4 trang 6 lượt tải

Báo cáo thí nghiệm phương pháp phân tích Điện di biến tính SDS trên Polyacrylamid môn Công nghệ sinh học | Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

Điện di các hợp chất cao phân tử (protein, enzym, axit nucleic...) được thực hiện trên một chất mang là khối gel xốp có vai trò như một lưới lọc phân tử. Tài liệu được sưu tầm gồm 4 trang, giúp các bạn ôn luyện và phục vụ cho việc học tập, đạt kết quả tốt. Mời các bạn đón xem!

Môn: Công nghệ sinh học ( BHA) 10 tài liệu

Trường: Đại học Bách Khoa Hà Nội 2.9 K tài liệu

Tác giả:

My Lữ

7 giờ trước

Danh sách Quiz

Họ và tên : Trần Bích Ngọc

MSSV : 20211359

Mã lớp : 739290

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC.

Bi 3.ĐIN DI BIN TNH SDS TRN POLYACRYLAMID (SDS-PAGE –

Sodium Dodecyl Sulfate – PolyAcrylamide Gel

Electrophoresis)

I. C s l thuyt.

L qu trnh dch chuyn ca cc phn t ch đin trong đin trng. Vn tc vn chuyn ca

phn t ph thuc vo đin ch, kch thc v khi lng phn t .

V = EZ/ f Trong đó :

V = Tc đ vn chuyn phn t (cm s

–1

)

E = Cng đ đin trng (volts cm

–1

)

Z = đin ch ca phn t.

f = h s ph thuc vo khi lng v hnh dng ca phn t dch chuyn đ nht môi

trng.

Tc đ vn chuyn phn t trn mt đn v đin trng (cm

vol

-1

=V/E=Z/f

-Đin di cc hp cht cao phn t (protein, enzym, axit nucleic...) đc thc hin trn mt cht

mang l khi gel xpcó vai tr nh mt li lc phn t.

-Cc gel thng đc s dng trong đin di l polyacrylamit, agarose.

-Khi có mt ß-mercaptoethanol đ kh cc cu disulfua (-S-S-) v SDS cc phn t protein s b

bin nh. Chui polipept đ b dui ra s đc ph kn bi SDS – cht ty ra mang đin ch

m gn vo phn ln cc protein to ra mt polyanion có mt đ đin ch trn 1 đn v chiu

di gn nh không đi v không ph thuc vo trnh t chui pept. Di tc dng ca đin

trng protein s dch chuyn trn gel acrylamit v pha đin cc dng. Do t l đin ch/khi

lng tng đng nhau, s phn tch protein đ bin nh bi SDS ch da trn khi lng

phn t m ko ph thuc đin ch. Do mt li ca gel, cc phn t protein có KTPT ln di

chuyn chm hn cc phn t protein có KTPT nh v do vy có th tch ra trn bn đin di.

II.ng dng.

-Xc đnh phn t lng ca phn t protein -Xc đnh mc

đ nh sch protein.

-Xc đnh % protein quan tm có trong hn hp protein.

III. CHUN B HA CHT Dung dch Acrylamide

30%

60g acrylamide

1.6g bisacrylamide

Thm nc kh ion chnh đn 200ml

Dung dch đc bo qun trong l mu ti

Đm Tris 1.5M, pH 8.8

36.3 g tris - baz thm 150 ml nc kh ion, chnh v pH 8.8 bng HCL pha long 2 ln. Sau đó

đnh mc đn 200ml.

Đm đc bo qun  4

C, s dng 3 thng

Tris 0.5M, pH 6.8

3 g Tris – baz, thm 40ml nc kh iôn, dng HCL pha long 2 ln chnh v pH 6.8. Sau đó đnh

mc đn 50ml

Đm đc bo qun  4

C, s dng 3 thng

10% SDS

10 g SDS, thm nc kh iôn đn 100ml. Bo qun nhit đ phng, 6 thng.

10% APS (Ammonium persulfate)

0.1 g APS thm 1 ml nc kh iôn, ha tan v s dng luôn (bo qun trong t lnh dng đc

vi tun).

Đm mu (5X = 1đm + 4 mu) Pha 16ml đm

mu:

6.8 ml nc ct

2 ml 0.5M tris 6.8

3.2 ml glycerol

1.6 ml 20% SDS

0.8 ml β-mercaptoethanol (yu t quan trng trong bin nh protein, do vy ch pha vi mt

lng nh đm mu v b sung β-mercaptoethanol ri dng luôn trong tun)

1.6 ml Bromophenol blue (b sung lng nh sao cho dung dch nhum mu m đm l đc.

