá trình này.v.v... Nhiều nhà khoa học không chỉ thành công trên lĩnh vực này mà trên
nhiều động vật có vú mà còn tạo nên nhiều ý tưởng tiền đề khác cao hơn, sâu hơn về bản
chất và mục tiêu của công nghệ sinh sản và công nghệ gen ở động vật. Trong nghiên cứu,
thí nghiệm về sự thụ tinh trong ống nghiệm, về tế bào trứng, tế bào phôi, nhiều nghiên
cứu, thí nghiệm khác về nhân phôi, lai ghép phôi, nhân bản vô tính, cấy ghép nhân-
gen.v.v... cũng đan xen, mắc nối và dựa vào nhận xét ban đầu, vật liệu ban đầu, bước đi
ban đầu của kỹ thuật sản xuất phôi trong ống nghiệm mà một thành tựu có ý nghĩa lịch sử
làm chấn động dư luận thế giới đó là sự ra đời của cừu Dolly. Con cừa Dolly ra đời năm
1997 đã tạo nên một cuộc cách mạng trong công nghệ sinh học vào cuối thế kỷ XX, đến
nay đã nhân bản thành công năm loài động vật.
3. Trong chăn nuôi gia súc, sản xuất phôi trong ống nghiệm cùng với cấy truyền phôi
(IVP-ET) đã góp phần tham gia vào quá trình chọn lọc, nhân giống lai tạo giống, nhanh
chóng đạt được năng suất cao về sữa, thịt, tăng hiệu quả công tác giông do tạo được nhiều
phôi của các cặp đực cái cao sản mà có nhiều đời sau để kiểm tra, giúp cho việc đánh giá
con vật sớm hơn, rút ngắn khoảng cách giữa các thế hệ, nhất là ở gia súc có vòng đời và
chu kì sinh sản dài như trâu, bò, ngựa v.v... Sự thụ tinh trong ống nghiệm cùng với những
phương pháp kỹ thuật xác đinh giới tính và nhân phôi, người ta có thể tạo đàn gia súc đực-
cái theo ý muốn như trong chăn nuôi lấy sữa có thể tạo đàn bò cái cho sữa có số lượng và
chất lượng theo yêu cầu. Với kỹ thuật đông lạnh, các sản phẩm sinh học ngày càng hiện
đại, người ta có thể xây dựng ngân hàng gen thông qua việc bảo quản đông lạnh tế bào
trứng cũng như tế bào phôi v.v... tạo điều kiện thuận lợi cho việc trao đổi vật liệu sinh học
sinh sản, vật liệu di truyền phục vụ cho công tác giống, sinh sản trên phạm vi rộng lớn. 4
Nhóm 5 Bùi Thị Hòa 596399
4. Sự thụ tinh trong ống nghiệm giúp cho người làm công tác kỹ thuật đánh giá nhanh
được khả năng thụ tinh các con đực giống khác nhau.
5. Sự làm chủ về nuôi trứng chín (in vitro maturation –IVM) là sự thụ tinh trong ống
nghiệm (IVF) đã cho phép cung cấp được cho các nhà nghiên cứu một số lượng lớn các
phôi với giá thành hạ (Louis-Marie Houdebine, 1992).
6. Ở người thụ tinh trong ống nghiệm đã giúp cho những vợ chồng không có khả năng
sinh đẻ do ống dẫn trứng không có khả năng đảm bảo các điều kiện thụ tinh hoặc trúng
không gặp được tinh trùng do viêm tắc chai cứng v.v... trong buồng trứng vẫn hoạt động
bình thường và tử cung có đầy đủ điều kiện tiếp nhận và nuôi dưỡng phôi - thai và đẻ con.
Nguyên nhân vô sinh có thể do người chồng như khả năng sinh tinh kém, số lượng hoạt
động quá thấp v.v... không đảm bảo số lượng tinh trùng/trứng (khoảng 50000 tinh
trùng/trứng), người ta có thể tiến hành công nghệ vi tiêm tinh trùng vào tế bào trứng
(intracytoplasmic sperm injection-ICSI).
7.Sự thụ tinh trong ống nghiệm có thể thực hiện bất cứ lúc nào nếu có trứng và tinh
trùng đủ điều kiện kết hợp với nhau đẻ hình thành hợp tử. Đến nay, ở người có tỉ lệ sinh
con ra còn sống do thụ tinh trong ống nghiệm đạt từ 15-17% số ca điều trị, những bệnh
viện có thiết bị hoàn hảo và có nhiều kinh nhiệm có thể đạt đến 25%.
III. SO SÁNH SỰ THỤ TINH THÔNG THƯỜNG, TỰ NHIÊN VÀ SỰ THỤ TINH
TRONG ỐNG NGHIỆM.
Sự thụ tinh ở động vật cái đã được nghiên cứu trên nhiều mặt của nhiều loài khá kĩ
lưỡng về sự biến đổi của các tế bào sinh dục trong quá trình thụ tinh với điều kiện thích hợp của chúng.
Sau khi rụng, tế bào trừng và dịch nang trứng được hút vào loa kèn rồi vận chuyển
nhanh đến chỗ phình của ống trứng. Ở một số loài động vật có vú như trâu, bò, dê, lợn,
cừu,ngựa v.v... khi rụng, trứng ở trạng thái phân bào giảm nhiễm thứ II, đang hình thành
thoi nhiễm sắc (thể cực I của phân bào giảm nhiễm I đã ở bên ngoài chất nguyên sinh). Ở
chó, mèo, thỏ, chuột v.v... trứng rụng ở trạng thái sớm howncuar phân bào giảm nhiễm
thứ I như chó cái, mèo cái. Trong thời gian di chuyển, dịch ống phấn có tác động nhất
định đối với tế bào trứng về cơ chế hóa học, lớp tế bào vành phóng xạ của trứng cũng mất
đi một phần, bởi tế bào hình trụ trên niêm mạc ống dẫn trứng bào mòn.
Sau khi phối giống hay dẫn tinh, tế bào tinh trùng dẫn nhanh qua tử cung đến 1/3 phía
trên của ống dẫn trứng trong vòng 5-15 giờ, tùy theo loài, nhờ nhu động của tử cung, ống
dẫn trứng và hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng. 5 Nhóm 5 Lê Thị Hà 591313
Trong quá trình di chuyển này,dịch cổ tử cung và cổ tử cung, dịch ống dẫn trứng với
nồng độ các chất hòa tan, các ion v.v.. cao đã “hoạt hóa” tinh trùng, mặt khác số lượng
tinh trùng giảm đi rất nhiều tùy theo loài từ hàng 100 triệu, thậm chí một tỷ khi đến chỗ
thắt, chỗ phình của ống dẫn chúng chỉ còn hàng trăm, hàng chục và khi thụ tinh chỉ có
một tinh trùng chui được vào tế bào trứng. Có một số thay đổi ở đầu tinh trùng (sau khi
được hoạt hóa) ngay trước lúc thâm nhập vào tế bào trứng và được gọi là phản ứng
acrosome. Sự xâm nhập ban đầu do nhiều tinh trùng chui qua lớp tế bào vành phóng xạ
bằng độ cứng của đầu và các phản ứng acrosome để giải phóng ra các enzim hyaluroisidae.
Như vậy sự thụ tinh cần có số lượng tinh trùng tăng hơn và sự chọn lọc của sự thụ tinh là
rất cao. Ở bò, mèo, chuột, tinh trùng xâm nhập vào toàn bộ tế bào trứng. Ở các gia súc
khác chỉ có đầu, cổ tinh trùng còn phần đuôi tinh trùng bị đứt ở ngoài và bị thoái hóa.
Thực chất của sự thoái hóa là kích thích tế bào trứng phân chia giảm phân II hoàn thành
quá trình chia của trứng. Sau khi xâm nhập vào chất nguyên sinh của tế bào trứng, đầu
tinh trùng biến hình, tăng thể tích và hình thành các nhân nguyên chui qua màng nhân của
tế bào trứng. Trong các nhân nguyên đực (của tinh trùng)
Xuất hiện các nhân nguyên cái (cầu trứng ) cũng đồng thời xuất hiện (buộc muộn hơn).
Sau đó chúng đồng hóa lẫn nhau, thực hiện AND của cha và mẹ hình thành cơ thể di
truyền của cơ thể mới mà hợp tử là tế bào đầu tiên (hình 5)
Như vậy là giữa sự thụ tinh thông thường tự nhiên và sự thụ tinh trong ống nghiệm
(Invitro), trên thực tế hiện nay về những điều kiện chung như nhiệt độ, độ pH, áp suất của
O2 và của CO2, áp suất thẩm thấu, sự cân bằng v,v,…trong môi trường nuôi là rất gần
với điều kiện vốn có trong ống dẫn trứng của con cái ở mỗi loài. Tuy nhiên một số vấn đề
khác biệt của thụ tinh trong ống nghiệm với thụ tinh thông thường cần được quan tâm là
số lượng tinh trùng được sử dụng, sự thiếu vắng của cường độ chọn lọc tự nhiên, sự kéo
dài thời gian cần thiết cho sự tiếp xúc giữa tinh trùng với trứng trước khi tinh trùng xâm
nhập vào trứng, sự cải biến 1 cách sâu sắc những điều kiện thụ tinh ở gần bên tế bào trứng,
kết quả ngay cả sự thụ tinh cũng không thể thực hiện được hoặc làm hạn chế sự phát triển
tiếp theo của phôi, thai hoặc cả đến khi sinh đẻ
1. Tăng số lượng tinh trùng cần thiết
Sự khác biệt quan trọng nhất là số lượng tinh trùng cần thiết kề sát với tế bào trứng để
thụ tinh trong ống nghiệm được thực hiện phải tăng lên nhiều lần.
Trong quá trình thụ tinh của con cái ,tất cả những nghiên cứu cho rằng số lượng tinh
trùng có mặt ở chỗ phình của ống dẫn trứng lúc trứng rụng của hầu hết các loại là khoảng
vài chục. Điều đó được xác nhận ở loài rụng trứng nhiều bởi có những trứng không còn
thụ tinh ở giữa những trúng đã được thụ tinh sau rụng trứng. Kiểm tra trên kính hiểm vi
vì lứa trứng thô trong giờ tiếp tục rụng thì tất cả trứng không còn thụ tinh cũng không có 6 Nhóm 5 Lê Thị Hà 591313
1 tinh trùng nào ở vành phóng xạ co rút lại sát tế bào trứng. Sự thụ tinh xảy ra bình thường
ở lúc dẫn tinh là 1\10.000 hay ít hơn và chỉ cho phép rất ít tinh trùng trong ống dẫn trứng,
với 375.000 tinh trùng sống bằng dẫn tinh tỉ lệ thụ thai xấp sỉ 60% (57% của 521 bò cái)
và số tinh trùng tối đa tìm thấy ở chỗ nối sừng tử cung với ống dẫn trứng là 130, ở chỗ
thắt ống dẫn trứng là 25 là ở chỗ phình của ống dẫn trứng là vài tinh trùng (Jondet, 1973) (bảng 3)
Bảng 3 : Số lượng tinh trùng ống dẫn trứng gần lúc rụng trứng ở một số loài động vật
Loài động Số
Chỗ thắt Chỗ phình Số Sự Tác giả vật giờ
của ống của ống lượng thụ sau dẫn
dẫn trứng tinh tinh khi trứng trùng phối /trứng hay dẫn trứn g Chuột >12 <1 Shalgi, Kraicer Chuột 3 5-16,X=25 1978 Chuột 8 0- Takeuchi, CS, Chuột 134,X=24 1970 Nhắt 2- Braden,Austin,19 Chuột 4-8 75,X=16,9 <1 <50% 54 Ghine 25-50 Braden,Austin,19 Chuột 9-10 1-25 100% 54 Đồng Bladau,1969 12 X=11.20 Cumin,yanagica- Chuột 0 chi,1982 Đồng 1- 4 1/2 Cumin,yanagica- 172,X=17 (50% chi,1982 Thỏ 12- ) Overstreet,cooper 16 2500- 4-10 1978 Dơi 18 4500 15 Mori,uchida,1982 12 1400- 121-135 13,4 100% Bò 10 2500 >10 100% Dauzier,1958 Bò 36 Thibault và cs Cừu 8-14 1973 Cừu 24 Thibault và Cừu 24 480-1650 17-25 cs,1967 Cừu 30 3-432 4-25 109 Hunter,1980 Lợn 5800 72% Lang,oh,1970 7
Nhóm 5 Nguyễn Thị Hương Anh 591307 Lợn 1- 1037 Dauzier ,1958 Lợn 20x10^4 Dursel và cs,1978 Lợn 4300 Rigby, 1966 Dumesdy và cs, 1955 Hunter,1972
Ngươc la i thu  tinh trong ông nghiê m sô lương tinh trung so vơi thu  tinh thông thương
trong tư nhiên noi chung tăng hơn nhiêu ơ đô ng vâ t co tâm voc lơn (bang 4).
Bang 4. Sô lương tinh trung thich hơp vơi ty lê  thu  tinh trong n ô g nghiê m Loai đông Số tinh Sô tinh Thu  tinh,% Tac gia vâ t trùng/ml trung/trưn g Bo 0,25×106 1×10 - 4 105 15/75=20% Brackett,cs,1980 Bo 0,20×106 510/575=89% Fulka,Pavlok,1982 (bo cai vung Cưu 3× 106 3× 105 lạnh) Bodioli,Wright,1980 Lơn 0,5-1× 106 25-40× > 14% Inritani,Niwa,Imai,1 Chuô t 0,15-0,5× 103 10/116=8% 978 Chuô t 106 268/304=94% Niwa,Chang,1973 nhăt 0,1-0,6× 106 2-54× 103 212/273=78% Tsunoda,Chang,197 Tho 0,11× 106 18-44% 5 Tho 0,25× 106
234/620=38% Reyes va cs,1978 Chuô t 2-3× 105 32/32=100% Brackett Ghine 2-10× 106 1× 103 99/116=84% Oliphant,1975 Chuô t 1-5× 106 1 13/31=42% Yanagimachi,1972 hang Niwa,1980 Chuô t Bvister,1979 hang
Nhưng sô liê u ơ ph n
â lơn cac loai đươc nghiên cưu trong bang 4 đa chi ra răng, đê thu đươ c k t
ê qua ty lê  thu  tinh (%) trong n
ô g nghiê m xâp xi vơi thu  tinh trong tư nhiên, mâ t
đô  tinh trung không the giam dươi 1× 105 -1× 106/ml hoă  c 104-105 tinh trung/trưng trong
điêu kiê n nuôi cây thông thương. Ro rang la sô lương tinh trung vơi thu  tinh trong ông nghiê m tăng la c n
â thiêt. Đê tiên hanh thu  tinh, vươt qua mang trong suôt tinh trung cân
phai co sư hoa t đông trao đôi ch t
â ma nh me va tang vâ n đông. Sư tăng chuyên đô ng nay 8
Nhóm 5 Nguyễn Thị Hương Anh 591307 xu t
â hiê n mô t cach tư đô ng invitro sau khi đươc san sinh ra sư hoa t hoa tinh trung nhưng
chi khi nao mât đô cua tinh trung con la i tăng lên. Trong con cai, nhưng y u ê tô ch n ô g hoa t
hóa đa bi  loa i bo trong qua trinh tinh trung đi qua cô, thân va sưng tư cung. Trong ông nghiê m, ngươi ta b t
ă buô c phai loa i bo cac y u ê tô trên b n
ă g ly tâm va rưa nhưng đông thơi
cung lam ngheo tinh trung b n ă g nhưng y u
ê tô vân đô ng ma tư lâu ngươi ta đa bi t ê r n ă g,
pha loang môi trương keo theo sư mât mat nhanh chong sưc hoa t đông cua tinh trung. Như
vâ y la thu  tinh trong ông nghiê m co nông đô  tinh trung tăng tương ưng nêu không nhưng
yêu tô cua sư vâ n đông se không tăng lên trong môi trương thu  tinh. Điêu đo chi đa t đươc trong n
ô g nghiê m khi cai ti n
ê sư pha loang môi trương hoa t hoa mô t cach hơp ly nhât, đo la lam tăng cac y u ê t
ô tăng vâ n đô ng.v.v.. giông như trong tư nhiên (in vivo).
2. Sư thiêu văng cương đô  cho n lo c tư nhiên
Đa giai thich sư cân thiêt co sô lương tinh trung tăng đê thu  tinh trong ông nghiê m,
điêu ma thương đươc tiên hanh trong qua trinh tinh trung di chuyên tư âm đa o hay tư cung
đên ông dân trưng hoă c chô phinh cua n
ô g dân trưng, Cohen va Ne Naughton (1974) đa
thi nghiê m dân tinh cho tho b n
ă g tinh trung cua sư phong tinh đê sinh ra mô t tho con phai
co 1,6× 107 tinh trung, tinh trung ơ tư cung la 2,7× 105 va tinh trung ơ n
ô g dân trư  ng chi
co 1,04× 102. Điêu nay chi ra răng, thu  tinh trong tư nhiên (in vivo) đa co sư cho n lo c rât
ma nh. Sư cho n lo c nay co vai tro v
ê chuyê hoa hinh thai va v
ê sưc hoa t đông, no cung co
nhưng đă c tinh cua khang nguyên, chi nhưng tinh trung đơi ơ n
ô g dân trưng không ki p cô
đi nh nhanh chong vơi lgG đê ba ch c u
â không nhâ n ra la vâ t la  va nhơ đo ma tinh trung
cua mô t sô loai như tho co thê ơ chô phinh va loa ken 54 ngay sau khi giao phôi (theo
Gerad, Levasseur va Thibault). Ơ bo cai tơ, bo cai, dê cai va chuô t hang, sư co mă t cua
tinh trung đa kich đô ng ba ch c u
â lan tran trong tư cung nhưng không say ra ơ ông dân
trưng. Ơ bo cai, ba ch câu đa co mă t ơ tuy n
ê tư cung va thưc bao tinh trung nhưng không co ba ch c u
â nao trong cac nêp g p â cua chô n i
ô tư cung – ông dân trưng hay trong chô
tharwstneen ơ đo đa tư thiêt lâ p dư trư tinh trung.
3. Keo dai thơi gian gă p nhau giưa tinh trung vơi trưng
Sư thu  tinh in vitro (trong n
ô g nghiê m) cung la mô t khac biê t so vơi in vivo (trong cơ
thê me  hay trong tư nhiên). Ơ bôn loai đô ng vâ t co vu (cưu cai, bo cai, lơn cai, tho cai)
co thơi gian dai khac thương đê tinh trung gă p trưng vơi thu  tinh in vitro (bang 5).
Trong thơi gian nay, mô t ph n
â quan tro ng cua tinh trung đa giai phong ra cac enzyme
ưng acrosomic hay la chêt) đang trông qua trinh phân huy t
ê bao hoă c sinh san vô tinh cua
trưng. Ngươc la i, ơ nhưng loai gă m nhâm nho, thơi gian gă p nhau cua cac t ê bao sinh du c
đên khi thu  tinh in vitro la binh thương.
Như vâ y la nhưng khac biê t trên, đă c trưng nhât la mâ t đô  cao, tinh trung la i r t â hoa t
đô ng trong mô t môi trương “giam ham”.v.v…cua thu  tinh in vitro (so vơi in vivo), cu i ô 9
Nhóm 5 Đào Thị Minh Nguyệt 591328
cung la cơ chê tư điêu chinh sư cân băng giưa cac phân tư trong môi trương đa gây nên
hang loa t rôi loa n va đê cuôi cung co vai tinh trung may măn do nhi u
ê tinh trung khac ta o
nên thưc hiê n nhưng điêu kiê n cho phep xâm nhâ p qua mang trong suôt (zona pellucida)
va kêt hơp vơi trưng ta o nên mâm cua mô t cơ thê mơi trong phong thi nghiê m.
Bảng 5. Thời gian các tế bào sinh sản gặp nhau đến khi thụ tinh in vivo và in vitro Phương Thời Tác pháp gian giả Loài Hoạt thụ tinh kiểm động vật hóa tra Trạng thái thụ (giờ ) tinh Phương thời gian pháp (giờ) 10
Nhóm 5 Đào Thị Minh Nguyệt 591328 Lợn In vitro 5 In vitro 17 Trong kì II sớm 1 trong tử nhiều tiền nhân cung Lợn 3-5.7
In vitro 3-5.7 Tiền nhân sớm 2,3 In vitro Bò 4-6 In vitro 20- Tiền nhân -> 4 4 In vitro 24 tế bào Bò (HIS) 5 In vitro Trung kì II -> 5 18- tiền In vitro 21 nhân sớm Bò trong tử 12-18 In vitro 6 cung Tiền nhân đực Cừu 3 In vitro 1-3 sớm 7 In vitro 48 Đầu tinh trùng Cừu In vitro 12-24 In vitro phình ra -> lớn 8 hơn 2 tế bào Thỏ 14 In vitro 2,25 Đầu tinh trùng 9 10 In vitro phình ra Thỏ 13 In vitro 3-5 Trạng thái sớm 11 In vitro Thỏ <5
In vitro 0.5-1 Trạng thái sớm 12-13 In vitro Chuột 0.5-1.5 In vitro 10- Trạng thái sớm 14 hang In vitro 12 Tinh trùng ở In vitro 5 In vitro 2-4 trong chất 15 Chuột nguyên sinh của hang trứng In vitro 0.3- Tinh trùng đag 0.6 xâm nhập hoặc ở trong chất nguyên sinh của trứng
Ghi chú : (1) Iritani, Niwa, Imai, 1978; (2) Hunter, 1974; (3) Thibault, 1959; (4) Brackett
và cs 1980; (5) Iritani, Niwa, 1978; (6) Thibault tài liệu không công bố; (7) Bondioli,
wright, 1980; (8) Dauzier, Thibault, 1959; (9) Hosui và cs, 1981; (10) Soupart, Chhibault,
1967; không công bố (11) Thibault, Dauzier, 1961; (12) Thibault, 1967, (13) Brackett,
1979; (14) Yanagimachi, 1972; (15) Tsunoda, Chang, 1977. 11
Nhóm 5 Đào Thị Minh Nguyệt 591328
IV. PHƯƠNG PHÁP
Nguyên tắc chung của các phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm là khai thác thu
nhặt buồng trứng từ con cái, tinh hoàn con đực, sau đó những tế bào trứng và tinh trùng
được xử lí, chọn lọc, phân loại, hoạt hóa, nuôi lớn, nuôi chín.v.v…rồi tạo điều kiện
cho chúng gặp nhau trong môi trường tối ưu để thụ tinh xảy ra, hợp tử được hình thành,
sau đó hợp tử phát triển thành phôi.
1. Khai thác thu thập tế bào trứng
Để có được tế bào trứng còn gọi là giao tử cái, người ta thu thập từ ống dẫn trứng sau
khi trứng rụng, từ nang trứng của buồng trứng bằng nội soi - siêu âm hoặc bằng giải phẫu
những con vật đang còn sống, từ nang trứng ở buồng trứng những con vật đã bị giết (ở lò mổ). 1.1.
Thu trứng từ ống dẫn trứng của con cái
Sau khi trứng rụng tự nhiên hoặc sau khi sử dụng các hoocmon kích thích trứng phát
triển chín và rụng, trứng thu được bằng cách này có tỷ lệ chín (phân chia giảm nhiễm,
chuẩn bị thụ tinh) cao hơn ( hình 5a). Tuy nhiên việc xác định chính xác thời gian thu
trứng ở ống dẫn trứng có ý nghĩa quan trọng, nếu muộn quá trứng đã qua thời điểm thụ
tinh thích hợp và hoàn toàn phụ thuộc vào thời gian rụng trứng ở mỗi loài. Ở bò cái sinh
sản, rụng trứng sau kết thúc động đực 10 - 14 giờ, ở cái tơ là 9 - 10 giờ. Ở ngựa rụng trứng
vào khoảng 24 giờ trước khi kết thúc động đực, ở lợn từ giữa đến cuối động đực, ở dê,
cừu vào lúc cao điểm của động đực (Lubos Holy, 1980). Để thu được trứng người ta phải
phẫu thuật để bộc lộ ống dẫn trứng và sử dụng ống thông để bơm dung dịch PBS vào ống
dẫn trứng dội rửa vài lần, sau đó tìm trứng ở dung dịch rửa và phân loại các trứng thu
được. Cách thu trứng này thường được sử dụng ở các động vật thí nghiệm. 1.2.
Thu trứng từ các nang trứng của buồng trứng
Ở động vật đang sống, thường được khai thác trứng nhiều lần để tận dụng triệt để tiềm
năng sinh sản của buồng trứng nhất là những con vật có giá trị di truyền cần được bảo tồn
hoặc ở những động vật có chu kì sinh sản dài. Những con gia súc có năng suất cao và
những tế bào trứng này bao giờ cũng có nguồn gốc của con mẹ. Sau khi chọn con cái theo
yêu cầu, người ta tiêm các hoocmon kích thích nhiều nang trứng chín và thường trứng thu
được ở trạng thái thứ cấp. Bằng kĩ thuật nội soi - siêu âm, người ta sử dụng kim dài xuyên
qua thành âm đạo chọc và tìm nang trứng chín để hút tế bào trứng. Đây là phương pháp
được sử dụng rộng rãi ở người, gia súc lớn, trên nhiều nước hoặc nội soi qua thành bụng
đối với động vật nhỏ cũng như giải phẫu bộc lộ buồng trứng giống như cách thu trứng ở
ống dẫn trứng đối với động vật thí nghiệm. 12
Nhóm 6 Phạm Thị Tuyến 581060
Đối với những động vật sắp chết hoặc gia súc ở lò mổ, người ta thu buồng trứng ngay
sau khi mổ trong điều kiện vệ sinh vô trùng và bảo quản trong môi trường thích hợp, vận
chuyển nhanh về phòng thí nghiệm và tiến hành thu trứng. Ở phương pháp này, trứng thu
được từ nang trứng còn non cần được nuôi chín đến khi đạt trạng thái có thể thụ tinh. Vì
vậy, tận thu được số lượng lớn tế bào trứng hơn các phương pháp khác, nhưng đa số trứng
không rõ nguồn gốc con mẹ. Tỷ lệ nuôi chín và thụ tinh trong ống nghiệm cao hay thấp
phụ thuộc nhiều vào chất lượng và trạng thái của trứng trong nang trứng. Những nang
trứng có đường kính lớn nên thu trứng, ở bò kích thước nang trứng 2 - 6mm trở lên, ở
người > 17mm.v.v… Phương pháp thu trứng từ buồng trứng bò hiện đang được sử dụng là:
a. Phương pháp chọc hút (follicle puncturing): dùng kim 18G và sơ ranh 5ml chọc vào
nang trứng rồi hút trứng ra.
b. Phương pháp rạch - múc (follicle dissection): dùng dao phẫu thuật rạch nang trứng
rồi múc trứng ra (dụng cụ nhỏ giống chiếc thìa).
Hình 5a. Sự phát triển của nang trứng
c. Phương pháp cắt-nghiền buồng trứng (ovary slicing) 13
Nhóm 6 Phạm Thị Tuyến 581060
Trong ba phương pháp trên phương pháp rạch múc số trứng thu được nhiều hơn, tỷ lệ
thụ tinh và hợp tử phân chia cao hơn (bảng 6).
Bảng 6. Phương pháp thu trứng từ nang trứng trên buồng trứng bò
Phương pháp chọc-hút
Phương pháp rạch-múc
Số lượng bò
Số trứng IVF/bò
Số lượng bò
Số trứng IVF/bò 11 11,4 10 19,1 28 6,5 15 10,8 25 6,9 9 9,7 14 7,1 4 17.3 8 7,2 11 13,6 ∑86 7,2 49 13,4
2. Phân loại và chọn lọc tế bào trứng
Sau khi thu thập xong, tế bào trứng được phân loại và chọn lọc để nuôi chín và thụ
tinh theo hình dáng, kích thước trứng, độ dày của lớp tế bào cumulus còn gọi là tế bào gờ
trứng (cumulus cell) bao quanh trứng. Phân loại tế bào trứng theo đặc điển lớp tế bào
cumulus bao quanh trứng là thực tế và hiệu quả. Tế bào trứng được thu nhận từ buồng
trứng của bò được phân loại như sau:
- Loại A: Tế bào trứng hoàn hảo, trứng có đám tế bào cumulus chắc, dày đặc bao quanh
vòng trong suất tròn rõ, chất nguyên sinh hoan hảo.
- Loại B: Tế bào trứng có các tế bào cumulus bao bọc một phần quanh trứng.
- Loại B’: Tế bào trứng gần như trần trụi với một lớp mỏng hoặc chỉ còn dấu vết của tế bào cumulus.
- Loại C: Không có tế bào cumulus bao quanh tế bào trứng mà chỉ có các sợi huyết (fibrin).
Thông thường chỉ dùng tế bào trứng loại A và B để nuôi tới chín, sau đó thụ tinh thành
hợp tử để phát triển thành phôi (bảng 7). Đối với các phương pháp thu tế bào trứng khác
và trên các loại gia súc khác nhau sẽ có tiêu chuẩn phân loại tương ứng. 14
Nhóm 6 Nguyễn Thị Thu 581042
Bảng 7. Sự phân chia tế bào sau khi thụ tinh ở các loại tế bào trứng của bò theo tính
chất của lớp tế bào cumulus (Shioya, Y, và cs, 1988)
Loại tế bào
Số tế bào trứng nuôi cấy
Số tế bào trứng phân chia trứng
sau khi thụ tinh, % A,B 364 232 (63.7) B’ 122 36 (29.5) C 158 28 (17.7)
3. Nuôi chín tế bào trứng
Khi sử dụng tế bào trứng đã rụng đang ở ống dẫn trứng hoặc sắp rụng ở nang trứng
chín (giai đoạn phân chia chín thứ cấp) quá trình thụ tinh xảy ra bình thường. Nhưng đối
với tế bào trứng khai thác từ nang trứng non, để có thể thụ tinh được phải nuôi lớn và đạt
đến kịch thước cuối cùng, chín đến metaphase II (hình 6 và 7). Chẳng hạn, trứng chuột từ
đường kính 15-20µm bằng môi trường nhân tạo có thể nuôi lớn đến kích thước cuối cùng
70-75µm (Pedersen T, peter H, 1968) trứng lợn và bò từ 30µm đến 120-125µm (Motlik
J, và cs, 1984; Hyttel P; Fairt và cs, 1997). Ngày nay người ta còn có thể nuôi lớn và chín
tế bào nang-trứng từ buồng trứng không chỉ ở chuột mà còn ở bò…trong phòng thí nghiệm
với hệ thống nuôi hai bước. Ở quá trình lớn-chín này, tế bào trứng phải nhận được những
thông tin và vật chất cần thiết chính trong quần thể các tế bào nang trứng, môi trường nuôi
để tiến hành chín trong nhân và trong tế bào chất nhằm đảm bảo quá trình thụ tinh phân
chia tế bào, hợp tử phát triển thành phôi-thai. Vì vậy trong những kĩ thuật nuôi lớn-chín
hiện nay, tế bào trứng cùng nuôi (co-cultrure) với các tế bào trong nang trứng .v.v…đã
đem lại hiểu quả cao về chín, thụ tinh và phân chia tế bào sau thụ tinh.
4. Thu thập và hoạt hóa tinh trùng
Tinh trùng sử dụng trong thụ tinh ống nghiệm có thể được khai thác từ tinh hoàn, phó
dịch hoàn (dịch hoàn phụ) của con đực qua con đường phóng tinh hoặc bằng phẫu thuật.
Bằng đường phóng tinh, tinh trùng hòa vào các dịch của các tuyến phụ rồi vào bộ máy
sinh dục cái được lấy dịch và kiểm tra pha chế bảo tồn như với đa số gia súc. Tinh trùng
từ nguồn nào và khai thác bằng cách nào sẽ không có khả năng thụ tinh nếu như không
được hoạt hóa trong đường sinh dục cái hoặc trong phòng thí nghiệm bằng hàng loạt
những biến đổi hóa sinh học, tế bào học.v.v…trước khi xâm nhập qua màng trong suốt để
kết hợp với nhân của tế bào trứng 15
Nhóm 6 Nguyễn Thị Thu 581042
Hình 6. So sánh sự phân chia tế bào giữa giảm phân (meiosis) và nguyên phân (mitosis) 16
Nhóm 6 Nguyễn Thị Hoa 580996
Hình 7. So sánh quá trình tạo giao tử (quá trình tạo trứng và quá trình tạo tinh trùng).
Có nhiều giả thiết về hoạt hóa tinh trùng. Thuyết về màng sinh học cho rằng, màng
của tế bào tinh trùng khi chưa hoạt hóa rất vững chắc để bảo vệ tinh trùng và chống lại
tất cả các ảnh hưởng xấu trong đường sinh dục cái; còn tinh trùng đã hoạt hóa thì tính
bền vững của màng thì ngược lại. Giả thiết khác lại cho rằng, hoạt hóa tinh trùng là
quá trình xóa bỏ enzyme ức chế của acrosome. Ở mỗi loài hoạt hóa tinh trùng hoàn
thành vào lúc phần lớn tinh trùng gặp tế bào trứng. Có ý kiến khác đề cập đến màng
tinh trùng và cho rằng hoạt hóa đòi hỏi loại trừ các yếu tố ức chế đã được hình thành
ở dịch hoàn phụ, tuyến phụ của con đực và đã phủ xung quanh màng tinh trùng.
Tinh trùng đã hoạt hóa in vivo có thể thu được ở đường sinh dục con cái sau khi
phối (tử cung, ống dẫn trứng) với phương pháp bơm, rửa bằng môi trường thích hợp;
đường sinh dục con cái có thể cùng loại hoặc khác loài với tinh trùng (bò, thỏ, dê, cừu).
Trong phòng thí nghiệm với chuột nhắt, chuột cống, thỏ, người tinh trùng có thể được 17
Nhóm 6 Nguyễn Thị Hoa 580996
hoạt hóa bằng cách rửa vài lần để loại bỏ tinh thanh và nuôi cấy một thời gian trong
môi trường nuôi. Ở bò, tế bào tinh trùng được hoạt hóa bằng nhiều phương pháp khác
nhau: cho tinh trùng vào trong dung dịch chứa nồng độ ion cao đó là HIS có áp suất
thẩm thấu khoảng 380 mOsm/kg trong 5 phút rồi rửa và nuôi tiếp trong 45 phút đến 5
giờ (Brackett và ctv, 1982); bổ sung vào môi trường nuôi cấy tổng hợp cafein và Ca++
giúp cho tinh trùng tăng cường phản ứng acrosome (Hanada và ctv, 1986) hoặc heparin
(Parrish, 1986) có điều chỉnh độ pH đạt 7,4. Ở ngựa, người ta sử dụng môi trường tyrod
cải tiến (PALP) với albumin huyết thanh bò có bổ sung heparin hoặc cafein hoặc
calcium ionophore để rửa và hoạt hóa tinh trùng.v.v…
Trong công nghệ sản xuất phôi bằng thụ tinh ống nghiệm ở một số loài gia súc, việc
sử dụng tinh dịch đã qua bảo quản đông lạnh - giải đông đề hoạt hóa tinh trùng đã trở
thành phổ biến nhất là đối với bò.Vì vậy, các phương pháp hoạt hóa cần được quan
tâm hơn về mối quan hệ khả năng thụ tinh và đông lạnh tinh trùng.
5. Thụ tinh và sự phát triển sau thụ tinh
Tế bào trứng chín và tinh trùng hoạt hóa được chuyển sang môi trường thụ tinh để
thực hiện quá trình xâm nhập, hình thành tiền nhân, kết hợp hai tiền nhân tạo thành
hợp tử. Để thực hiện quá trình này cần phải có số lượng tinh trùng , thời gian tiếp xúc
và một môi trường thích hợp cho từng loài để đạt được hiệu quả thụ tinh thành hợp tử.
Sau thụ tinh, hợp tử phát triển thành phôi với tỷ lệ cao.
Nồng độ tinh trùng hoạt hóa để thụ tinh ở động vật có vú vào khoảng 105-106 tinh
trùng/ml. Tuy nhiên, tùy theo loài mà nồng độ tinh trùng hoạt hóa có thể thay đổi như sau: Bò: 5-100 x 10 /
5 ml, trung bình > 50 x 105/ml Ngựa: 5 x 106/ml, 25 x 10 / 4 trứng Lợn: 4-5 x 108-10 / 9 ml Người: 5 x 10 / 4 trứng Dê: 105-10 / 6 ml
Cũng như thụ tinh in vivo, tỷ lệ thụ tinh in vitro còn phụ thuộc cá thể con đực, có
cá thể này sản xuất ra tinh trùng khả năng thụ tinh cao hơn cá thể kia. 18
Nhóm 6 Đặng Thị Nga 581021
Bảng 8. Ảnh hưởng của cá thể bò đực giống với tỷ lệ thụ tinh đối với các
nồng độ heparin khác nhau trong môi trường BO-BSA Heparin trong
Tỷ lệ thụ tinh (số trứng có tinh trùng sâm nhập/số môi trường
trứng kiểm tra), % (µl/ml) Bò đực Oo Bò đực atsu Bò đực satu 0 13,0 (3/23) 100,0 (11/11) 54,5 (12/22) 5 100,0 (21/21) 100,0 (14/14) 94,4 (17/18) 10 90,5 (19/21) 100,0 (13/13) 100 (10/10) 20 90,9 (20/22) 100,0 (14/14) 95,2 (20/21) 50 91,3 (21/23) 100,0 (14/14) 94.1 (16/17)
Vì vậy, phát hiện ưu điểm này cùng với những điều kiện cần thiết khác sẽ mang lại
lợi ích kinh tế của công nghệ sản xuất phôi trong ống nghiệm trên động vật chăn nuôi. Bò
đực Atsu cho tinh trùng để IVF có tỷ lệ thụ tinh cao mà không cần hoạt hóa (bảng 8).
