Kỹ thuật tế bào dòng chảy

KỸ THUẬT TẾ BÀO DÒNG CHẢY
PHÂN TÍCH DẤU ẤN MIỄN DỊCH 1 NGUYÊN LÝ KỸ THUẬT •
Thuốc thử = Kháng thể xác định + Chất huỳnh quang Chất huỳnh quang
• MFC (Multiparameter flow cytometry) Kháng thể
nhận diện mật độ huỳnh quang gắn Kháng nguyên
với KT  xác định KN đặc hiệu trên
TB  Xác định kiểu hình TB  định danh tế bào Tế bào 2 1 2
Kỹ thuật tế bào dòng chảy Nguyên lý thủy lực học tập trung dòng chảy vào trung tâm để trình diện từng tế bào một trước nguồn phát laser 3 3
Kỹ thuật tế bào dòng chảy
Khi tế bào đi qua nguồn sáng, nó sẽ bị ánh sáng chiếu vào và mỗi 4
chất huỳnh quang bị kích thích sẽ phát ra tia phản xạ 2 4
Sơ đồ hệ thống nhận quang FL3 Sensor FL4 FL2 620BP Sensor Sensor 675BP 575BP FL1 Sensor 525BP SS Sensor 645DL Fluorescence Pickup Lens 600DL 550DL Laser Beam 488BK 488DL Flow Cell FS Sensor 5 5 Fluorescences 6 3 6
Sự chuyển đổi tín hiệu analog DOT PLOTs
Mỗi tế bào được ghi nhận như một event,
Tín hiệu huỳnh quang được mã hóa thành tín tử 7 7 FSC & SSC • 2 thông số nội tại
• Liên quan về kích thước (Forward Scatter - FSC)
• Liên quan về mức độ tạo hạt hay độ phức tạp của cấu trúc nội bào (Side Scatter—SSC) Right Angle Light Detector  SSC =Cell Complexity Forward Light Detector Light Source  FSC =Cell Surface Area 8 4 8 FSC & SSC 9 9 10 5 10 Quy tắc đọc biểu đồ 11 11 FSC & SSC 12 6 12
Biểu đồ kết quả phân tích DOT PLOTs Bạch cầu hạt SSC Monocyte NRBC Lymphocyte CD45-PerCP Tế bào blast 13 13
Minh họa KQ của 1 ca bệnh 10 -PE 10 -PE SSC D D C C CD45-PerCP CD20 - FITC CD34 - APC 19 -PE 22 -PE D D C C CD5- FITC TdT - FITC 14 7 14
Minh họa KQ của 1 ca bệnh 15 15
Minh họa KQ của 1 ca bệnh 16 8 16
Ưu điểm của Flow cytometry - Flow: dòng chảy - Cyto = cel : tế bào
- Metry= measurement: đo lường
 Là kỹ thuật phân tích đồng thời nhiều đặc tính của một tế bào đơn
dựa trên phương pháp dòng chảy
- Tốc độ đo trung bình: khoảng 500 – 4000 tế bào/giây
- Khả năng phân tích cùng lúc hàng chục ngàn TB, hàng trăm ngàn TB
- Khảo sát nhiều quần thể TB khác nhau cùng lúc
- Khảo sát nhiều đặc điểm khác nhau của 1 TB cùng lúc. 17 17
Các CD xác định tế bào tạo máu • CD34, CD38*, • CD117 (dòng tủy), Các dấu ấn non • TdT và CD10 (dòng lympho), •
HLA.DR** (dòng hạt và lympho T)
CD19, cyCD22, smCD22, CD20, CD5, HLA.DR, cyCD79a, CD79b, Dòng lympho B
CD138, CD23, CD25, CD103, CD11c
sIg/, IgM, FMC7, CD43, CD10, CD30, CD38 CyCD3, smCD3, Dòng lympho T CD2, CD4, CD5, CD7, CD8, CD1a
CD56, CD57, CD16, CD2, CD4, CD7, CD8 NK cell 18 9 18
Các CD xác định tế bào tạo máu
MPO, CD13, CD33, CD15, CD10, CD11b, Dòng hạt
CD16, CD64, CD65, CD66, smCD22,…
Tương tự dòng hạt và đặc trưng riêng: Dòng mono
CD14, CD36, CD64, CD4, HLA.DR, CD56 CD71, CD235a, CD36 Dòng hồng cầu CD61, CD41, CD42, CD36 Dòng mẫu tiểu cầu 19 19 CD panel 20 10 20 Immunophenotype
Kiểu hình DAMD xác định dòng TB, phân loại dưới nhóm và giai đoạn trưởng thành Lympho B: cyCD79a++
○ precursor B cell: CD19+CD22+CD10++CD34+TdT+CD20 _ CD45dim ○ Hematogones:
CD34TdT±CD10+CD19+CD22+CD20± CD45inter
○ B lymphocyte: CD19+CD22+CD20++ CD45bright
○ Plasmocyte : CD19+CD22_ CD20_ CD45+CD38bright CD138+ 21 21 Immunophenotype DÒNG TẾ BÀO T: cyCD3++ 
CD3dimCD2+CD7+CD5+ : precursor T cell  CD3+CD4+CD8- : T help  CD3+CD8+CD4- : T cytotoxic NK cell:
 (+): CD16, CD56, CD57, CD2, CD7, CD8
 (-): smCD3, cyCD3, CD19, TCR, BCR 22 11 22 Immunophenotype Myeloid cell:
 precursor myeloid cell (myelo/monoblast): CD33+CD13+CD34+CD117+HLA.DR+  promyeloid cell: CD33+CD13+HLA.DR-  Myelocyte: CD33+CD13+CD15+CD11b+  mature granulocyte:  Neutrophile: CD33+CD13+ CD10+CD16+  Basophile: CD33+CD13+ SCClowCD22+CD123+  Eosinophil: CD33+CD13+ SCChigh Monocyte:
CD33+CD13+CD14+CD36+CD64+CD4+HLA.DR+ 23 23 Phân tích kết quả DAMD 24 12 24 Quy trình xử lý 25 25 XỬ LÝ TẾ BÀO
1. CD trên bề mặt TB: Chiếm đa số
○ 50 ul sample + regent / 15’ (phòng tối)
○ DD lysing để phá hủy hồng cầu 2. CD trong TBC hay nhân TB: Một số ít
 TdT, MPO, cyCD3, cyCD79a cyCD22, cyCD33.  Cách nhuộm:
Làm tăng tính thấm bề mặt Tế bào  Kháng thể xuyên màng 26 13 26 XỬ LÝ TẾ BÀO
Bệnh phẩm là HUYỀN PHÙ TB 1. Máu
2. Tủy (Dịch hút tủy xương)
3. Các loại dịch cơ thể (DNT, dịch màng phổi, dịch màng bụng,…) 4. Hạch
5. Khác: Tùy nhu cầu cần chẩn đoán Cách bảo quản
• Chất chống đông: EDTA
• Lưu giữ ở nhiệt độ từ 2-6oC, tối đa 5 ngày
(trừ: hạch và mục đích chẩn đoán plasmocyte) 27 27
Quy trình xử lý mẫu hạch 28 14 28 XỬ LÝ TẾ BÀO
Một số yếu tố ảnh hưởng đến kỹ thuật
-Mẫu thử nên được lưu giữ ở nhiệt độ tốt nhất là 2-6 độ C. Mẫu bị hỏng khi nhiệt độ > 25 hoặc < -20 độ C -Mẫu để quá 5-7 ngày
-Mẫu thử quá ít tế bào
-Mẫu thử nhiều tế bào bị vỡ, tán huyết
-Mẫu thử bị đông, vón cục gât ra sự tắc nghẽn
-Thuốc thử hết hạn sử dụng
-Khi chạy tế bào với tốc độ quá nhanh qua máy, sẽ có nguy cơ bỏ qua dữ liệu đối với những tế bào quan tâm 29 XỬ LÝ TẾ BÀO
Những hạn chế khi phân tích
-Việc giải thích dữ liệu về DAMD đòi hỏi phải luôn có báo cáo lâm sàng và
hình thái tương ứng đi kèm
-Một số thể bệnh không thể phân biệt được chỉ dựa vào DAMD (CML, MDS…)
-Yêu cầu tiên quyết của một mẫu thử xét nghiệm là tes abfo cần khảo sát
phải là tế bào riêng lẻ, di chuyển được trong dung dịch (huyền phù)
-Đối với mô đặc, bước phá vỡ mô đặc có thể đưa đến sự xáo trộn cầu trúc
bề mặt hoặc phá vỡ tế bào 15 30