Phương pháp xác định hàm lượng carotenoid trong rau củ quả | Hóa học môi trường | Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Phương pháp xác định hàm lượng carotenoids
Mục tiêu: Xác định hàm lượng tổng Carotenoid trong rau củ quả bằng phương pháp
quang phổ hấp thụ phân tử UV- VIS và xác định từng phân đoạn Carotenoid bằng phương pháp sắc kí bản mỏng.
Nguyên lý của phương pháp: Chiết các carotenoid ra khỏi mẫu bằng cách sử dụng
axeton và chuyển dung dịch này sang ete dầu mỏ. Xác định tổng hàm lượng carotenoid
bằng đo quang phổ. Cất phân đoạn các carotenoid dùng cột sắc ký nhôm oxit. Tiến hành
xác định từng phân đoạn carotenoid bằng đo quang phổ. Tính tổng hàm lượng carotenoid
và từng phân đoạn theo b-caroten, biểu thị hàm lượng của từng phân đoạn carotenoid
theo phần trăm tổng hàm lượng carotenoid.
Hóa chất, thuốc thử, nguyên vật liệu, thiết bị, dụng cụ + Axeton, (CH3COCH3).
+ Ete dầu mỏ, có dải sôi từ 40 °C đến 60 °C + Natri sulfat (Na2SO4), khan. + Toluen (C6H5CH3). + Máy đo quang phổ UV- VIS
+ Cuvet thủy tinh hoặc cuvet thạch anh + Máy ly tâm + Bộ cô quay chân không
+ Phễu chiết, dung tích 200 ml.
Phương pháp đo phổ hấp thụ quang phổ: Cân 0,1 – 0,5 g mẫu cho vào ống falcon 50
ml, sau đó thêm 15 ml aceton. Voltex để trong bóng tối 2 ngày, sau đố định mức lên 50
ml bằng aceton, 6000 vòng/phút trong 15 phút, thu lấy dịch trong có màu vàng đậm. Pha
loãng dịch rồi đem đo ở độ hấp thụ quang 470, 645 và 662 nm. Ca = 11,75*A662 – 2,35*A645 Cb = 18,61 *A645 – 3,96*A662
Cx = (1.000*A470-2,27*Ca-81,4Cb)/227 X= Cx+c*V*F/m*(100-w)/100
Trong đó: X là hàm lượng carotenoids ( µg/g )
Ca: hàm lượng chlorophyll a (µg/ml)
Cb: hàm lượng chlorophyll b (µg/ml)
Cx+c : hàm lượng carotenoids (µg/ml)
V: Thể tích dịch chiết (ml) F: Hệ số pha loãng m: Khối lượng mẫu (g)
W: độ ẩm nguyên liệu (%)
Xác định từng phân đoạn carotenoid theo phương pháp sắc kí bản mỏng Quy trình chung Chuẩn bị bản mỏng Chuẩn bị pha tĩnh, Chuẩn bị pha động phù hợp bản mỏng Chấm mẫu lên vạch xuất phát Triển khai sắc ký Xử lý kết quả
Cắt bản mỏng ra thành những bản nhỏ có kích thước 2 x 8 cm từ bản mỏng mua trên thi
trường đã được tráng silicagel có kích thước 20 x 29 cm để phân tích nhanh.
Dùng bút chì vót nhọn vạch mức xuất phát cách mép dưới bản mỏng 1,5cm mức tiền
tuyến dung môi cách mép trên bản mỏng 1cm.
