Tài liệu vi sinh học | Đại học Y Dược Cần Thơ

Thực tập VI SINH
Bài 1: SỬ DỤNG MỘT SỐ DỤNG CỤ CƠ BẢN TRONG PHÒNG XÉT NGHIỆM VI SINH
Kiến thức cần nắm
Đèn cồn: có 2 phần gồm phần ở giữa có màu sáng xanh, nhiệt ộ khoảng 400oC và phần ngoài có màu ỏ,
nhiệt ộ khoảng 1700oC => Dùng ể tiệt khuẩn dụng cụ
Vòng cấy-Kim cấy: làm bằng kim loại Platin hoặc chrome, thường sử dụng vòng cấy 10 micromet, cấy
ịnh lượng thì khoảng 1 micromet, cầm nghiêng 45 ộ ưa vào tâm ngọn lửa èn cồn, tránh vi khuẩn bắn ra
xung quanh => Dùng ể lấy vi khuẩn
Hộp Petri: các môi trường cấy ược cho vào hộp.
Ống nghiệm: nắp ống nghiệm ược cặp ở ngón tay út vào lòng bàn tay, mở ống nghiệp phải nghiêng một
góc 45o, lấy vi khuẩn phải thực hiện gần èn cồn. Kính hiển vi quang học
*Độ chiết xuất: là một ơn vị o lường tốc ộ tương ối của ánh sáng khi nó i xuyên qua một vật chất .
Bài 2: PHƢƠNG PHÁP NHUỘM GRAM
Bác sĩ sẽ chỉ ịnh khi bác sĩ muốn sử dụng thuốc iều trị theo kinh nghiệm của bác sĩ khi chẩn oán cần cho thuốc liền.
Kiến thức cần nắm
Nguyên tắc: chất cồn tẩy ược màu
tím của vi khuẩn gram âm. Thuốc nhuộm: +Tím gentian +Dung dịch lugol +Cồn 95o +Đỏ safranin Thực hiện:
Làm phết => Gentian (10s) => Rửa nước => DD
lugol (20s, giúp VK giữ màu)=> Rửa cồn 95o (5s,
tẩy màu VK gram âm) => Rửa nước => Đỏ
safranin (10s, VK gram âm bắt màu)=> Rửa nước
=> Thấm khô => Quan sát dưới vật kính X100 Ý nghĩa:
+Kết quả chung cuộc sớm +Kết quả gợi ý
+Kết quả tin cậy ể nuôi cấy, phân lập
+Mẫu không cần khảo sát trực tiếp Đọc kết quả : Hình dạng Cầu Trực
Song cầu gram âm hình hạt ậu Màu sắc Gram âm: ỏ Gram dương: tím
Song cầu gram dương hình mũi giáo Cách sắp xếp Đơn Đơn Đôi => Song cầu Đôi Chùm Dây Chuỗi Đám
Song c ầu=> Hình mũi giáo, Gram dương, Xếp đôi LiŒn c
ầu khu ẩn,Gram dương,Xế p th nh chu ỗ i
(Cầu khuẩn, Gram dương, Xếp th nh chøm) + (Trực khuẩn,
Bài 3: PHƢƠNG PHÁP NHUỘM KHÁNG ACID (phƣơng pháp nhuộm Ziehl-Neelsen)
Phương pháp này dành riêng cho một loại trực khuẩn mà ta không thể phân biệt là Gram âm hay Gram
dương => Xét nghiệm thường quy căn bệnh lao (hoặc phong), còn gọi là PP AFB Tr
ự c khu ẩn, Gram âm + Gram dương, Xế p r ả i rÆc
Gram m, X ế p r ải rác “đơn, đôi, đám”)
Kiến thức cần nắm
Mycobateria: trực khuẩn dài, mãnh, phân nhánh hoặc dạng sợi
Vỏ tế bào có 1 lớp dày => 40% lipid => Không ăn màu bất kì thuốc nhuộm nào hết, kháng lại sự xâm nhập
của phẩm nhuộm=> Vỏ lipid sẽ bị giãn nở bởi nhiệt ộ
Ăn màu rất chắc với carbonfuchsin (5-10p) hoặc un nóng và không tẩy màu ược
Bệnh phẩm: mẫu àm (bao gồm: VK thường trú, VK gây bệnh, VK lao, tế bào niêm mạc ường hô hấp=> tế
bào trụ, tế bào niêm mạc miệng => tế bào vẩy, tế bào bạch cầu, nấm) => lao phổi (5ml) Thuốc nhuộm: +Carbonfuchsin ( ỏ hồng) +Xanh methylen (màu nền)
+DD cồn-acid (cồn 70o và acid chlohydric 3%) (tẩy màu)
Thực hiện: phủ carbonfuchsin => hơ lam ến bốc hơi
(10s) => hơ 3 lần => rửa nước ể lớp sáp ông lại =>
Tầy màu bằng dd cồn acid => Rửa nước => Phủ
xanh methylen (1p)=> Rửa => Thấm khô.
Kết quả (Là BS phải ọc ược KQ):
-Trả lời: có hay không AFB
+TH âm tính: chưa chắc chắn bệnh nhân không mắc bệnh
+TH dương tính: chắc chắn bệnh
*Dấu (+) biểu hiện mức ộ lây lan trong cộng ồng.
-Một XN có ộ ặc hiệu cao, khi (+) => Chắc chắn là mắc bệnh.
-Một XN có ộ nhạy thấp, khi (-) => Quá bình thường.
-Độ nhạy là trong 100 người mắc bệnh, bao nhiêu người ược xác ịnh là (+).
-Độ ặc hiệu là trong 100 người không mắc bệnh, bao
nhiêu người ược xác ịnh là (-).
 XN tìm AFB àm có ộ nhạy rất thấp, ộ ặc hiệu rất
cao, có nghĩa là kết quả (-) rất cao, kết quả (+) rất thấp, một khi BN (+) thì chắc chắn bệnh nhân mắc bệnh.
Khi thi: Chỉ có thể quan sát ược ở một quang trường nên không x ược mức ộ (+) => Chỉ cần trả lời có hay
không có trực khuẩn kháng acid.
+Nếu có trực khuẩn dài, mảnh, bắt màu ỏ trên nền xanh thì : có trực khuẩn kháng acid
+Không có: Không tìm thấy trực khuẩn kháng acid
H nh ả nh tr ự c khu ẩ n khÆng acid sau th
ờ i gian b ệ nh nh n s ử d ụ ng
phác đồ điề u tr ị b ệnh => Đứt đoạ n tr ự c khu ẩ n
Bài 4: PHÂN LẬP VI KHUẨN
Khi bệnh nhân mắc căn bệnh nhiễm trùng ến với bác sĩ => Cần nuôi cấy, phân lập vi khuẩn, ịnh danh vi
khuẩn và lập kháng sinh ồ.
Kiến thức cần nắm
Nguyên tắc: Phân lập vi khuẩn là tách rời VK từ một hỗn hợp dựa trên nguyên tắc làm cạn dần mầm cấy
(áp dụng phương pháp cấy vạch ba chiều).
Môi trường: thạch agar NA (trong TH ối với VK khó mọc: bỏ vào hộp thạch 5% máu cừu hoặc ngựa) Phương pháp cấy:
-Chia hột thạch thành 4 phần, khử trùng vòng cấy
-Cấy lần 1: Vùng 1,2; 1/3 ường kính => Đốt vòng cấy, ể nguội -Cấy
lần 2: Vùng 2,3; 1/3 ường kính => Đốt vòng cấy, ể nguội
-Cấy lần 3: vùng 3,4, S còn lại
Bài 5: KHÁNG SINH ĐỒ
Mục ích là tìm ộ nhạy của VK với thuốc kháng sinh Định tính : Kirby-Bauer Định lượng:
-Pha loãng trong ống nghiệm -E-test.
Kiến thức cần nắm Phương pháp Kirby-Bauer Nguyên tắc:
-Đĩa giấy tẩm kháng sinh => Khuếch tán => Vòng vô khuẩn
-Đường kính vòng vô khuẩn phản ánh mức ộ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh. Vật liệu
-Đĩa kháng sinh: ĐK = 6mm. Bảo quản bằng ống chứa chất chống ấm to -4oC, chuẩn bị thử nghiệm lấy ra
ở 2-8oC, chuẩn bị làm ể ở nhiệt ộ phòng từ 1-2h.
*Tiêu chuẩn lựa chọn kháng sinh:
+Đại diện cho nhóm cùng phổ tác dụng +Tùy thuộc vào loại VK
+Tùy thuộc vào vị trí nhiễm khuẩn
+Chính sách sử dụng kháng sinh từng vùng
-Môi trường: MHA; MHA có trộn máu; pH 7,2-7,4; dung dịch chuẩn ộ ục là BaSO42H2O (McFaland 0,5)  108 CFU/ml.
-Mầm cấy:thuần nhất, lấy từ khuẩn lạc sau khi ủ 18-24h (3-4 khúm), 108 CFU/ml -Vi khuẩn kiếm chứng:
+Chưa có biểu hiện kháng thuốc
+Kiếm tra chất lượng môi trường và ĩa kháng sinh
+Thực hiện // với thử nghiệm KSĐ trên VK phân lập từ bệnh nhân
+Các VK thường sử dụng: ATCC.
Thực hiện: Dùng tampon vô khuẩn trải VK ều trên hộp thạch MHA => Đặt các ĩa kháng sinh lên => U ở
35-37 oC từ 18-24h=> Đo ĐK vòng vô khuẩn => So sánh => Kết luận Khi thi Ví d ụ : Erythomycine: Đo ượ c là
32 mm so v ớ i (22-30). Ta c ầ n hi ể u là: +T
ừ 22 tr ở xu ống là ề kháng: Resistant (R) + T ử 22-30 là trung gian: Intermediate (I)
+ T ừ 30 tr ở lên là nh ạ y c ả m: Sensitive (S)
 Vậy trường hợp trên kết luận là nhạy cảm Ý nghĩa: -Kết quả ịnh tính
- Nhạy cảm (chọn lựa KS sử dụng, phụ thuộc vào cơ ịa BN, dược ĐH, dược LH); Đề kháng (không sử
dụng KS); Trung gian (có thể sử dụng ược)
Phương pháp pha loãng liên tiếp (có thể pha loãng trong thạch hoặc ống nghiệm) Nguyên tắc
-Dựa vào sự tương quan giữa nồng ộ kháng sinh và sự tăng trưởng của VK ể xác ịnh ộ nhạy cảm của VK ối với kháng sinh.
-Xác ịnh ược nồng ộ ức chế tối thiểu của kháng sinh ối với VK (MIC: minimal ihibitory concentration) (~
nồng ộ kháng sinh thấp nhất mà VK bị ức chế) Phương pháp E-test: Nguyên tắc:
-Là phương pháp khuếch tán trong thạch cải tiến C
- ho k ế t qu ả ịnh lượ ng (MIC)
Ý nghĩa của phương pháp tìm MIC (Pha loãng liên tiếp + E-test): -Kết quả ịnh lượng -MIC Nhạy cảm
-MIC Nồng ộ KS trong dịch cơ thể => Đề kháng (~ VK òi hỏi nồng ộ lớn hơn mới diệt ược nhưng trong
iều trị thì nồng ộ KS trong cơ thể chỉ ạt ở một mức nhất ịnh).
-Dựa vào MIC ể iều chỉnh liều.
BÀI 6: VI KHUẨN ĐƢỜNG RUỘT (Enterobacteriaceae)
Kiến thức cần nắm
Đặc iểm chung: Họ enterobacteriacea ều phải có tất cả các tính chất này:
-Nhuộm Gram: Trực khuẩn gram âm -Đa số di ộng -Oxidase (-).
(Trừ Shigella, Klebsiella, Yersinia)
-Nhóm E.coli gây tiêu chảy: EPEC, ETEC, EIEC, EHEC, EAEC
-Mọc trên các môi trường nuôi cấy thông thường.
-Shigella: nhóm A (S.dysenteriae), nhóm B (S.flexneri), -Hiếu kỵ khí tùy nghi
nhóm C (S.boydii), nhóm D (S.sonnei) -Lên men Glucose -Khử
-Salmonella: S.typhi, S.cholerae, S.enteritidis Nitrate thành Nitrite
-Yersinia: Y.pestis, Y.enterocolitica, Y.pseudotuberculosis. Môi trường:
-Mtr chuyên chở (Carry-Blair): lưu giữ bệnh phầm, ít dinh dưỡng, VK không tăng sinh (VKĐR=> mt Cary-Blair).
-Mtr phong phú: giàu dinh dưỡng, VK tăng sinh (VD:mtr GN (Gram Negative), Selenite F broth, BHI).
-Mtr phân lập (tách rời): phân lập => Chọn khuẩn lạc
+Không chọn lọc: NA, BA (Tất cả các dạng VK ều có khả năng mọc ược)
+Chọn lọc: Ít: MC, EMB Vừa: SS
Cao: Bismuth salfite agar, Brilliant green agar
+Môi trường phân biệt (nhận biết): MC, EMB, SS, BA.
*Làm sao ể phân biệt ược âu là VK gây bệnh? Đâu là VK thường trú? → Trong môi trường phân lập,
người ta cho thêm ường Latose vào, những VK nào lên men ường latose sẽ là VK thường trú (xuất hiện
khúm màu hồng hoặc màu tím than), những VK nào không lên men ường latose sẽ là VK gây bệnh
-Môi trường khảo sát tính chất sinh vật hóa học: giúp phát hiện ặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn =>
Định danh ược vi khuẩn. (VD: KIA, SIM, Citrate, Ure, MR-VP)
Khi thi (Học 3 môi trường phân lập + 5 môi trường sinh hóa): Nắm ược ý nghĩa, thành phần, kỹ thuật và ọc kết quả.
Môi trường phân lập Thành phần Kỹ thuật Ý nghĩa Đọc kết quả MC (Mac Conkey) -Latose -Cấy vạch ba chiều Khảo sát nhóm -Bao nhiêu loại khúm? *Ít
-Chất chỉ thị màu: ỏ trung tính => -Cấy ịnh lượng VK Gram âm
Khuẩn lạc lên men lactose có màu (pha loãng nhiều -Latose{ ỏ lần) -Muối mật -Crystal violet
=> Ức chế VK gram dương EMB (Eosin -Lactose -Cấy vạch ba chiều -Phân lập VK -Bao nhiêu loại khúm? Methylen Blue)
-Chất chỉ thị màu: Eosin Methylen -Cấy ịnh lượng Gram âm *Ít Blue -Phát hiện VK -Lactose{
=> Khuẩn lạc E.Coli có màu tím E.Coli than, óng ánh kim loại
-Ánh kim loại: , nếu xuất hiện
-Methylene Blue => Ức chế VK
ván mực trên bề mặt khúm thì Gram dương (+), còn không thì (-) SS (Shigella, -Lactose -Cấy vạch ba chiều -Khảo sát -Bao nhiêu loại khúm? Salmonella)
-Chất chỉ thị màu: ỏ trung tính => -Cấy ịnh lượng Shigella và *Vừa
khuẩn lạc lên men latose có màu ỏ Salmonella -Lactose{
-Muối mật=> UC VK Gram dương -Khảo sát VK
-Brilliant Green => ức chế Gram âm Coliform -H2S{
-Ferric Citrate => H2S (FeS: màu en Hình ảnh:
1. E.coli không có tính chất nào trong họ VK ường ruột: A. Trực khuẩn gram âm B. Di ộng
C. Mọc ược trên môi trường MC D. Glucose (+) E. Hiểu kỵ khí tùy nghi
F. Khử nitrite thành nitrate (✓)
2. Salmonella có hình thái cấu trúc nào sau ây
A. Trực khuẩn gram âm (✓)
B. Trực khuẩn gram dương C. Cầu khuẩn gram âm D. Cầu khuẩn gram dương
3. Trong bốn loại VKĐR sau, loại nào có khả năng chuyển ộng? A. Klebsiela B. Shigella C. Yersinia D. Proteus mirabilis (✓)
4. Yersinia có khả năng lên men ường nào sau ây? A. Latose B. Mantose C. Fructose D. Glucose (✓)
5. Môi trường nào sau ây là môi trường chuyên chở của Vi khuẩn ường ruột? A. Cary-Blair (✓) B. Gram Negative C. BHI D. MC
6. Môi trường nào sau ây là môi trường phân lập chọn lọc mức ộ vừa? A. NA B. MC C. SS (✓) D. EMB
7. Môi trường nào sau ây là môi trường phân lập chọn lọc mức ộ cao? A. Brilliant Green Agar (✓) B. Chocolate Agar C. Blood Agar D. Cary-Blair
8. Trong 3 loại môi trường sau, môi trường nào là môi trường phân lập mức ộ vừa? A. MC B. EMB C. SS (✓) D. BA
9. Chỉ thị màu trong môi trường SS là chỉ thị màu nào sau ây? A. Đỏ phenol B. Đỏ trung tính (✓) C. Eosin methylene blue D. Bromothymol blue.
10. Môi trường phân lập nào giúp dễ nhận biết khuẩn lạc E.Coli? A. MC B. BA C. EMB (✓) D. NA
11. Chỉ thị màu trong môi trường EMB là chỉ thị màu nào sau ây? A. Bromothymol blue B. Eosin methylene blue (✓) C. Đỏ phenol D. Đỏ trung tính
12. Trong môi trường EMB, có loại ường nào sau ây? A. Glucose B. Mantose C. Lactose (✓) D. Fructose
13. Môi trường nào sau ây giúp phân lập ược nhóm vi khuẩn gram âm? A. MC (✓) B. EMB (✓) C. SS (✓)
14. Để tạo ược khuẩn lạc Shigella, cần cấy Shigella ở môi trường nào sau ây? A. MC (✓) B. EMB (✓)
C. SS (✓) (Riêng mtr SS thì khi cấy chỉ mọc ược Shigella) D. BA
15. Môi trường MC, EMB, SS, ta sẽ chọn kĩ thuật cấy nào sau ây? A. Cấy vạch ba chiều B. Cấy ịnh lượng C. Cấy trán
 Môi trường không quyết ịnh cách cấy, mẫu bệnh phẩm mới quyết ịnh cách cấy.
16. Môi trường SS ọc bao nhiêu thông tin? A. 1 B. 2 C. 3 (✓) D. 4
Môi trường sinh Thành phần Kỹ thuật Ý nghĩa Đọc kết quả hóa KIA (mtr ặc) -Glucose/ Latose=1/10 Đâm thẳng tới Khảo sát Glucose
-Chỉ thị màu: Đỏ phenol áy ống
( ứng), Lactose -Glucose ( ứng){ -H2S nghiệm=> Cấy (nghiêng), H2S -Gas zig zag, nhiệt ộ ( en), Gas (bọt) 37oC, 18-24h -Lactose(nghiêng){ -H2S{ -Gas{ SIM -Sinh H2S=> Đen Cấy 2/3 thạch -Phát hiện VK H2S
(SulfurhydroIndol- -Di ộng => Đục lan ra ngoài ường -Khảo sát sự -H2S{ Motility) cấy di ộng của VK (mtr bán lỏng)
-Tryptophan => Indol (+Kovac’s -Sinh men => màu ỏ) +A.pyruvic Tryptophase -Indol{ -Di ộng{ Citrate (mtr ặc) -Muối citrate Cấy zig zag Khảo sát VK sử
-Chỉ thị màu: bromothymol blue dụng carbron làm -Citrate{
-Xanh lá cây (pH=6,9) => Xanh nguồn năng dương (pH=7,6) lượng duy nhất
(Chỉ cần là có màu xanh dương=> (+)) Ure (mtr lỏng)
-Chất chỉ thị màu: Đỏ phenol
Lấy khuẩn lạc bỏ Khảo sát VK tiết
Ure=>NH3(+H2O=NH4OH)+CO2 vào môi trường ược men Urease -Ure{
-Đỏ nhạt (pH=6,8) => Đỏ cánh sen (pH=8,1) MR-VP (Methy MR: Khảo sát VK sinh Red-Voges-
(+): VK lên men Glucose mạnh => acid lactic. MR{ Proskauer) (mtr
pH<4,2 ( ỏ), sp tạo thành là acid Vi khuẩn chỉ i một lỏng) lactic VP: trong 2 con ường
Glucose=>Acetymethycarbinol=> (hoặc MR hoặc VP)
Diacetyl (+ -napthol)=>Hợp chất VP{ màu ỏ Hoặc
-KOH dùng ể thử lại bằng cách MR(+), VP(-) Hoặc
trung hòa hợp chất ã ổ methy red MR(-), VP(+). Đọc kết quả:
Choose the correct answer:
1. Môi trường nào sau ây sẽ cấy thẳng xuống áy ống nghiệm? A. KIA (✓) B. SIM C. Citrate D. MR-VP
2. Môi trường nào giúp phát hiện VK sinh H2S? A. KIA (✓) B. SIM (✓) C. Citrate D. MR-VP
3. Môi trường nào giúp khảo sát sự di ộng của VK? A. KIA B. SIM (✓) C. Citrate D. MR-VP
4. Môi trường nào giúp phát hiện VK sử dụng carbon là nguồn năng lượng duy nhất? A. KIA B. SIM C. Citrate (✓) D. MR-VP
5. Chỉ thị màu trong môi trường citrate là: A. Đỏ trung tính