Không cn cn chnh xc) bo qun  – 20

Đm chy (khong pH 8.3)

3.03 g Tris

14,4 g Glicine

1g SDS

Đnh mc đn 1lit, ct nhit đ phng trong vng 2thng

Nhum mu

0.5 g Coomasive brilliant blue R250 (cho vo l ti)

800 ml methanol (ha tan coomasive) sau đó b sung p

140 ml acec acid

Dng ng đong b sung đn 2 lt bng nc ct. Ct  nhit đ phng,

6thng

Tymu:

400ml methanol

70 ml acid acec

đnh mc đn 1 lt bng nc ct

IV.CC BC TIN HNH

1. Lp bn knh đin di.

2. Kim tra đ kht.

3. Chun b gel tch 12% acrylamit.

2ml acrylamide 30% 1.3ml Tris (pH 8.8) 1.6ml nc kh ion 50 μl SDS 10%

50 μl APS 10%

2 μl Temed

Đo trn nh nhng v tra vo bn gel (trnh to bt), ph 1 lp ethanol v đi 30 pht cho

đông

4. Chun b mu protein , pha theo t l 1đm+4 mu (theo th ch), đun 95

C trong 5

pht

5. Chun b gel cô 5%

330 μl acrylamide 30% 250 μl Tris (pH 6.8) 1.4ml H

20 μl SDS 10%

20 μl APS 10%

2 μl Temed

Đo trn nh nhng v tra vo bn gel, đa lc vo đ to ging, đi 15 pht cho đông v

ly lc ra.

6.Tra mu v đin di. Nh mt lng 16 - 20μl mu/ging gel, vi protein chun 5 - 10μl/ ging,

chy vi cng đ 1 – 1.5mA/ging. Chy bn gel cho đn khi vch mu xanh chy đn cui bn

7.Tho bn gel ra

8.Tin hnh nhum mu vi dung dch nhum qua đm,

9.Ty mu gel nhum đn khi nn bn gel sng ln, lm khô bn gel đ chp nh v lu gi mu.

V.Kết quả điện di.

Bản điện di lên khá đúng so với mẫu Marker chuẩn, kích thước protein lớn nhất vào khoảng 63

kDa, và nhỏ nhất khoảng 25 kDa. Giếng kiểm chứng âm có hiện vạch, có thể trong quá trình

thao tác xảy ra sai sót khiến hoá chất bị nhiễm, hoặc mẫu kiểm chứng bị nhiễm từ lân cận.

Bấm Tải xuống để xem toàn bộ.

Preview text:

