Báo cáo thí nghiệm Bài 3 - Sắc ký cột | Môn Thí nghiệm hóa hữu cơ - Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh

lOMoAR cPSD| 58797173
TRƯỜNG ĐH SƯ PHẠM KỸ THUẬT TPHCM THÍ NGHIỆM
KHOA CN HOÁ HỌC-THỰC PHẨM HOÁ HỮU CƠ
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ HOÁ HỌC
BÁO CÁO THÍ NGHIỆM BÀI 3 SẮC KÝ CỘT
Ngày thí nghiệm: 18/10/2024 ĐIỂM Lớp: 231282B Nhóm: 01 Tên: Lê Minh Hoàng Lân MSSV: 23128125 Tên: Thái Bửu Uyên MSSV: 23128191 Chữ ký GVHD
Tên: Lê Nguyễn Phương Thảo MSSV: 23128169
A. CHUẨN BỊ BÀI THÍ NGHIỆM
1. Mục tiêu thí nghiệm
• Trình bày ược nguyên tắc chung của sắc ký cột.
• Áp dụng ược kỹ thuật sắc ký cột ể tách và tinh chế các hợp chất hữu cơ
• Sắc ký cột là phương pháp ơn giản ể loại bỏ các nguyên liệu không phản ứng, phân lập
các chất ra khỏi hỗn hợp nhanh chóng.
2. Tính chất vật lý và tính an toàn của các hoá chất Cấu trúc MW mp bp (oC) Tỷ Tính Tên (oC) an toàn hợp (g/mol) trọng chất (g/mL) lOMoAR cPSD| 58797173 n- 86.18 -95 69 0.65 Dễ cháy, dễ bay Hexane 48 hơi, có thể gây buồn ngủ, chóng mặt Acetone 58.04 -95 56 0.79 Hơi và ến 1 chất lỏng dễ -93 cháy, gây kích ứng mắt nghiêm trọng, có thể gây buồn ngủ hoặc chóng mặt Ethyl 88.10 - 77.1 0.89 acetate 5 83. 7 Hơi và chất 6 lỏng dễ cháy, lOMoAR cPSD| 58797173 gây kích ứng mắt nghiêm trọng, có thể gây buồn ngủ hoặc chóng mặt Methanol 32 97. 64.7 0.79 Hơi và 6 chất lỏng rất dễ cháy. Ngộ ộc nếu nuốt phải, tiếp xúc với da hoặc nếu hít phải. Gây tổn thương cho các cơ quan (Mắt, Hệ thần kinh trung ương). lOMoAR cPSD| 58797173 Sodium 142.0 884 1429 2.66 Không sulfate 4 4 phải là chất hoặc hỗn hợp nguy hại Silica gel 60.08 171 khôn Không 0 2230 g xác phải là ịnh chất hoặc hỗn hợp nguy hại
3. Quy trình tiến hành thí nghiệm
a) Liệt kê các bước chính thực hiện sắc ký cột
Giai oạn 1: Chuẩn bị các dụng cụ cần thiết
Giai oạn 2: Chuẩn bị mẫu nạp cột
Giai oạn 3: Chọn hệ dung môi giải ly Giai oạn 4: Nhồi cột
Giai oạn 5: Nạp mẫu vào ầu cột
Giai oạn 6: Giải ly sắc ký cột
Giai oạn 7: Kiểm tra bằng TCL và gộp các phân oạn b)
Tiến trình thí nghiệm sắc ký cột chi tiết lOMoAR cPSD| 58797173
Vẽ sơ ồ quá trình thí nghiệm sắc ký cột (gợi ý: dùng hình ảnh)
Giai oạn 3: Chọn hệ dung môi giải ly Sử dụng 3 hệ dung môi: + Hexan 100%
+ Hexan: Ethyl acetate = 9:1(45mL hexane+5mL ethyl acetate)
+ Hexan:Et hyl acetate = 8:2(20mL hexane+5mL ethyl acetate) lOMoAR cPSD| 58797173 lOMoAR cPSD| 58797173 lOMoAR cPSD| 58797173
B. BÁO CÁO QUÁ TRÌNH THÍ NGHIỆM
1. Mô tả hiện tượng xảy ra trong quá trình thí nghiệm sắc ký cột
Sau khi hoàn tất quá trình nhồi cột và làm cho cột trở nên ổn ịnh bằng cách lặp lại quá trình bơm
và xả dung môi hexane thì ta tiến hành nạp mẫu bằng cách dùng pipet Pasteur hút và ria mẫu
xung quanh ể mẫu chảy từ thành buret xuống. Mục ích là ể cho bề mặt silicagel ở dưới ược ổn ịnh.