Phương pháp chuẩn bị dịch chiết:
Sử dụng aceton chiết với tỷ lệ 3:1, chiết từ 1-3 lần liên tiếp, gom dịch chiết lại và ly tâm
loại bỏ cặn. Loại bỏ aceton bằng cách để bay hơi trong chân không. Phần dịch chiết còn
lại xà phòng hóa bằng KOH 10% trong methanol. Carotenoids nằm ở phần không bị xà
phòng hóa được chuyển vào hỗn hợp dung môi ether petrol/ diethyether. Các loại
carotenoids được tách biệt bằng phương pháp sắc ký bản mỏng trên silicagel trong hệ dung môi  Lựa chọn dung môi
Một số hệ dung môi chạy bản mỏng với dịch đu đủ chín, cà chua chín, cà rốt (dịch chưa tinh khiết) Dung môi hòa tan
Hệ dung môi chạy sắc ký Tỉ lệ mẫu bản mỏng Ete dầu hỏa: 45:1:5 Toluen:acetone Ete dầu hỏa Ete dầu hỏa: 45:5: Toluen:acetone 1 Toluen:acetone 45:5 Ete dầu hỏa: Toluen 45:5 Ete dầu hỏa: Acetone 45:5  Chuẩn bị mao quản
Mao quản có chiều dài 7cm, đường kính 1,5-1,6 mm, mao quả dung để hút dung dịch
chấm lên bản mỏng yêu cầu mao quản phải có đường kính bé hơn, với kích thước này
quá lớn để lấy mẫu đu đủ chạy bản mỏng các vết mẫu sẽ rất to làm cho kết quả không chính xác.
Để có đầu mao quản nhỏ cần phải vuốt nhọn mao quản bằng cách: Hai tay cầm hai đầu
ống, đặt phần giữa ống lên ngọn lửa đèn cồn, vừa hơ vừa xoay tròn đều ống đến khi đoạn
giữa mao quản trở nên mềm dẻo, đưa ống ra khỏi ngọn lửa, dùng hai tay kéo hai đầu ống dang ra hai phía.
Khi đó phần ống mao quản ở giữa trở nên nhỏ và hẹp hơn. Ống mao quản cứng lại, bẻ
ống ra làm đôi ở chỗ đã được kéo nhỏ. Đưa mẫu lên bản mỏng:
Hòa tan hết lượng dịch chất màu của dung dịch mẫu bằng 1 ml ete dầu hỏa. Dùng mao
quản đã vuốt nhọn nhúng nhẹ phần đầu nhọ vào dung dịch mẫu đu đủ chín, lực mao quản
sẽ hút dung dịch đủ đủ chín vào mao quản, khi dung dich lên khoảng 6 mm thì lấy ra.
Cẩn thận nhẹ nhàng chấm phần đầu nhọn có chứa mẫu lên bản mỏng tại vạch xuất phát.
Chạm vào và lấy mao quản ra khỏi bề mặt bản mỏng thật nhanh để dung dịch mẫu chín
thấm vào bản mỏng tạo thành một điểm tròn nhỏ vì nếu chậm lâu điểm này sẽ lan to.
Để khô dung môi ete dầu hỏa ngoài không khí khoảng 5 phút. Lặp lại 3 lần như trên được
một bản mỏng có chấm mẫu dùng để chạy sắc ký.
-Chuẩn bị bình tách sắc ký bản mỏng
Cho dung môi chạy sắc ký bản mỏng vào cốc 250ml, dung môi ete dầu hỏa: toluene:
axeton trộn theo tỉ lệ 45:1:5, sau đó dùng pipet hút 30ml vào cốc, để yên 5-10 phút để bão hòa dung môi trong bình.
Bản mỏng được cầm thẳng đứng và được nhúng vào cốc chứa dung môi trong bình, khi
nhúng phải cẩn thận để hai cạnh của bản mỏng không chạm vào thành cốc, sau đó nhẹ
nhàng để bản mỏng tựa vào thành cốc nghiêng khoảng 1 góc 15 độ. Vị trí vết chấm dịch
mẫu nằm trên cao cách mặt thoáng của dung môi khoảng 0,5cm.
Đậy nắp cốc thật kín bằng parafine để đảm bảo không cho không khí lọt vào, theo dõi
quá trình chạy sắc kí, khi dung môi lên cách tuyến dung môi 1 cm thì lấy bản mỏng ra, để
bay hơi dung môi ngoài không khí 10 phút.
Hiện hình các vết chấm sau khi triển khai
Các vết hiện trên bản mỏng, lấy bản mỏng ra, đậy cốc dung môi lại, dung bút chì đánh
dấu tâm vệt. Xác định Rf.
Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf được
tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi: Rf = Trong
đó : a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, tính bằng cm.
b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm.
Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l.