Họ và tên : Trần Bích Ngọc MSSV : 20211359 Mã lớp : 739290
BÁO CÁO THÍ NGHIỆM PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC.
Bài 3.ĐIỆN DI BIẾN TÍNH SDS TRÊN POLYACRYLAMID (SDS-PAGE –
Sodium Dodecyl Sulfate – PolyAcrylamide Gel
Electrophoresis)
I. Cơ sở lý thuyết.
Là quá trình dịch chuyển của các phân tử tích điện trong điện trường. Vận tốc vận chuyển của
phân tử phụ thuộc vào điện tích, kích thước và khối lượng phân tử . V = EZ/ f Trong đó :
V = Tốc độ vận chuyển phân tử (cm s –1)
E = Cường độ điện trường (volts cm–1)
Z = điện tích của phân tử.
f = hệ số phụ thuộc vào khối lượng và hình dạng của phân tử dịch chuyển độ nhớt môi trường.
Tốc độ vận chuyển phân tử trên một đơn vị điện trường (cm2 vol-1 s-1). =V/E=Z/f
-Điện di các hợp chất cao phân tử (protein, enzym, axit nucleic...) được thực hiện trên một chất
mang là khối gel xốpcó vai trò như một lưới lọc phân tử.
-Các gel thường được sử dụng trong điện di là polyacrylamit, agarose.
-Khi có mặt ß-mercaptoethanol để khử các cầu disulfua (-S-S-) và SDS các phân tử protein sẽ bị
biến tính. Chuỗi polipeptit đã bị duỗi ra sẽ được phủ kín bởi SDS – chất tẩy rửa mang điên tích
âm gắn vào phần lớn các protein tạo ra một polyanion có mật độ điện tích trên 1 đơn vị chiều
dài gần như không đổi và không phụ thuộc vào trình tự chuối peptit. Dưới tác dụng của điện
trường protein sẽ dịch chuyển trên gel acrylamit về phía điện cực dương. Do tỉ lệ điện tích/khối
lượng tương đương nhau, sự phân tách protein đã biến tính bởi SDS chỉ dựa trên khối lượng
phân tử mà ko phụ thuộc điện tích. Do mắt lưới của gel, các phân tử protein có KTPT lớn di
chuyển chậm hơn các phân tử protein có KTPT nhỏ và do vậy có thể tách ra trên bản điện di.
II.Ứng dụng.
-Xác định phân tử lượng của phân tử protein -Xác định mức độ tinh sạch protein.
-Xác định % protein quan tâm có trong hỗn hợp protein.
III. CHUẨN BỊ HÓA CHẤT Dung dịch Acrylamide 30% 60g acrylamide 1.6g bisacrylamide
Thêm nước khử ion chỉnh đến 200ml
Dung dịch được bảo quản trong lọ màu tối Đệm Tris 1.5M, pH 8.8
36.3 g tris - bazơ thêm 150 ml nước khử ion, chỉnh về pH 8.8 bằng HCL pha loãng 2 lần. Sau đó định mức đến 200ml.
Đệm được bảo quản ở 40C, sử dụng 3 tháng Tris 0.5M, pH 6.8
3 g Tris – bazơ, thêm 40ml nước khử iôn, dùng HCL pha loãng 2 lần chỉnh về pH 6.8. Sau đó định mức đến 50ml
Đệm được bảo quản ở 40C, sử dụng 3 tháng 10% SDS
10 g SDS, thêm nước khử iôn đến 100ml. Bảo quản nhiệt độ phòng, 6 tháng.
10% APS (Ammonium persulfate)
0.1 g APS thêm 1 ml nước khử iôn, hòa tan và sử dụng luôn (bảo quản trong tủ lạnh dùng được vài tuần).
Đệm mẫu (5X = 1đệm + 4 mẫu) Pha 16ml đệm mẫu: 6.8 ml nước cất 2 ml 0.5M tris 6.8 3.2 ml glycerol 1.6 ml 20% SDS
0.8 ml β-mercaptoethanol (yếu tố quan trọng trong biến tính protein, do vậy chỉ pha với một
lượng nhỏ đệm mẫu và bổ sung β-mercaptoethanol rồi dùng luôn trong tuần)
1.6 ml Bromophenol blue (bổ sung lượng nhỏ sao cho dung dịch nhuộm màu tím đậm là được.
Không cần cân chính xác) bảo quản ở – 200C
Đệm chạy (khoảng pH 8.3) 3.03 g Tris 14,4 g Glicine 1g SDS
Định mức đến 1lit, cất nhiệt độ phòng trong vòng 2tháng Nhuộm màu
0.5 g Coomasive brilliant blue R250 (cho vào lọ tối)
800 ml methanol (hòa tan coomasive) sau đó bổ sung tiếp 140 ml acetic acid
Dùng ống đong bổ sung đến 2 lít bằng nước cất. Cất ở nhiệt độ phòng, 6tháng Tẩymàu: 400ml methanol 70 ml acid acetic
định mức đến 1 lít bằng nước cất
IV.CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
1. Lắp bản kính điện di. 2. Kiểm tra độ khít.
3. Chuẩn bị gel tách 12% acrylamit.
2ml acrylamide 30% 1.3ml Tris (pH 8.8) 1.6ml nước khử ion 50 μl SDS 10% 50 μl APS 10% 2 μl Temed
Đảo trộn nhẹ nhàng và tra vào bản gel (tránh tạo bọt), phủ 1 lớp ethanol và đợi 30 phút cho đông
4. Chuẩn bị mẫu protein , pha theo tỉ lệ 1đệm+4 mẫu (theo thể tích), đunở 95oC trong 5 phút 5. Chuẩn bị gel cô 5%
330 μl acrylamide 30% 250 μl Tris (pH 6.8) 1.4ml H2O 20 μl SDS 10% 20 μl APS 10% 2 μl Temed
Đảo trộn nhẹ nhàng và tra vào bản gel, đưa lược vào để tạo giếng, đợi 15 phút cho đông và lấy lược ra.
6.Tra mẫu và điện di. Nhỏ một lượng 16 - 20μl mẫu/giếng gel, với protein chuẩn 5 - 10μl/ giếng,
chạy với cường độ 1 – 1.5mA/giếng. Chạy bản gel cho đến khi vạch màu xanh chạy đến cuối bản 7.Tháo bản gel ra
8.Tiến hành nhuộm màu với dung dịch nhuộm qua đêm,
9.Tẩy màu gel nhuộm đến khi nền bản gel sáng lên, làm khô bản gel để chụp ảnh và lưu giữ mẫu.
V.Kết quả điện di.
Bản điện di lên khá đúng so với mẫu Marker chuẩn, kích thước protein lớn nhất vào khoảng 63
kDa, và nhỏ nhất khoảng 25 kDa. Giếng kiểm chứng âm có hiện vạch, có thể trong quá trình
thao tác xảy ra sai sót khiến hoá chất bị nhiễm, hoặc mẫu kiểm chứng bị nhiễm từ lân cận.

Báo cáo thí nghiệm phương pháp phân tích Điện di biến tính SDS trên Polyacrylamid môn Công nghệ sinh học | Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

Tài liệu liên quan:

Bài giảng Kỹ thuật đo lường và điều khiển tự động môn Công nghệ sinh học | Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

Câu hỏi ôn tập Kỹ thuật hấp phụ và cô đặc môn Công nghệ sinh học | Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

Khái niệm và phân tách hệ không đồng nhất môn Công nghệ sinh học | Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

Hiệu suất của quá trình lên men theo mẻ và liên tục môn Công nghệ sinh học | Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội