ĐỀ CƯƠNG ÔN THI SINH HỌC DI TRUYỀN môn Di truyền y hoc | Trường Đại Học Y Dược Thái Bình

lOMoAR cPSD| 61301459
ĐỀ CƯƠNG ÔN THI SINH HỌC DI TRUYỀN ( NĂM I)
BÀI 1 : CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN HỌC NGƯỜI I)
PHƯƠNG PHÁP LẬP VÀ PHÂN TÍCH GIA HỆ 1) Khái Niệm về gia hệ
- Phương pháp lập và phân tích gia hệ là phương pháp nghiên cứu sự
biểu hiện của một tính trạng, của một bệnh, tật nào đó qua các thế
hệ liên tiếp của một gia đình hay dòng họ , qua đó xác định được quy
luật di truyền của tính trạng hoặc bệnh tật và tỷ lệ biểu hiện của
bệnh ,tật, tính trạng ở thế hệ sau - phương pháp gia hệ gồm :
+ theo dõi biểu hiện qua 1 số thế hệ ( ít nhất 3 thế hệ )
+ dùng ký hiệu quy ước quốc tế
+ phân tích và đánh giá đặc điểm di truyền của tính trạng
+ ứng dụng kết quả-> tư vấn di truyền và các vấn đề khác
2) các ký hiệu 3) ứng dụng
- đối với bệnh, tật ,tính trạng chưa rõ quy luật di truyền :
+ xác định bệnh, tật, tính trạng có di truyền hay không
+ di truyền theo quy luật nào
- đối với bệnh , tật , tính trạng đã rõ quy luật di truyền: +xác định kiểu gen + xác suất mắc bệnh
+cung cấp thông tin tư vấn di truyền
- lập bản đồ di truyền 4) áp dụng
- hiệu quả cho bệnh, tật, tính trạng di truyền đơn gen -> xác định kiểu
gen từng các thể và xác suất mắc bệnh để tư vấn di truyền
- tính trạng di truyền đa gen đa nhân tố -> không thể xác định kiểu
gen từng cá thể và khả năng mắc bệnh
- ít dùng với các bệnh do rối loạn số lượng và cấu trúc NST
- đối với bệnh rối lạon trong gen, không di truyền qua đời sau thì việc
lập gia và phân tích gia hệ không có ý nghĩa 5) khó khăn - tốn nhiều thời gian
- theo dõi, ghi chép phải hết sức chính xác và đầy đủ lOMoAR cPSD| 61301459
- chú ý về độ thấm của bệnh tật ( có thể gây phân tích nhầm lẫn )
- chú ý các đột biến mới sinh ( gen ngoại lai, biểu hiện bẹnh giống nhau
nhưng nguyên nhân khác nhau ) 6) chú ý khi lập gia hệ
- các thế hệ được đánh số la mã
- đương sự là người đến khám bệnh
- các người con được đánh số thứ tự từ nhỏ->lớn, trái-> phải
- nhận xét tần số xuất hiện bệnh qua các thế hệ
- nhận định kiểu di truyền
- đưa ra lời khuyên , tư vấn
II) PHƯƠNG PHÁP DI TRUYỀN TẾ BÀO 1) Nguyên tắc chung
- Những mô làm tiêu bản phải đang phát triển mạnh( nhiều tế bào
đang phân chia ) , các mô có ít hoặc không có phải nuôi cấy và kích thích bằng PHA (phytohemagglutinin)
- Làm cho tế bào đang phân chia dừng lại ở kỳ giữa nhờ colchicin (hoặc
colcemid) trước thu hoạc khoảng 2-3 giờ
- Phá vỡ màng tế bào để các NST có điều kiện trải rộng và tác rời nhau
nhờ dung dịch nhược trương (KCl 0,075M hoặc natricicat 1%.....)
- Định hình tế bào bằng dung dịch cảnoy ( 3 methanol:1 acid acetic)
- Nhuộm bằng dung dịch giéma , hematoxylin, thuốc nhuộm băng G,R,C,T...
2) Phương pháp làm tiêu bản
a) Phương pháp trực tiếp : lợi dụng các mô có tốc độ phân chia cao rồi xử lý và quan sát: + quan sát trực tiép + nuôi cấy ngắn hạn
b) Phương pháp gián tiếp : mô có tốc độ phân bào chậm
c) Quy trình làm tiêu bản NST từ bạch cầu lympho máu ngoại vi
- Máu ngoại vi là những tế bào không còn khả năng phân chia nên cần
sử dụng PHA (phytohemagglutinin) để kích thích phân bào.