Khi tiến hành giải ly bằng hệ hexane 100% thì nhóm em ã gặp vấn ề gãy cột. Nguyên nhân có thể là:
● Lớp silicagel quá khô vì quá trình sấy uổi dung môi trong mẫu của nhóm em diễn ra khá lâu.
● Lực tương tác giữa dung môi và chất hấp phụ lớn nên sinh ra lượng nhiệt lớn, vì khi sờ
vào thành buret thì thấy khá nóng.
● Bề mặt lớp hấp phụ không phẳng, không ều
Nhóm em ã ược chị Diễn hướng dẫn “chữa cháy” bằng cách dùng một lớp bông thấm dung môi
hexane và lau xung quanh thành buret ể giảm nhiệt ộ, và sau ó tiến hành quá trình bơm xả dung
môi hexane liên tục ể làm ổn ịnh cột trở lại.
● Khi bắt ầu giải ly lại với hệ 100% hexane, chất màu vàng xuống trước.
● Khi tiếp tục với hệ 9:1, chất màu xanh lục ậm xuống tiếp theo
● Khi tiếp tục với hệ 8:2 chất màu xanh lục nhạt xuống cuối cùng.
2. Mô tả hiện tượng xảy ra trong quá trình thí nghiệm sắc ký lớp mỏng sản phẩm tách ra từ sắc ký cột -
Khi giải ly với hệ 100% hexane: chất ược giải ly bằng sắc ký cột ở hệ 100% hexane là β–
𝑐𝑎𝑟𝑜𝑡𝑒𝑛e và mẫu ược pha ộng kéo lên, chất ở hệ 9:1 và 8:2 hầu như không dịch chuyển. lOMoAR cPSD| 58797173 -
Khi giải ly với hệ 9:1: chất ược giải ly bằng sắc ký cột ở hệ 100% hexane là β–𝑐𝑎𝑟𝑜𝑡𝑒𝑛e
và mẫu ược pha ộng kéo lên cao hơn, chất ở hệ 9:1 và 8:2 cũng bắt ầu ược kéo lên. lOMoAR cPSD| 58797173 -
Khi giải ly với hệ 8:2: chất ược giải ly bằng sắc ký cột ở hệ 100% hexane là β–𝑐𝑎𝑟𝑜𝑡𝑒𝑛e
và mẫu ược pha ộng kéo lên cao nhất, chất ở hệ 9:1 và 8:2 cũng ược kéo lên cao hơn.
3. Kết quả sắc ký cột
a) Chất màu vàng - Màu sắc: vàng ậm - Rf :
● Hệ 1: Hexan 100%: Rf = 0,43
● Hệ 2: Hexan: Ethyl acetate (9:1): Rf = 0,95
● Hệ 3: Hexan: Ethyl acetate (8:2): Rf = 1 lOMoAR cPSD| 58797173
Ảnh kết quả thu ược sau khi giải ly hệ 100% hexane
b) Chất màu xanh - Màu sắc: Xanh vàng nhạt - Rf:
● Hệ 1: Hexan 100%: Rf = 0
● Hệ 2: Hexan: Ethyl acetate (9:1): Rf = 0,27
● Hệ 3: Hexan: Ethyl acetate (8:2): Rf = 0,64
Ảnh kết quả thu ược sau khi giải ly hệ 9:1 - Màu sắc: Xanh nhạt - Rf:
● Hệ 1: Hexan 100%: Rf = 0 lOMoAR cPSD| 58797173
● Hệ 2: Hexan: Ethyl acetate (9:1): Rf = 0,22 ● Hệ 3: Hexan: Ethyl acetate (8:2): Rf = 0,5
Ảnh kết quả thu ược sau khi giải ly hệ 8:2
4. Kết quả sắc ký lớp mỏng trên sản phẩm thu ược
Dán hình TLC của các mẫu: dịch chiết lá mồng tơi, chất màu vàng, chất màu xanh
5. Nhận xét và giải thích -
Khi giải ly hệ 100% hexane, chất màu vàng xuống trước là β–𝑐𝑎𝑟𝑜𝑡𝑒𝑛e. Đây là một chất
không phân cực nên sẽ tạo liên kết với dung môi hexane không phân cực và i theo pha ộng xuống trước. -
Khi giải ly hệ 9:1, chất màu xanh lục ậm xuống tiếp theo là do dùng hệ dung môi phân
cực, Chlorophyll là một chất phân cực vì cấu tạo phân tử có nhóm OH, nên sẽ tạo liên kết với
pha ộng và i xuống theo pha ộng. Lọ 2 có màu xanh lục ậm có thể là vì lọ 1 tách xuống quá
nhanh( do cấu trúc silica gel lỏng lẻo nên không tách hoàn toàn ược cái β–𝑐𝑎𝑟𝑜𝑡𝑒𝑛e, nên còn sót
lại một phần trên cột, vì thế khi giải ly hệ 9:1, phần còn lại sẽ i xuống theo Chlorophyll nên có màu xanh lục ậm. lOMoAR cPSD| 58797173 -
Khi giải ly hệ 8:2, lúc này β–𝑐𝑎𝑟𝑜𝑡𝑒𝑛e ã ược tách ra hết nên chỉ còn lại Chlorophyll có màu xanh lục nhạt.
C. TRẢ LỜI CÂU HỎI
Câu 1: Hãy trình bày nguyên tắc chung của sắc ký cột
Trong sắc ký lỏng, pha tĩnh là chất hấp phụ rắn ược nhồi vào cột. Một dung môi giải ly ược sử
dụng như pha ộng. Khi dung môi giải ly xuống cột, sự phân tách xảy ra bởi nhiều trạng thái cân
bằng của các hợp chất giữa các pha tĩnh và pha ộng. Sự tương quan về ộ phân cực của hai pha
này xác ịnh thứ tự các hợp chất trong ra khỏi cột quá trình giải ly. Với một chất hấp phụ phân
cực như silica gel thì hợp chất kém phân cực ược giải ly ra khỏi cột trước tiên sau ó ến chất phân cực hơn.
Câu 2: Pha tĩnh trong kỹ thuật sắc ký cột là chất gì? Đặc tính kỹ thuật của pha tĩnh dùng
trong sắc ký cột có gì khác so với kỹ thuật sắc ký lớp mỏng?
- Pha tĩnh trong kỹ thuật sắc ký cột là Silica gel.
- Đặc tính kỹ thuật của pha tĩnh dùng trong sắc kỹ cột khác so với kỹ thuật sắc ký lớp mỏng là:
• + Trong kỹ thuật sắc ký lớp mỏng: pha tĩnh thường là một lớp mỏng vật liệu hấp phụ, chẳng
• hạn như silica gel hoặc alumina, ược phủ trên một giá ỡ phẳng.
• + Trong sắc ký cột: Pha tĩnh là chất hấp phụ silica gel rắn ược nhồi vào cột.
Câu 3: Trong bài thí nghiệm này, vì sao chọn n-hexane làm dung môi giải ly ầu tiên cho sắc ký cột?
Vì silica gel là chất hấp thụ, còn 100%hexane lại là chất không phân cực nên nó sẽ ẩy các chất
không phân cực ra trước ể có thể lọc. Nếu dùng dung môi giải ly phân cực mạnh chúng sẽ hòa
tan phần lớn các chất phân tích và không tương tác với pha tĩnh trong cột. Điều này dẫn ến việc
các chất phân tích không ược phân tách và sắc ký không hiệu quả.
Câu 4: Trong quá trình sắc ký cột với dịch chiết lá mồng tơi, vì sao vạch vàng của β-
corotene tách và ra khỏi cột khi giải ly với 100% hexane?
Vì hexane và β-carotene ều là chất không phân cực, và do β-carotene có ái lực mạnh với dung
môi 100% hexane nên sẽ ược giải ly ra trước.
Câu 5: Cũng trong thí nghiệm sắc ký cột với dịch chiết lá mồng tơi, sau khi tách loại β-
carotene ra khỏi cột, hãy ề xuất dung môi (hoặc hệ dung môi) ể có thể tách chlorophyll ra
khỏi sắc ký cột lOMoAR cPSD| 58797173
Dùng dung môi kém phân cực như 100% hexane chỉ thu ược sản phẩm β-Carotene nên ể cô
lập Chlorophyll bằng sắc ký cột ta cần tăng ộ phân cực của dung môi. Đề nghị dung môi
hexane và acetone (8:2 hoặc 7:3).
Câu 6: Để chuẩn bị cho quá trình sắc ký cột, cần iều chế dịch chiết acetone chứa β-
carotene và chlorophyll từ lá mồng tơi. Tại sao phải uổi hết acetone rồi thêm một ít n-
hexane ể tạo dạng sệt rồi mới ưa vào ầu cột?
Vì chất dẫn sử dụng ban ầu là 100% hexane, acetone phân cực hơn hexane. Silica gel (pha
tĩnh) sẽ tương tác và giữ lại các chất phân cực. Đuổi hết acetone và thêm một ít hexane nhằm
mục ích ồng nhất với chất dẫn. Nếu không uổi acetone thì khi mở van toàn bộ các chất sẽ
chảy ra ngoài hết vì ộ phân cực của acetone.
Câu 7: Hãy cho biết nguyên nhân cột bị “gãy” trong quá trình giải ly và ề xuất cách
khắc phục. Nguyên nhân:
+ Một hỗn hợp gồm hai dung môi thường ược sử dụng ể triển khai sắc ký cột. Nếu việc thay ổi
dung môi ược thực hiện quá ột ngột, có thể tạo ra sự toả nhiệt do thay ổi tương tác giữa dung môi
và chất hấp phụ gây hiện tượng nứt cột hấp phụ.
+ Bề mặt lớp hấp phụ không phẳng, không ều. + Lắp cột không thẳng
+ Xuất hiện bọt khí (có thể từ bông gòn, từ cột). Khắc phục:
+ Để tránh hiện tượng này khi thay ổi dung môi lần lượt pha dung môi phân cực vào dung môi
kém phân cực với các nồng ộ lần lượt là 1%, 2%, 5%, 10%, 25%, 50% và 100%
+ Sử dụng bông gòn hoặc cát mịn ể iều chỉnh cho bề mặt lớp hấp phụ ều và bằng phẳng.
+ Dùng cây nhỏ âm nhẹ vào bông gòn, lại hết khí trong cột.
+ Trong trường hợp gãy cột ít sử dụng bông gòn bao quanh cột và sử dụng dung môi tưới lên
bông gòn làm giảm nhiệt ộ cột, ợi trong 10 phút sẽ giảm hiện tượng gãy cột.
Câu 8: Sau khi chất hấp phụ ược nạp vào cột sắc ký lỏng, iều quan trọng là mức dung môi
không ược hạ thấp xuống dưới bề mặt của chất hấp phụ. Hãy cho biết lý do. Có thể làm bọt
khí xuất hiện và khi ổ them dung môi vào lúc ó có thể làm bề mặt chất hấp phụ xáo trộn gây sai
lệch kết quả và có thể làm gãy cột.
Câu 9: Những sự cố nào có thể xảy ra trong quá trình nạp cột sắc ký lỏng?
Trong quá trình nạp cột sắc ký lỏng, có thể xảy ra một số sự cố như:
Cột bị nghẹt: Cột bị nghẹt do các tạp chất trong mẫu hoặc các chất khác trong dung
môi. Điều này có thể dẫn ến giảm hiệu suất phân tích và thời gian chạy kéo dài. Sai lOMoAR cPSD| 58797173
lệch trong lượng mẫu: Nếu lượng mẫu quá ít hoặc quá nhiều, sẽ ảnh hưởng ến hiệu suất phân tích.
Cột bị vỡ: Cột sắc ký lỏng có thể bị vỡ do áp suất cao hoặc do các tạp chất trong dung môi.
Điều này có thể dẫn ến giảm hiệu suất phân tích và thời gian chạy kéo dài.
Ngoài ra, còn nhiều sự cố khác có thể xảy ra trong quá trình nạp cột sắc ký lỏng.
Câu 10: Nạp mẫu là hỗn hợp các hợp chất dưới ây vào cột silica gel và giải ly. Hãy sắp xếp
thứ tự các chất ra khỏi cột silica gel:
Tert- butylcyclohexane; 1,3- dichlorobenzene; 2- octanol; benzoic acid.
Câu 11: Tại sao các cột silica gel với kích thước hạt nhỏ hơn tạo ra sự phân tách theo thời
gian hiệu quả hơn?
Các cột silica gel với kích thước hạt nhỏ hơn tạo ra sự phân tách theo thời gian hiệu quả hơn
vì chúng có diện tích bề mặt lớn hơn và khả năng tương tác với mẫu tốt hơn. Khi kích thước
hạt nhỏ hơn, cột có thể ạt ược ộ phân giải cao hơn và thời gian chạy ngắn hơn.