Đề cương môn Dinh dưỡng thực phẩm- Trường Đại học bách khoa - Đại học đà nẵng.

BỘ CÔNG THƯƠNG
ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
BÀI TIỂU LUẬN
MÔN: ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG
CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
ĐỀ TÀI: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE
VÀ ỨNG DỤNG CỦA ENZYME AMYLASE TRONG
SẢN XUẤT MALTODEXTRIN GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà SVTH: Nhóm 7
1. Nguyễn Thị Cẩm Nguyên 2005140359 2. Nguyễn Cẩm Tiên 2005140611 3. Nguyễn Lê Thảo Ngân 2005140325 4. Phan Thị Mai Lưu 2005140296 Thứ 4, tiết 123
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 3/2017 11
Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà MỤC LỤC
MỤC LỤC ........................................................................................................................... 2
LỜI MỞ ĐẦU ...................................................................................................................... 4
NỘI DUNG ĐỀ TÀI ............................................................................................................ 5
Chương 1: Tổng quan về tài liệu ......................................................................................... 5
1.1 Tổng quan về sản phẩm .......................................................................................... 5
1.1.1 Lịch sử nghiên cứu, định nghĩa ....................................................................... 5
1.1.2 Đặc điểm của sản phẩm ................................................................................... 6
1.1.3 Mục đích sử dụng của sản phẩm.................................................................... 11
1.2 Tổng quan về vi sinh vật ...................................................................................... 15
1.2.1. Hình thái – Cấu tạo ........................................................................................ 15
1.2.2. Điều kiện nuôi cấy ......................................................................................... 16
1.2.3. Phân lập và nhân giống .................................................................................. 16
1.3 Tổng quan về công nghệ lên men tạo enzyme amylase ....................................... 18
1.3.1 Phương pháp lên men bề mặt ........................................................................ 18
1.3.2 Phương pháp nuôi cấy chìm (bề sâu) ............................................................ 19
1.4 Tổng quan về nguyên sử dụng: ............................................................................ 19
1.4.1 Nguyên liệu: .................................................................................................. 19
1.4.2 Chất dinh dưỡng: ........................................................................................... 20
Chương 2: Quy trình công nghệ sản xuất enzyme amylase ............................................... 23
2.1 Quy trình thu nhận enzyme .................................................................................. 23 2.2
Quy trình thu nhận enzyme amylase từ nấm mốc Aspergillus oryzae ................ 24
2.3 Thuyết minh quy trình .......................................................................................... 25
2.3.1 Chuẩn bị môi trường ..................................................................................... 25
2.3.2 Hấp thanh trùng, làm nguội .......................................................................... 25
2.3.3 Nuôi cấy ......................................................................................................... 26
2.3.4 Thu nhận chế phẩm enzyme thô ..................................................................... 28
2.3.5 Nghiền............................................................................................................ 28
2.3.6 Trích ly ........................................................................................................... 29 2
Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà
2.3.7 Kết tủa enzyme và ly tâm ............................................................................... 29
2.3.8 Thu nhận enzyme amylase tinh khiết ............................................................. 31
2.4 Các yếu tố ảnh hưởng khi thu nhận enzyme amylase từ nấm mốc Aspergillus
Oryzae ............................................................................................................................ 31
2.5 Ưu – nhược điểm của quy trình ............................................................................ 32
Chương 3: Ứng dụng của enzyme amylase trong sản xuất maltodextrin .......................... 33
1. Tổng quan về maltodextrin ...................................................................................... 33
1.1. Maltodextrin ...................................................................................................... 33
1.2. Ứng dụng của maltodextrin ............................................................................... 33
1.3. Chỉ số DE (dextrose aquivalent) ....................................................................... 34
2. Quy trình sản xuất maltodextrin .............................................................................. 35
2.1. Sản xuất maltodextrin bằng phương pháp lý hóa học ....................................... 35
2.2. Sản xuất maltodextrin bằng phương pháp enzyme ........................................... 35
3. Chỉ tiêu chất lượng maltodextrin .......................................................................... 44
KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ .................................................................................... 46
Kết luận: ......................................................................................................................... 46
Khuyến nghị ................................................................................................................... 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 47 3
Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà
LỜI MỞ ĐẦU
Tinh bột là sản phẩm tự nhiên quan trọng nhất có nhiều ứng dụng trong kỹ thuật
và trong đời sống con người. Nhiều nước trên thế giới sử dụng nguồn tinh bột từ khoai
tây, lúa mì, ngô (sắn) , còn riêng nước ta thì sử dụng gạo và khoai mì là nguồn tinh bột
chủ yếu. Trong chế biến tinh bột và đường, công đoạn quan trọng nhất là thuỷ phân tinh
bột thành các loại đường đơn giản. Sau đó, chủ yếu trên cơ sở đường đơn nhờ quá trình
lên men, người ta sẽ nhận được rất nhiều sản phẩm quan trọng như : rượu cồn, rượu vang,
bia, các loại acid hữu cơ, amino acid…..
Quá trình thuỷ phân tinh tinh bột gồm hai giai đoạn chủ yếu là giai đoạn hồ hoá và
đường hoá. Để thực hiện hai công đoạn nói trên, trong thực tế sản xuất người ta sử dụng
hai cách: thuỷ phân tinh bột bằng acid và bằng enzyme. Để thuỷ phân tinh bột từ lâu
người ta đã sử dụng các acid vô cơ như acid HCl và H2SO4. Nhưng kết quả cho thấy, thuỷ
phân bằng acid rất khó kiểm soát và tạo nhiều sản phẩm không mong muốn, không đáp
ứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩm. Do vậy, việc thay thế và ứng dụng enzyme để thuỷ
phân tinh bột là một kết quả tất yếu của sự phát triển.
Enzyme amylase được tìm ra đã góp phần quan trọng trong nhiều ngành công
nghiệp chế biến thực phẩm. Enzyme amylase có thể tìm thấy trong nhiều nguồn khá nhau
như: động vật, thực vật và vi sinh vật. Amylase ngày càng được thay thế acid trong sản
xuất ở quy mô công nghiệp. Hiện nay, các nhà sản xuất có thể sử dụng amylase ở nhiệt
độ cao mà không bị mất đi hoạt tính…….
Bài báo cáo “Công nghệ sản xuất enzyme amylase và ứng dụng của enzyme
amylase trong sản xuất maltodextrin” sẽ giúp các bạn có cái nhìn tổng quan hơn về
enzyme amylase, quy trình sản xuất cũng như ứng dụng của nó.
Trong quá trình làm bài không tránh khỏi sai sót, mong nhận được sự góp ý của cô
và các bạn để bài báo cáo của nhóm được hoàn thiện hơn. Xin chân thành cảm ơn! 4
Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà
NỘI DUNG ĐỀ TÀI
Chương 1: Tổng quan về tài liệu
1.1 Tổng quan về sản phẩm 1.1.1
Lịch sử nghiên cứu, định nghĩa
Vào đầu thế kỉ XIX, các nhà nghiên cứu đã tách được chất gây ra quá trình lên
men. Năm 1814 Kirchoff, viện sĩ Saint Petercburg đã phát hiện nước chiết của mầm đại
mạch có khả năng chuyển hoá tinh bột thành đường ở nhiệt độ thường. Năm 1833, hai
nhà khoa học người Pháp là Payen và Persor đã chứng minh chất có hoạt động phân giải
tinh bột thành đường có thể tách được ở dạng bột. Thí nghiệm này được tiến hành bằng
cách cho etanol vào dịch chiết của lúa đại mạch nảy mầm thì thấy xuất hiện kết tủa này
chuyển hoá. Danh từ diastase là do Payen và Persor dùng để gọi enzyme lúc bây giờ
Enzyme amylase đã được tìm ra góp phần quan trọng cho nhiều ngành công
nghiệp chế biến thực phẩm. Enzyme amylase có thể tìm thấy ở nhiều nguồn khác nhau
như động vật, thực vật và vi sinh vật. Enzyme amylase được sử dụng nhiều trong sản xuất
là do khả năng chịu nhiệt cao, năng lượng xúc tác thấp, không yêu cầu cao về thiết bị sử
dụng, giảm chi phí cho quá trình tinh sạch đường.
Các enzyme amylase thuộc nhóm enzyme thuỷ phân, xúc tác phân giải liên kết nội
phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước: 5
Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà 1.1.2
Đặc điểm của sản phẩm
a. Phân loại
Có 6 loại enzyme được xếp vào hai nhóm lớn: Endoamylase và Exoamylase.
Enzyme amylase được phân loại theo sơ đồ sau: 6
Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà ➢ Endoamylase α −amylase
Amylase có khả năng phân cắt liên kết 1,4- glucoside
của cơ chất một cách ngẫu nhiên và là enzyme nội
bào. α -amylase không chỉ có khả năng phân huỷ hồ
tinh bột mà còn có khả năng phân huỷ các hạt tinh bột nguyên vẹn.
Enzyme khử nhánh
- Khử trực tiếp
Pullulanase là một trong các enzyme quan trọng
nhất trong chế biến tinh bột. Enzyme này được sử
dụng trên một quy mô lớn trong glucose và các
ngành công nghiệp sirô maltose. Pulluanase là một
lạo enzyme rất mạnh cho sự thoái hoá tinh bột
thành glucose hoặc maltose. Pullulanase thuỷ phân
α −1, 6-glycosidic liên kết của chuỗi phân nhánh
và α −1,4 glycosidic. 7
Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà
- Khử gián tiếp Transglucosylase (oligo-1,6-glucosidase) và
Maylo-1,6-glucoside: Enzyme này thuỷ phân liên
kếtβ−1,6−glucoside trong isomaltose, panose và
các dextrin tới hạn có thể chuyển hoá đường và có thể lên men được. ➢ Exoamylase
- β – amylase
– amylase xúc tác từ sự thuỷ phân các liên β
kết 1,4- glucan trong tinh bột, glucogen và polysaccharide, phân cắt từng nhóm
maltose từ đầu không khử của mạch. Maltose được hình thành do sự xúc tác của β
– amylase có cấu hình β.
- γ−amylase 8
Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà
Còn gọi là glucose amylase. Có khả năng
thuỷ phân liên kết -1,4 lẫn -1,6-glucoside,
ngoài ra còn có khả năng thuỷ phân liên
kết -1,2 và -1,3-glucoside.
Glucose amylase có khả năng thuỷ phân
hoàn toàn tinh bột, glucogen, amylopectin,
dextrin….thành glucose mà không cần có
sự tham gia của các loại enzyme khác.
b. Đặc tính
➢ Đặc tính chung:
- Khả năng dextrin hoá: thuỷ phân tinh bột ➔ dextrin +một ít maltoza. Dextrin có
khả năng hoạt hoá cao, đặc trưng cho tính chất của enzyme này.
- Tính bền nhiệt: Phân tử có 1-6 nguyên tử C, tham gia vào sự hình thành ổn định
cấu trúc bậc 3 của enzyme.
- Tính tan: amylase dễ dàng tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu laongx.
- Các amylase bị kiềm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+ , Ag+ , Hg2+ .
- Cơ chất tác dụng: của enzyme amylase là tinh bột và glycogen.
➢ Đặc tính riêng
α −amylase có những đặc tính rất đặc trung về cơ chế tác động, chuyển hoá tinh bột, khả năng chịu nhiệt:
- Thể hiện hoạt tính trong vùng acid yếu
- α −amylase của nấm mốc có khả năng dextrin hoá cao tạo ra một lượng glucose và maltose.
- Độ bền đồi với tác dụng của acid cũng khác nhau
- Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α −amylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất. 9
Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà
c. Cơ chế tác dụng
α −amylase có khả năng phân cắt liên kết α -1,4-glucoside nằm ở phía trong phần tử cơ
chất (tinh bột hoặc glycogen) một các ngẫu nhiên. Nó không chỉ thuỷ phân hồ tinh bột mà
nó thuỷ phân cả hạt tinh bột nhưng với tốc độ rất chậm. quá trình thuỷ phân tinh bột bởi
enzyme α −amylase là quá trình đa giai đoạn:
Giai đoạn 1 (dextrin hoá): tinh bột α −amylase dextrin phân tử lượng thấp
Chỉ có một số phân tử cơ chssta bị thuỷ phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử
thấp (α −dextrin), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hoá nhanh). 10
Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà
Giai đoạn 2 (giai đoạn đường hoá)
- Dextrin phân tử thấp bị thuỷ phân tetra và trimaltose (không cho màu với iod)
thuỷ phân rất chậm disaccharide và monosaccharide.
- Amylose phân giải nhanh oligosaccharide poliglucose (gồm 6-7 gốc glucose)
bị phân cách mạch polyglucose colagen ngắn maltose maltotriose.
- Tác dụng của enzyme α −amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì
không phân cắt được liên kết α −1,6−glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử . 1.1.3
Mục đích sử dụng của sản phẩm
Hiện nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme các loại đã và đang phát triển mạnh trên
quy mô công nghiệp. Thực tế đã có hàng nghìn chế phẩm enzyme bán trên thị trường thế
giới, các chế phẩm này đã được khai thác và tinh chế có mức độ tinh khiết theo tiêu
chuẩn công nghiệp và ứng dụng. Chế phẩm enzme không chỉ được ứng dụng trong y học
mà còn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực công nghiệp khác nhau, trong nông nghiệp, trong hóa học...
“Ý nghĩa của việc sử dụng enzyme trong các lĩnh vực thực tế không kém so
với ý nghĩa của việc sử dụng năng lượng nguyên tử”.
Theo thời gian, enzyme công nghiệp ngày càng được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực
khác nhau, trong đó những enzyme ứng dụng nhiều nhất là amylase, cellulose, ligase,
amylase,... và một số enzyme đặc biệt khác đã thu được rất nhiều lợi nhuận từ ngành này.
Dưới đây là một vài ứng dụng thực tế: 1.1.3.1
Ứng dụng amylase trong sản xuất bia
Trong công nghiệp sản xuất bia
truyền thống, các nước phương tây chủ
yếu sử dụng enzyme amylase của malt để
thủy phân tinh bột trong malt, sau đó đến
giai đoạn rượu hóa bởi nấm men
Saccharomyces sp. Cơ sở khoa học của 11
Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà
việc sử dụng amylase của malt ở chỗ khi đại mạch chuyển từ trạng thái hạt sang trạng
thái nảy mầm (malt), enzyme amylase sẽ được tổng hợp và khi đó enzyme này sẽ thủy
phân tinh bột có trong hạt tạo ra năng lượng và vật chất cho sự tạo thành mầm. Như vậy
việc đường hóa tinh bột trong hạt nhờ enzyme của chính nó. Khi đó hạt chỉ tổng hợp ra
năng lượng enzyme amylase vừa đủ để phân hủy lượng tinh bột có trong hạt. Như thế cần
rất nhiều mầm đại mạch để sản xuất bia ở quy mô lớn, dẫn đến chi phí cao cho sản xuất và sản phẩm.
Để khắc phục điều này, trong quá trình lên men tạo bia thì nhà sản xuât không sử
dụng hoàn toàn 100% nguyên liệu là malt đại mạch mà có sự pha trộn theo một công thức
nào đó để thay thế malt và còn bổ sung nguồn tinh bột cho quá trình lên men. Lý do là
một phần để tạo hương vị cho bia, màu sắc, độ cồn phù hợp cho người tiêu dùng và một
phần là làm giảm giá thành cho sản phẩm bia nhưng vẫn giữ được đặc trưng cho bia.
Chính vì điều này, các nhà sản xuất bia quan tâm đến việc sử dụng chế phẩm enzyme
amylase cung cấp cho quá trình thủy phân tinh bột. Enzyme này có ý nghĩa rất lớn trong
việc làm bia, giúp sản xuất bia ở qui mô công nghiệp.
Ngoài ra, trong sản xuất bia, người ta còn sử dụng chế phẩm enzyme cellulose có
tác dụng phá vỡ thành tế bào, tạo điều kiện để các thành phần có trong tế bào hạt thoát ra
phía ngoài nhờ đó chất lượng bia được nâng cao hơn. Một loại enzyme khác cũng được
sử dụng khá rộng rãi đó là gluco amylase, enzyme này được sử dụng để loại trừ O 2 có
trong bia, giúp quá trình bảo quản bia kéo dài hơn rất nhiều. 1.1.3.2
Ứng dụng amylase trong sản xuất rượu
Để sản xuất cồn từ nguồn tinh liệu tinh bột, mỗi nước
sử dụng các loại nguyên liệu khác nhau. Ví dụ, ở Mỹ
người ta sử dụng nguyên liệu từ bột ngô để sản xuất cồn,
còn ở Brazin lại sử dụng khoai mì, các nước khác sử
dụng gạo hoặc tấm từ gạo. Quá trình sản xuất cồn trải
quá hai giai đoạn: giai đoạn đường hóa, giai đoạn rượu hóa. 12
Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà
Giai đoạn đường hóa: người ta bắt buộc phải sử dụng enzyme amylase (không thể
sử dụng phương pháp thủy phân tinh bột bằng acid). Người Nhật đã biết sử dụng enzyme
của nấm mốc trong quá trình đường hóa để sản xuất rượu Sake từ cách đây hơn 1700
năm. Người Trung Quốc thì đã sử dụng nhiều loại nấm mốc để đường hóa rượu trong sản
xuất rượu cách đây 4000 năm. Còn người Việt Nam đã biết sản xuất rượu từ gạo hàng ngày năm.
Riêng ở Mỹ, mãi đến thế kỷ XIX khi Takamine người Nhật đưa nấm mốc
Aspergillus sang mới biết sử dụng enzyme này thay amylase của malt để sản xuất cồn.
Chính vì thế mới có phương pháp Micomalt (mầm mốc) trong sản xuất cồn và rượu. Nhờ
sự du nhập từ Nhật mà người Mỹ tiết kiệm được một khối lượng malt khổng lồ trong sản xuất rượu.
Giai đoạn rượu hóa: Nhờ nấm men Saccharomyces cerevisiae, cũng có thể xem
đây là một quá trình áp dụng enzyme. Quá trình rượu hóa là quá trình hết sức phức tạp,
trải qua rất nhiều giai đoạn chuyển hóa từ đường thành cồn nhờ sự tham gia của nhiều
enzyme khác nhau. Điểm khác với enzyme amylase là ở chỗ các enzyme tham gia quá
trình rượu hóa nằm trong tế bào nấm men. Việc điều khiển các quá trình chuyển hóa bởi
enzyme trong tế bào thực chất là quá trình trao đổi chất của nấm men trong môi trường chứa đường. 1.1.3.3
Ứng dụng amylase trong sản xuất bánh mì
Một trong những yêu cầu cơ
bản chính của bánh mì là độ xốp nở.
Độ xốp nở của bánh mì phụ thuộc vào
sự tạo khí CO2 trong quá trình lên men
bột nhào và khả năng giữ khí của bột,
hàm lượng đường, hoạt độ của
amylase, hàm lượng và tính chất của
gluten trong bột cũng như hoạt tính của nấm men. 13
Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà
Trước đây, người ta sử dụng nguồn amylase của malt, nhưng đến những năm đầu
thế kỷ XX, người ta bắt đầu nghiên cứu sử dụng amylase của nấm mốc.
Các chế phẩm enzyme amylase dùng trong công nghiệp sản xuất bánh mì được sản
xuất từ canh trường nấm mốc như Asp.Oryzae, Asp.Awamori hoặc từ vi khuẩn, trong đó
chế phẩm amylase từ nấm mốc được sử dụng phổ biến nhất.
amylase của nấm mốc rất nhạy nhiệt nên dễ bị vô hoạt khi ta nâng nhiệt độ 65 –
800C. Và chịu được môi trường acid tốt nên phù hợp với điều kiện hoạt động của nấm men trong bột nhào.
Nhờ hoạt tính mạnh nên trong thời gian ngắn, amylase của nấm mốc nhanh chóng
tạo đủ lượng đường cần thiết trong khối bột nhào, sau đó thì bị vô hoạt ở nhiệt độ nướng
bánh nên có thể dùng lượng lớn mà không có hiện tượng dextrin hóa khi nướng.
Việc sử dụng chế phẩm enzyme amylase còn cho phép ta dùng bột mì kém phẩm
chất để làm bánh mỳ và có thể giảm bớt được 50% lượng đường thêm vào bánh trong sản xuất bành mì ngọt. 1.1.3.4
Ứng dụng amylase trong sản xuất glucose và các loại mật tinh bột
Đang được ứng dụng có hiệu quả trong công nghiệp sản xuất glucose thực phẩm,
glucose tinh thể, mật maltose và mật glucose...
Phương pháp này không tạo ra các sản phẩm phụ không mong muốn giúp chất
lượng đường tốt hơn. 1.1.3.5
Ứng dụng amylase trong chế biến thực phẩm gia súc
Trong chế biến thức ăn gia súc, thành phần ngũ cốc chiếm một khối lượng rất lớn.
Trong khối lượng này, thành phần tinh bột rất cao. Để tăng hiệu suất sử dụng năng lượng
từ nguồn tinh bột, người ta thường cho thêm enzyme amylase vào. Enzyme amylase sẽ
tham gia phân giải tinh bột tạo thành đường, giúp cho quá trình chuyển hóa tinh bột tốt hơn. 14
Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà
Ngoài ra, enzyme amylase cũng được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi trong sản xuất
đường bột, sản xuất dextrin, maltodextrin, nha glucose, siro, glucose – fructose, sản xuất
tương và nước chấm... ở quy mô công nghiệp.
1.2 Tổng quan về vi sinh vật
Nguồn thu amylase vi sinh vật chủ yếu là từ vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn. Trong
bài này, chúng ta sẽ tìm hiểu về Aspergillus oryzae 1.2.1.
Hình thái – Cấu tạo
Aspergillus gồm hơn 185 loài, trong số này, aspergillus fumigatus là phổ biến nhất,
tiếp theo là Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus clavatus, Aspergillus
glaucus, Aspergillus terreus, Aspergillus oryzae,...
Aspergillus oryzae thuộc: - Giới: Fungi - Ngành: Ascomycota - Lớp: Ascomycetes - Bộ: Plectasales - Họ: Aspergillaceae - Giống: Aspergillus
- Aspergillus oryzae có màu vàng hoa cau, sợi nấm phát triển rất mạnh (chiều ngang
5-7ϻm), có vách ngăn chia sợi nấm thành nhiều tế bào (nấm đa bào), phát triển thành
từng đám gọi là hệ sợi nấm hay khuẩn ty. A.oryzae sinh sản bằng bào tử đính (conidia)
đây là hình thức sinh sản vô tính. Bào tử đính phát triển thành tế bào rất dày, bên trong hệ
sợi nấm gọi là tế bào chân đế. Nó tạo thành sợi cuống dài và kết thức là một cấu trúc
phồng hình củ hành gọi là bọng (túi). 1.2.2.
Điều kiện nuôi cấy 15
Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà
➢ Giống dùng để sản xuất phải thỏa mãn các yếu tố sau:
- Cho năng suất sinh học cao, có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền
- Giống phải có khả năng thích nghi nhanh và phát triển mạnh trong điều kiện sản xuất công nghiệp
- Giống phải là vi sinh vật thuần khiết, có tốc độ sinh sản nhanh.
- Tốc độ trao đổi chất mạnh để tạo nhanh các sản phẩm mong muốn, dễ dàng tách
chiết, tinh sạch. Dễ bảo quản và ổn định
➢ Điều kiện phát triển:
- Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành bào tử: 45%
- Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành enzyme: 55-58%
- Độ ẩm không khí: 85-95% - pH môi trường: 5,5-6,5
- Nhiệt độ nuôi cấy: 27-300C 1.2.3.
Phân lập và nhân giống
Qui trình lấy mẫu: khoai tây cắt lát đem chôn xuống đất.Sau 8 ngày lấy những
miếng khoai tây lên cho vào bao nilon và mang về phòng thí nghiệm.
Tiến hành thí nghiệm: Mẫu khoai tây đã xay nhuyễn cho vào 90ml nước cất vô
trùng và trộn đều mẫu.Lấy pipet hút 10ml từ dung dịch ban đầu sang ống nghiệm khác
chứa 90ml nước cất vô trùng. Tiếp tục pha loãng tới nồng độ 10-3, 10-4.
Hút 0,1 ml mẫu ở các nồng độ pha loãng cho vào môi trường PDA. Dùng que
trang trang đều mẫu trên bề mặt thạch. Mốc sẽ sử dụng nguồn tinh bột làm cơ chất, nên
sẽ xuất hiện những quầng sáng quanh khuẩn lạc. Nhận biết bằng cách bổ sung Iodine vào
trong môi trường trước khi cấy.
Cấy chuyền những mốc đặc trưng vào trong môi trường PDA trong ống thạch
nghiêng với 1% tinh bột cho phép mốc phát triển trong vòng 72h. Nhân giống vi sinh vật
trong bình tam giác: cho10ml nước cất vo trùng vào ống thạch nghiêng có chứa bào tử.
Lắc đều cho bào tử trộn lẫn với môi trường. 16
Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà
Hút 0,1ml dung dịch cho vào bình tam giác chứa môi trường sinh trưởng của nấm KH2PO4 1,4g MgSo4 0,1g NH4NO3 10g FeSo4 0,01g KCl 0,5 Hồ tinh bột 20g pH=6,5
Tiếp tục đem nhân giống cấp 2,3,... Sau khi nhân giống thành công có thể sử dụng
ngay hoặc mang đi bảo quản, dự trữ. Để có hiệu quả cao cần lựa chon các phương pháp bảo quản thích hợp.
Hình 1.2.3.1 Đường cong sinh khối (ο) và hoạt động fructosyl tranferase (●) của
Aspergillus oryzae
Một đơn vị hoạt động fructosyltranferase được định nghĩa là lượng enzyme sản sinh
ra 1 mol FOS (fructooligosaccharides) mỗi phút trong điều kiện thí nghiệm được chọn.
1.3 Tổng quan về công nghệ lên men tạo enzyme amylase: 1.3.1
Phương pháp lên men bề mặt:
Phương pháp nuôi cấy bề mặt trên môi trường là phương pháp nuôi cấy tạo điều
kiện cho VSV phát triển trên môi trường đặc (bán rắn) hoặc lỏng. Thích hợp nuôi cấy nấm mốc, xạ khuẩn.
Môi trường lỏng: Enzyme ngoại bào được tách từ sinh khối và hòa tan trong dịch
môi trường; enzyme nội bào nằm trong sinh khối vi sinh vật. 17
Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà
Môi trường đặc: sử dụng cám, trấu, hạt ngũ cốc làm môi trường, enzyme ngoại
bào sẽ thẩm thấu vào các hạt môi trường, enzyme nội bào nằm trong sinh khối vi sinh vật.
Đối với môi trường rắn: pha khí là pha liên tục trong vùng không gian giữa những
hạt cơ chất. Phần lớn hàm lượng nước hấp thụ vài bên trong hạt cơ chất, tuy nhiên cũng có
thể xuất hiện những giọt nước trong vùng không gian tự do hoặc sẽ hình thành một lớp
nước mỏng trên bề mặt hạt cơ chất rắn.
Hạt cơ chất và pha khí phân bố trong hệ nuôi cấy bề mặt: nuôi cấy nấm sợi (trái) và vi
sinh vật đơn bào (phải)
Đối với kỹ thuật lên men, nếu ta phân loại quá trình lên men theo trạng thái vật lý
của môi trường thì phương pháp nuôi cấy bề mặt là một cách thức thực hiện quá trình lên
men cơ chất rắn không có sự hiên diện của pha lỏng. Trong đó, cơ chất không những đóng
vai trò là nguồn dinh dưỡng mà còn là chất mang cho vi sinh vật.
Nhược điểm: tốn nhiều diện tích, khó cơ giới hóa, tự động hóa.
Ưu điểm: dễ thực hiện, dễ xử lý khi nhiễm vi sinh vật do nhiễm cục bộ. 1.3.2
Phương pháp nuôi cấy chìm (bề sâu): 18
Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà
Phương pháp nuôi cấy chìm thường sử dụng môi trường lỏng thực hiện trong thùng lên
men (fermentor) trong đó lắp đặt các hệ thống điều khiển cánh khuấy, hệ thống cung cấp
oxi, điều chỉnh Ph, nồng độ chất dinh dưỡng...Thích hợp nuôi cấy vi khuẩn và nấm men.
Nhược điểm: khó xử lý khi nhiễm vi sinh vật lạ, phức tạp.
Ưu điểm: dễ dàng cơ giới hóa, tự động hóa, ít chiếm diện tích.
1.4 Tổng quan về nguyên sử dụng: 1.4.1 Nguyên liệu:
Trong thành phần của môi trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng
bình thường của vi sinh vật và tổng hợp enzyme. Các nguyên liệu thường được sử dụng
bao gồm: cám mì, bột hạt ngũ cốc, nước chiết ngô, dịch ép quả, rau, khô dầu, bã rượu, rỉ
đường, nấm, men bia, trấu, lõi ngô.
Thành phần chính của môi trường: C, H, O, N. Ngoài ra các chất vô cơ: Mn, Ca, P,
S, Fe, K và các chất vi lượng khác.
Nguồn cacbon: hiện nay chúng ta có nhiều hợp chất cacbohydrat và các hợp chất
khác là nguồn cacbon thích hợp cho việc sinh trường của nấm mốc sinh ra enzyme
amylase có hoạt lực cao. Đặc biệt, tinh bột là nguồn cacbon của nhiều chủng vi sinh tổng
hợp enzyme amylase. Nó là một nguồn nguyên liệu dễ kiếm và rẻ tiền.
Nguồn nitơ (vô cơ và hữu cơ): Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy sinh tổng hợp
enzyme được nâng cao khi trong môi trường có đồng thời có cả nguồn nito hữu cơ và nito
vô cơ.Trong số các nguồn nito vô cơ thì NH + 4 , 2 4 H PO - là tốt hơn cả.
Muối khoáng rất cần thiết cho hoạt động vi sinh vật. Ion Mg2+ có tác dụng sinh tổng
hợp và ổn định các enzyme có hoạt tính ở nhiệt độ cao. 1.4.2
Chất dinh dưỡng:
Nguồn tinh bột cần cho môi trường có chứa trong rất nhiều nguyên liệu như tinh bột
từ gạo, tinh bột sắn, tinh bột bắp,...Nhưng nếu sản xuất ở quy mô công nghiệp thì ta nên 19
Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà
chọn nguồn nguyên liệu dễ kiếm và rẻ tiền. Một số loại nguyên liệu dễ kiếm và rẻ tiền như: gạo, ngô,...
Thành phần dinh dưỡng của gạo:
(Theo Viện Nghiên cứu dinh dưỡng thuộc Đại học Mahidol, Thái Lan, 1999)
Protein của gạo chiếm khoảng 8 – 9%, chủ yếu là glutelin và glubuline. Ngoài ra
còn có lẫn ít: cozine và prolamin. Lượng protein thoái hóa và biến tính dần trong quá trình bảo quản.
Glucid thì chủ yếu là tinh bột, đường, cellulose và hemicellulose. Trong tinh bột
chủ yếu là amylopectin, có chứa một ít chất khoáng như: P, K, Mg,...Ngoài ra còn một số
vitamin như: B1, B2, B6, PP, C, E...
Thành phần dinh dưỡng của ngô: 20