- Lấy vô trùng từ tĩnh mạch, từ đầu ngón tay và từ máu gót trẻ sơ sinh
- Chất chống đông:heparin
- Có thể cấy toàn bộ hoặc cấy riêng lympho bào - Thiết bị, hóa chất :
+ chuẩn bị typ( lọ nuôi cấy ) , bơm kim tiêm, pipet vô trùng, đèn cồn
+ môi trường nuôi cấy F12, F10 hoặc môi trường parker
+ huyết thanh AB ( huyết thanh bê) lOMoAR cPSD| 61301459 + phytohemagglutinin( PHA)
+ colchicin hoặc colcemid - Tiến hành:
+ sử dụng bơm kim tiêm, pipet vô trùng để cho vào mỗi typ 8ml môi
trường nuôi cấy, 2ml huyết thanh, 1-2 giọt
PHA và 6-8 giọt máu toàn phần
+ nuôi cấy trong tủ ấm 37oC trong 72 giờ
+ cho colchicin vào lọ cấy trước thu hoạc 2-3 giờ - Thu hoạch - Làm tiêu bản
3) Phương pháp nhuộm tiêu bản NST
a) Kỹ thuật nhuộm thường
Nhuộm bằng giemsa 2-5% trong 15-30 phút -> rửa tiêu bản bằng nước sạch, để khô, quan sát
Cho phép đánh giá số lượng, hình dạng và kích thước của NST (
phân biệt 1 số lượng nhỏ NST trong bộ NST người )
b) Kỹ thuật nhuộm băng
- Dực trên cấu trúc và hoạt động của DNA trong NST . vùng dị nhiễm
sắc ( heterochromatin) , vùng nhiễm sắc thực ( euchromatin)-> bằng
cách xử lí trước khi nhuộm các vùng bắt màu khác nhau thể hiện
bằng băng sẫm và băng nhạt trên NST
- Một số kỹ thuật nhuộm băng :
+ kỹ thuật hiện băng G : nhuộm bằng giemsa
+ kỹ thuật băng R (reverse): ngược với bằng G , nghĩa là sáng trở thành sẫm và ngược lại
+ kỹ thuật hiện băng Q: thuốc nhuộm quinacrin mustard là loại phẩm
nhuộm huỳnh quang-> quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang
+ kỹ thuật hiện băng C ( centromer) : nhuộm rõ nhất
( bắt màu đậm nhất) phần tâm NST
+ kỹ thuật hiện bằng T ( terminal) : phần lớn các băng được nhuộm ở
phần đầu mút của 1 số NST
+ băng N và nhuộm bạc : nhuộm các phần chứa gen sao mã ARN
riboxom, tập trung ở nhánh ngắn của NST tâm đầu
Xác định chính xác tất cả các NST trong karyotype . băng G được
thực hiện đầu tiên nếu cần thiết mới sử dụng các kỹ thuật khác. Lưu ý :
+ 1 số băng có sự khác nhau giữa các NST về độ lớn, độ bắt màu, có
thể di truyền từ bố mẹ sang con theo kiểu di truyền Mendel. lOMoAR cPSD| 61301459
Hiện tượng dị hình ( heteromorphism) và đôi khi được dùng như
một “marker” đặc trưng cá thể
4) Phương pháp đánh giá tiêu bản NST người
- Quan sát tiêu bản NST dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại từ 1000-1500 lần.
- Tìm tế bào ở kỳ giữa có các NST dàn đều , đếm số lượng -> phát hiện
rối loạn cấu trúc hoặc số lượng
- Mẫu đánh giá tối thiểu 30 cụm tế bào ở kỹ giữa, trường hợp khảm thì
phải thêm cho đủ 100 cụm
- Chụp ảnh một số cụm và in phóng ảnh
- Cắt và xếp NST của mỗi cụm theo quy ước quốc tế ( lập karyotype)
Tổng hợp kết quả đánh giá trên kính hiển vi và phân tích karyotyp,
kết hợp thăm khám lâm sàng, cận lâm
sàng, bác sĩ di truyền sẽ đưa ra kết luận
III) PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN QUẦN THỂ 1) Một số khái niệm
a) Quần thể : là một nhóm cá thể cùng loài , sinh sống trong một sinh
cảnh, trong một thời gian xác định, có khả năng sinh ra thế hệ sau hữu thụ
b) Vốn gen : là toàn bộ thông tin di truyền, là tổng các alen của tất cả các
gen có trong tất cả các cá thể của quần thể
c) Tần số alen:là tỉ lệ của alen trong vốn gen( tức là số bản sao 1 alen /
tổng tất cả các alen có trong vốn gen )
d) Tần số kiểu gen : tính bằng tỉ lệ cá thể mang kiểu gen đó/ tổng số cá thể trong quần thể
e) Tần số kiểu hình : là tỷ lệ kiểu hình đó trong quần thể
2) định luật Harydy- Weinberg a) Nội dung :
Trong những điều kiện nhất định, trong lòng một quần thể giao phối,
tần số tương đối của các alen ở mỗi gen và tần số kiểu gen có xu
hướng không đổi từ thế hệ này sang thế hệ khác
b) Điều kiện nghiệm đúng :
- Sự giao phối ngẫu nhiên trong quần thể - Không có đột biến - Không có chọn lọc lOMoAR cPSD| 61301459
- Sức sống và sinh sản của mọi cá thể là như nhau c) Công thức : p2 + 2p.q + q2 =1 d) Ý nghĩa :
- Về mặt lý thuyết , là định luật cơ bản nghiên cứu di truyền quần thể
Giải thích vì sao trong thiên nhiên có những quần thể ổn định một cách lâu dài
- Về mặt thực tế, định luật này cho phép tính được tần số alen và tần
số kiểu gen khi biết được tần số kiểu hình và ngược lại
- Rất có ý nghĩa để ước lượng tỷ lệ cá thể mang gen lặn mà không biểu hiện
3) Cấu trúc di truyền của quần thể
a) Quần thể tự phối
- Tự phối chỉ cần 1 cá thể trong quần thể tự phối vẫn có khả năng sinh sản
- Qua các thế hệ, tỷ lệ kiểu gen đồng hợp tử tăng, kiểu gen dị hợp tử
giảm dần -> hình thành dòng thuần
- Gồm nhiều dòng thuần khác nhau
Có ít sự đa dạng di truyền
b) Quần thể giao phối
- Tương đối ổn định về mặt di truyền
- Thành phần kiểu gen, tần số tương đối của các alen ở mỗi gen có xu
hướng không đổi qua các thế hệ
- Quần thể đa hình nhưng xác định
- Sự đa hình về kiểu gen phong phú hơn sự đa hình hiểu hình
c) Các nhân tố ảnh hưởng đến cân bằng di truyền
- Chọn lọc chống gen trội : dễ bị đào thải khỏi quần thể. Số người biểu
hiện thường tương ứng với số người mang gen
- Chọn lọc chống gen lặn : chỉ những người đổng hợp tử gen bệnh mới
biểu hiện . khó bị đào thải khỏi quần thể
- Chọn lọc chống đồng hợp tử: một số trường hợp, kiểu gen dị hợp tử
có ưu thế hơn thể đồng hợp - ảnh hưởng của di trú : lOMoAR cPSD| 61301459
+ di trú là sự di chuyển của cá thể từ quần thể này sang quần thể khác
+ sự nhập cư có thể mang tới các alen vốn không có trong quần thể
+ sự xuất cư có thể làm thay đổi tần số alen và thành phần kiểu gen
d) vai trò của yếu tố đột biến :
- tần số đột biến trong quần thể là rất thấp
- xảy ra thường xuyên, tích lũy qua nhiều thế hệ -> cũng đáng kể
những đột biến làm thay đổi chứa năng của protein đa số là có hại
IV) PHƯƠNG PHÁP DI TRUYỀN PHÂN TỬ
1) Tách chiết, định lượng và tinh sạch acid nucleic a) Tách chiết DNA - các bước cơ bản:
+ tế bào hoặc mô được phá vỡ màng tế bào và màng nhân ( tb euka)
Giải phóng acid nucleic ra khỏi nhân và tế bào + kết tủa
protein bằng hòa tan dịch nghiền trong phenol-chloroform
Tách DNA khỏi dịch nghiền tế bào
+ dung dịch chứa DNA hoàn tan dược bổ sung ethanol hoặc isopropanol.
Ly tâm dung dịch, loại bỏ phần dịch, thu phần kết tủa chính DNA ,
sau đó rửa trong ethanol 70% vài lần rồi được đưa vào bảo quản b) Tách chiết ARN
- Nghiền tế bào, mô trong một dung dịch gồm SDS ( chất tẩy mạnh tác
dụng phá vỡ màng tế bào ), guanidine thiocianate( tác nhân biến tính
protein ) và 2- mecaptoethanol(chất khử mạnh ức chế Raase nội bào
và tách protein khỏi ARN ).
- Mẫu tế bào ( mô) sau khi nghiền được xử lý phenolchloroform và ly
tâm lấy dịch hòa tan ARN , còn phần cặn protein bỏ đi
- Dịch có ARN hòa tan trong nước được đem bổ sung ethanol làm ARN
kết tủa -> ly tâm, bỏ dịch lấy tủa ( ARN toàn phần chứa nhiều loại
ARN :-> tách riêng từng loại )
- Đối với rARN và tARN , do có độ dài xác định -> tách bằng điện di hoặc siêu ly tâm
- Đối với mARN , độ dài khác nhau nhưng có đuôi poly A > tách nhờ sắc
ký ái lực trên cột oligoT- cellulose hoặc sử dụng các viên bi từ có gắn oligo T lOMoAR cPSD| 61301459
c) Tinh sạch, định lượng và bảo quản acid nucleic
- Tinh sạch nhờ sắc ký, điện di hay siêu ly tâm
- Định lượng bằng máy đo mật độ quang
- Bảo quản: nhiệt độ thấp , trong dung môi đặc hiệu
So sánh tách chiết DNA và ARN
Giống nhau: đều gồm 3 bước chính Khác nhau :
Tách chiết DNA tổng số Tách chiết ARN toàn phần Sử dụng ARNase DNAase Sản DNA ARN phẩm
Đòi hỏi yếu tố vô trùng cao hơn
2) Enzyme giới hạn, probe, mồi a) Enzym giới hạn
- Khái niệm : (restricton enzyme, RE) là một endonuclease có khả năng
nhận biết và cắt DNA ở vị trí đặc hiệu :
+ endonuclease cắt ở giữa mạch của phân tử
+ exonuclease phân cắt từ hai đầu của phân tử
- Phân loại : hiện nay xác định được hàng ngàn loại enzym giới hạn. Chia làm 3 loại :
+ loại I và III có thể di chuyển và cắt ở một điểm cách xa vị trí nhận biết hàng trăm nucleotid
+ loại II cắt ngay ở vị trí nhận biết
Kết quả : DNA sợi kép có thể tạo ra các sợi có “ đầu bằng “ hoặc “ đầu dính”
Enzym giới hạn được cho là cơ chế của vi khuẩn nhằm ngăn chặn sự
tấn công của virus và giúp loại bỏ các trình tự của virus - Đặc điểm :
+ enzym giới hạn : cắt các liên kết phosphodieste của bộ khung DNA
mạch đôi nhưng không làm biến đổi đến base
+ các liên kết bị cắt có thể nối lại nhờ enzym nối “ ligase”
Các đoạn cắt giới hạn có thể nối vào nhau nếu có trình tự “đầu
dính” bổ sung với nhau. - ứng dụng : lOMoAR cPSD| 61301459
+ có nhiều ứng dụng trong sinh học phân tử và y học
+ sử dụng làm “ dao cắt phân tử”
+ tạo ra các plasmid nhân tạo có chứa nhiều loại trình tự nhận biết
để khi lựa enzym giới hạn đặc hiệu thích hợp có thể cắt được chính
xác điểm cắt mong muốn + dùng trong kỹ thuật RFLP hay Real-time
PCR để phát hiện đột biến gen
+ dùng trong lập bản đồ giới hạn của bộ gen b) probe ( mẫu dò)
- khái niệm : là đoạn trình tự polylucleotid có khả năng bắt cặp bổ sung
đặc hiệu với trình tự acid nucleic cần tìm - phương pháp :
+ đánh dấu bằng phóng xạ và phát hiện bằng phim
+ Gắn với biotin và phát hiện bằng avidin
+ gắn với enzym phát quang và phát hiện bằng phản ứng phát quang
+ gắn với chất phát quang hóa học hoặc chất phát huỳnh quang và
phát hiện bằng dò tìm tín hiệu ánh sáng - tính chất
+ tính chuyên biệt cao -> chỉ đặc hiệu cho một trình tự acid nucleic xác định
+ có tính nhạy -> phát hiện được cả khi trình tự cần tìm có mật độ rất
thấp và do đã được đánh dấu nên dễ phát hiện và định lượng. c) Mồi
- Khái niệm : mồi (primer) là một oligonucleotid bắt cặp với DNA sợi
đơn để làm cơ sở cho enzym DNA polymerase tổng hợp sợi bổ sung
với sợi đơn đó bằng cách gắn tiếp các nucleotid tự do vào đầu 3’OH của mồi
- Mồi dùng trong kỹ thuật PCR gồm: mồi xuôi và mồi ngược
+ hai mồi cần bắt cặp vào 2 sợi đơn trên phân tử DNA > vai trò xác
định đoạn DNA cần được khuếch đại
+ cặp mồi có tính đặt hiệu cao + độ dài khoảng 18-24bp
+ có thể tổng hợp hóa học bằng một máy tự động 3) Kỹ thuật RFLP
- Trong sinh học phân tử, sự đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn, hay là
RFLP( Restriction Fragment Length Polymophysm), xuất hiện do mỗi
phân tử DNA có số lượng và vị trí các điểm được nhận biết và cắt bởi enzym giới hạn khác nhau lOMoAR cPSD| 61301459
- Trong phân tích, người ta sử dụng các enzym cắt DNA mẫu thành các
đoạn nhỏ -> DNA tạo thành được phân tách theo kích thước bằng kỹ thuật điện di trên gel.
- Khái niệm : kỹ thuật RFLP là công nghệ nghiên cứu đa hình DNA đầu
tiên có chi phí đủ thấp để có thể ứng dụng một cách rộng rãi - Sử dụng : + lập hồ sơ di truyền + lập bản đồ hệ gen
+xác định vị trí gen liên quan đến các rối loạn di truyền
+ xác định nguy cơ mang bệnh và phân tích gia hệ 4) Kỹ thuật PCR
- Khái niệm : là từ viết tắt tiếng anh để chỉ phản ứng chuối trùng hợp (polymerase chain reaction ) 4.1 .Nguyên tắc
- Khi tổng hợp một mạch DNA mới đều cần có mồi
- DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới bổ sung với mạch khuôn
- Nếu có cặp mồi chuyên biệt bắt cặp với 2 đầu của 1 mạch -> chỉ có
DNA nằm giữa được khuếch đại
4.2 .các bước tiến hành
- biến tính : trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần
cần thiết cho sự sao chép , phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ khoảng 94-95oC
- giai đoạn lai : nhiệt độ được hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuôn
( khoảng 40-70o C ) và kéo dài từ 30-60 giây - giai đoạn tổng hợp :
+ nhiệt độ được tăng lên đến 72oC giup cho DNA polymerase
( chịu nhiệt ) tổng hợp DNA
+ thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của đoạn DNA cần
khuếch đại, khoảng từ 30 giây đến nhiều phút
chu kỳ 3 bước sẽ được lặp đi , lặp lại và mỗi lần tăng gấp đôi-> sau
30 chu kỳ số lượng sẽ tăng khoảng hơn 1 triệu lần-> thông thường
phản ứng PCR chỉ chạy khaongr 30-40 chu kỳ 4.3 .các loại PCR
- mutiplex PCR sử dụng nhiều cặp mồi cho một hỗn hợp PCR duy nhất
Nhiều trình tự DNA đích khác nhau được khuếch đại cùng lúc-> cần
tối ưu nhiệt độ gắn mồi lOMoAR cPSD| 61301459
- Nested PCR , còn gọi là PCR lồng, sử dụng hai cặp mồi trong hai phản ứng PCR liên tiếp:
+ thực hiện PCR với cặp mồi thứ nhất nhằm khuếch đại một trình tự DNA ban đầu
+ sau đó thực hiện PCR với cặp mồi thứ hai nhằm khuếch đại một
đoạn đặc hiệu của trình tự DNA ban đầu đó
Hạn chế được việc khuếch đại các sản phẩm không đặc hiệu và chạy
được nhiều chu kỳ hơn
- RT- PCR áp dụng khuếch đại đoạn ARN đích bằng cách dùng enzym
ngược phiên mã trình tự ARN đích đó thành cDNA từ đó chạy phản ứng PCR
Có thể phát hiện được số bản sao hình thành trong thời gian thực,
từ đó định lượng được mật độ trình tự DNA ở mẫu dựa trên quan
sát tín hiệu có được khi thay đổi sợi kép mang sợi đơn ở từng chu kỳ
- Ngoài ra, còn nhiều kỹ thuật PCR khác như Hot start PCR , digital PCR ,Droplet digital PCR
4.4 ứng dụng của kỹ thuật PCR
- xác định gen bệnh hoặc một gen nào đó - ví dụ :
+ nhiều đột biến gây nên bệnh α-thalassemia,β thalassemia
+ gen bệnh ung thư như APC trong ung thư đại tràng
+ gen BRCA-1, BRCA-2 trong ung thư vú
+ gen NF1, gen NF2 trong bệnh u xơ thần kinh Trong trường hợp
không rõ giới tính có thể dùng kỹ
thuật PCR ( sử dụng cặp mồi đặc hiệu) để phát hiện gen TDF
- phát hiện xem sự có mặt hay không của tác nhân vi sinh vật gây bệnh
trong mẫu bệnh phẩm qau khuếch đại đoạn DNA đặc hiệu cho tác nhân đó
- cũng dùng để sản xuất một lượng lớn các probe(mẫu dò)
- ưu điểm :độ đặc hiệu rất cao, cho kết quả nhanh, phát
hiện được các gen bệnh di truyền, gen ung thư, các tác nhân gây
bệnh mà phương pháp khác không phát hiện được, định lượng tác nhân gây bệnh
hỗ trợ bác sỹ đánh giá giai đoạn, hiệu quả điều trị và lOMoAR cPSD| 61301459 tiên lượng bệnh
- Nhược điểm : đòi hỏi phải có phòng xét nghiệm, máy
móc hiện đại, người sử dụng phải có chuyên môn cao . 5) .Các phương pháp lai phân tử
- Khi nâng nhiệt độ acid nucleic mạch kép sẽ tách thành
được gọi là nhiệt độ nóng chảy
hai mạch đơn ở nhiệt độ T m
+ Tm và sự tách 2 mạch đơn gọi là biến tính
+ khi nhiệt độ từ từ hạ xuống , 2 mạch sẽ bắt cặp trở lại và được gọi là sự hồi tính
ứng dụng hiện tượng này người ta đề xuất phương pháp lai phân tử - lai phân tử :
+ có tính đặc hiệu tuyệt đối nghĩa là sự bắt cặp chỉ xảy ra giữa hai
trình tự hoàn toàn bổ sung của hai mạch polinucleotid (DNA- DNA ,
ARN – ARN , DNA –ARN ) + có độ nhạy rất cao vì sự tái bắt cặp có thể
xảy ra dù chỉ là 2 bản sao
a) kỹ thuật southern blot và kỹ thuật northern blot dùng để xác định - kỹ thuật southern blot vị trí những
trình tự trên DNA bộ gen, những đoạn DNA kích thước nhỏ như DNA của plasmit, phage...
- Các bước thực hiện :
+ DNA bộ gen được cắt thành những đoạn kích thước khác nhau nhờ
1 hay nhiều enzym giới hạn + DNA được biến tính ( tách thành 2
mạch đơn ) + DNA cố định trên màng lai được đem lai với mẫu dò có
đánh dấu phóng xạ một thời gian xác định. + cuối cùng, dùng kỹ
thuật phóng xạ tự ghi để xác định vị trí của các phân tử lai. ứng dụng :
+ lập bản đồ giới hạn của một gen, phát hiện sự đa dạng trình tự
gen của cùng một gen ở các chủng hay các cá thể khác nhau qua
so sánh bản đồ giới hạn của chúng
+ dùng để phát hiện các đột biến mất đoạn, đột biến điểm hay
tái tổ hợp trên cùng một gen vì khi xảy ra đột biến hay tái tổ hợp
sẽ làm thay đổi bản đồ giới hạn của gen lOMoAR cPSD| 61301459
- kỹ thuật Northern blot cũng tương tự kỹ thuật Southern blot nhưng
để phát hiện các ARN đặc hiệu -> sử dụng để nghiên cứu sự biểu hiện gen
b) lai tại chỗ huỳnh quang
- trong kiểu lai tại chỗ huỳnh quang , acid nucleic cần tìm không cần
phải tách khỏi mô hay tế bào
quá trình lai với mẫu dò cho phép xác định chính xác vị trí của một
trình tự cần tìm trong tế bào hay trên NST c) DNA microarry
- Phương pháp cố định các NST và nhân trên phiến kính ( sao cho DNA
tạo thành mạch kép với mẫu dò) ngày nay được sử dụng để đặt DNA lên phiến kính trong
phương pháp microarray - ứng dụng :
+ xác định biểu hiện của gen + lai di tryền so sánh + nhận dạng
+ phát hiện đa hình đơn nucleotid ( SNP)
+ phát hiện cắt nối có lựa chọn 6) Giải trình tự gen
- Mỗi một acid nucleic có một trình tự đặc trưng. Công việc tìm trình
tự các nucleotid trên phân tử acid nucleic được gọi là giải trình tự
a) Phương pháp enzym học Sanger
- Nguyên tắc : sử dụng một liều lượng thích hợp dideoxyribonucleotide
trong phản ứng tổng hợp DNA mà khuôn mẫu là đoạn DNA cần giải trình tự
- Các dideoxyribonucleotid (ddNTP ) không có nhóm 3’OH nên trong
quá trình tính toán từ trước thỉnh thoảng mới có 1 ddNTP gắn vào sợi
mới được tổng hợp và vì vậy kết quả thu được gồm nhiều đoạn
polynucleotid có chiều dài khác nhau nhưng đều kết thúc tại ddNTP
đã biết đó. b) Giải trình tự gen thế hệ mới
- Hiện nay có nhiều phương pháp giải trình tự gen theo nguyên tắc
mới được gọi chung là phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới .
- Tốc độ giải trình tự tăng lên nhiều lần
V) MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP KHÁC lOMoAR cPSD| 61301459
1) Phương pháp nghiên cứu trẻ đồng sinh a) Khái niệm :
- Trẻ đồng sinh là trẻ được sinh ra trong cùng một lần sinh . có 2 loại:
+ sinh đôi cùng trứng là trường hợp một hợp tử, trong giai đoạn phôi
bị tách ra làm 2 hay nhiều khối phôi, mỗi khối phát triển trở thành một cơ thể
+ sinh đôi khác trứng khi nhiều trứng cùng rụng, mỗi trứng được thụ tinh bởi một tinh trùng
- Phương pháp nghiên cứu trẻ đồng sinh cho phép đánh giá vai trò của
gen và môi trường trong sự hình thành tính trạng/bệnh thông qua
việc xác định hệ số di truyền H
b) Công thức tính hệ số di truyền
H= %Số cặpsinh1001hợp%−tử%tươngsố
cặphợpsinh−%đôisốhaicặphợpsinhtửđôitươnghaihợphợptửtươnghợp
H =0 : bệnh hoặc tính trạng hoàn toàn do yếu tố môi trường quyết định
H= 1 : bệnh hoặc tính trạng hoàn toàn do gen quyết định 0 có di truyền c) Ý nghĩa:
- tránh hoặc giảm thiểu tác động của môi trường đối với sự biểu hiện của bệnh, tật.
2) Phương pháp nghiên cứu nếp vân da
- Khái niệm : nếp vân da là hình ảnh các nếp và các vân trên ngón tay,
bàn tay, ngón chân, bàn chân -> hình ảnh này có tính chất đặc trưng
cá thể về chi tiết cũng như về tổng thể toàn bộ các nếp vân
- Ý nghĩa : góp phần trong việc chuẩn đoán một số bệnh hoặc hội
chứng di truyền như Down, turner,,,,: khoảng 70 % bệnh Down có thể
phân biệt được với người bình thường dựa trên phân tích đặc điểm nếp vân da bàn tay
3) Phương pháp di truyền hóa sinh
- Cho phép xác định nhiều bệnh về trao đổi chất ở người lOMoAR cPSD| 61301459
BÀI 2 : BỘ GEN NGƯỜI, BỘ NST NGƯỜI I)
HỆ GEN NGƯỜI VÀ BẢN ĐỒ GEN NGƯỜI 1) Hệ gen người
1.1. Khái niệm về gen, hệ gen
- Về mặt di truyền, gen người là một đơn vị vật lý và là đơn vị chức năng của di truyền
- Sinh học phân tử, gen là toàn bộ các trình tự acid nucleic cần thiết để
tổng hợp một sản phẩm gen chức năng (một chuỗi polynucleotid hoặc một phân tử ARN )
Ngoài vùng mã hóa , gen còn gồm các trình tự đảm bảo cho gen
được biểu hiện thành sản phầm
- Gen ở người theo chiều mã hóa gồm các vùng sau: + trình tự promoter
+ điểm bắt đầu phiên mã
+ vùng 5’ phiên mã nhưng không dịch mã +mã mở đầu
+ các exon và intron xen kẽ các exon +mã kết thúc
+ vùng 3’ phiên mã nhưng không dịch mã
+ trình tự tín hiệu gắn đuôi polyA
Kích thước mỗi gen: dài từ vài kilobase tới hàng trăm kilobase
- Hệ gen (genome) là tổ chức của các phân tử DNA mang toàn bộ
thông tin di truyền mã hóa trên các phân tử DNA ( hoặc các ARN đối với retrovirus) .
+ hệ gen được dùng để chỉ hệ gen nhân, cũng có thể dùng để chỉ hệ
gen trong một số loại bào quan như hệ gen ty thể, hệ gen lạp thể
+ hệ gen còn dùng với các yếu tố di truyền không nằm trên NST trong
nhân tế bào như hệ gen ở virus, plasmid, yếu tố di truyền vận động như trasposon
+ đối với sinh vật sinh sản hữu tính, hệ gen gồm các gen trên các NST
thường và mỗi một trong hai NST giới tính
+ hệ gen có thể dùng cho một loài( ví dụ hệ gen người) cũng có thể sử
dùng cho một cá thể cụ thể
1.2. Đặc điểm hệ gen người
- So sánh trình tự DNA của người và trình tự DNA của loài khác cho
thấy hệ gen người có nguồn gốc chung với hệ gen của tổ tiên các loài lOMoAR cPSD| 61301459
động vật trên trái đất và được phát sinh khoảng 100.000 đến 300.000 năm trước
- Hệ gen người bao gồm tất cả các trình tự nucleotid trong 23 cặp NST
trong nhân của tế bào người và trong DNA từng ty thể
- Hệ gen đơn bội gồm toàn bộ các gen nằm trên 23 NST trong giao tử
đơn bội như trứng và tinh trùng. Đối với trứng sẽ có 22 NST thường
và 1 NST giới tính X , còn đối với tinh trùng sẽ có 22 NST thường và có một NST giới
tính X hoặc Y -> hệ gen mỗi cá thể khác nhau khoảng 0,1 %
a) Kích thước hệ gen người ( size of human genome)
- bộ NST đơn bội có kích thước khoảng trên 3 tỷ bp , chiều dài khoảng
1,02 m , khối lượng 3* 10-12 g hay bằng 6 picrogram ở bộ lưỡng bội
(2n) b) Tổ chức hệ gen người
- Các gen trong hệ gen người không phải sắp xếp ngẫu nhiên , những
gen tương tự nhau có xu hướng sắp xếp thành các cụm gen , có sự
phù hợp giữa cấu trúc và chức năng
- Về mặt cấu trúc vật lý:
+hệ gen người phân bố trên 24 phân tử DNA tương ứng với 24 NST
và các gen của ty thể + 1,5% là các gen thực sự( các exon) + 36% là
các trình tự DNA có liên quan đến gen( intron,gen giả,...)