Thời gian tiếp xúc giữa tinh trùng và trứng (thời gian ủ) phụ thuộc vào thời gian và
phương thức hoạt hóa, chất lượng trứng khi nuôi chín.v.v…thông thường đạt tỷ lệ thụ tinh
cao khi chất lượng trứng chín cao, phương pháp hoạt hóa tốt hoặc thời gian hoạt hóa dài.
Chẳng hạn, ở tinh dịch bò sau giải đông được rửa và ly tâm với môi trường BO có cafein
và tinh trùng được tách ra và hoạt hóa trong môi trường BO-BSA-heparin thì thời gian ủ
trứng là 6-8 giờ; ở ngựa tinh trùng được pha loãng và ủ trong môi trường TALP-BSA-
calcium ionophore với trứng 12 giờ.v.v…
Kết quả của thụ tinh được nâng lên khi công ghệ tiêm tinh trùng vào tế bào trứng
(intracytoplasmic sperm injection - ICSI) đạt được thành công đáng kể. Phương pháp này
còn được gọi là kĩ thuật vi tiêm (microinjection). Những con vật nuôi ra đời không chỉ ở
bò, dê, cừu mà cả ở người. Trong nhiều trường hợp tinh trùng không có đủ số lượng, chất
lượng để tự xâm nhập vào trứng thì có thể áp dụng kĩ thuật này. Chẳng hạn ở người, để
giải quyết trường hợp vô sinh có nguyên nhân do người chồng, tinh trùng ít và kém hoạt
động, có thể chọn tinh trùng để tiêm vào trứng của người vợ. Ngoài ra, phương pháp ICSI
còn được thực hiện ở trường hợp do tinh trùng ít (dưới 500.000/ml). Những đôi vợ chồng
đã áp dụng kĩ thuật TTTON bình thường từ một đến hai lần nhưng thất bại cũng được áp
dụng phương thức này. Khả năng thụ tinh của ISCI cao hơn thụ TTTON bình thường ở người.
Sau khi thụ tinh, tế bào trứng được chuyển sang môi trường nuôi để hợp tử tiếp tục
phát triển. Môi trường nuôi hiện nay ở nhiều loại động vật có vú là TCM-199 bổ xung
huyết thanh bê và lọc vô trùng bằng màng lọc có kích thước 20-22 µm, trong điều kiện 19
Nhóm 6 Đặng Thị Nga 581021
thích hợp của tủ ấm CO2 v.v… Nhiều thí nghiệm đạt kết quả, phôi phát triển tốt khi tách
tế bào cumulus ra khỏi tế bào trứng trong 20-24 giờ sau thụ tinh và nếu cùng nuôi với tế
bào hạt (granulosa) đến chu kì phân bào thứ 4 là thích hợp cho khả năng phát triển thành
phôi dâu-phôi nang. Tuy nhiên, thời gian nuôi hợp tử phát triển dài hay ngắn tùy thuộc
theo loài và theo yêu cầu kĩ thuật. Chẳng hạn ở trâu, bò, dê, cừu, ngựa đến trạng thái phôi
dâu phôi nang với 32-64 tế bào để đông lạnh hoặc cấy phôi; ở người, phôi có từ 4-8 tế bào
để cấy vào tử cung v.v…
Một số chỉ tiêu đánh giá TTTON như sau:
1. Sự sâm nhập của tinh trùng vào trứng
2. Sự hình thành tiền nhân ở trong trứng
3. Sự phân chia hợp tử thành từ hai đến bốn hoặc tám tế bào
4. Sự hình thành phôi nang
5. Có thể nhiễm sắc Y trong một số phôi biểu hiện thụ tinh đa tinh trùng
6. Có đuôi tinh trùng ở xoang tế bào chất
Trong các chỉ tiêu trên, chỉ tiêu có ý nghĩa hơn cả là sự phân chia tế bào và hình
thành phôi nang, đối với công nghệ sản xuât phôi cũng như công nghệ gen, phôi dâu, phôi
nang sẽ mang lại hiệu quả cao, đem lại đầy đủ ý nghĩa của lợi ích thụ tinh trong ống
nghiệm. Và để đánh giá kết quả chọn vẹn, nhất là cấy phôi để con non ra đời là chỉ tiêu
cao nhất và có sức thuyết phục mạnh mẽ nhất.
Sơ đồ tổng quát quá trình thụ tinh trong ống nghiệm như sau:
SƠ ĐỒ QUY TRÌNH THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM 20
Nhóm 6 Đặng Thị Nga 581021