+ 43,8 % là các trình tự DNA lặp; 2,8% là các trình tự vệ tinh
+ 15,9% là các trình tự DNA duy nhất và không mã hóa
( các trình tự thuộc các vùng điều hòa , miARN )
- Phần mã hóa của hệ gen ( nghiên cứu nhiều nhất ) . có trên khoảng
20.000 gen đã được thống kê . số lượng gen của người xấp xỉ những
động vật có mức tiến hóa thấp hơn như giun tròn (20.470 gen)
Sự điều hào hoạt động của các gen đóng một vai trò quan trọng đối
với sự phức tạp của cơ thể
- Kích thước mỗi gen có sự giao động rất lớn, đồ vài trăm nuccleotid
cho tới hàng triệu nucleotid
Các gen trong hệ gen có nhiều chức năng khác nhau, tuy nhiên cũng
có nhiều gen chưa xác định được chức năng
- Gen mã hóa protein ở người độ dài trung bình 50.000bp. trong mỗi
gen người, các đoạn exon chỉ chiếm dưới 5%, còn lại khoảng 95% số
trình tự của nó nằm trong intron và ở các vùng phiên mã nhưng
không dịch mã ( UTRUntraslated Region ) lOMoAR cPSD| 61301459
+ hầu hết các exon người dài khoảng 50-200bp ( có những exon rất
dài như gen mã hóa titin của cơ, dài tới 17.206bp ) +intron dài khoảng 3.300bp
- Các gen ở người có thuộc tính monocistronic, nghĩa là với mỗi mARN
làm khuôn mẫu tổng hợp được một loại chuỗi polypeptid ( sinh vật
prokaryota có thuộc tính polycistrobic nghĩa là một m ARN khi dịch
mã cho nhiều chuỗi polypeptid khác nhau )
- Một số gen mã hóa protein chỉ có mặt một lần duy nhất trong bộ gen
được gọi là các gen đơn nhất 2) Bản đồ gen người
- Bản đồ gen là sơ đồ các gen mã hóa và các trình tự DNA không mã hóa trên từng NST
- Khái niệm : trình tự mã hóa để chỉ những trình tự DNA mang thông
tin được phiên mã thành m ARN và được dịch mã thành trình tự acid
amin trong chuỗi polypeptid trong vòng đời của cá thể
- Bản đồ di truyền dựa vào phương pháp thống kê gián tiếp kết quả phân tích tái tổ hợp.
+ khái niệm : bản đồ di truyền là sơ đồ sắp xếp các gen trên từng NST,
mà vị trí và khoảng cách giữa các gen được ước lượng thông qua tần số tái tổ hợp
+ phương pháp chủ yếu là phương pháp phân tích gen liên kết
- Bản đồ hình thể dựa vào đo đạc trực tiếp trên chiều dài của DNA .
+ khái niệm :bản đồ hình thể hệ gen người là sơ đồ sắp xếp các gen
trên từng NST người mà vị trí và khoảng cách giữa các gen được xác
định bằng phương pháp trực tiếp
+ phương pháp lập gồm :
• phương pháp lai tại chỗ là phương pháp vừa sử dụng kỹ thuật di
truyền tế bào vừa sử dụng kỹ thuật di truyền phân tử. Phương
pháp thường được dùng là lai NST ở kì giữa hoặc NST trong nhân
tế bào gian kỳ với DNA dò đã được đánh dấu bằng đồng vị phóng
xạ hoặc bằng phẩm nhuộm huỳnh quang
• phương pháp lập bản đồ mất đoạn : phương pháp này dựa vào sự
có hoặc vắng mặt của một vùng đặc biệt nào đó hoặc của một
locus trong DNA lấy từ bệnh nhân có bất thường NST hay từ mẫu
lai các tế bào soma người và chuột, trong mẫu có chứa đoạn DNA lOMoAR cPSD| 61301459
đã biết trước của NST người -> ý nghĩa : biết chính xác vị trí NST , dự đoán NST
• phương pháp lập bản đồ giới hạn: phương pháp này thực hiện với
enzym giới hạn loại cắt DNA có độ dài lớn ( 100Kb - 4Mb )
• phương pháp lai tế bào sinh dưỡng khác loài : lai tế bào sinh
dưỡng của người và của chuột nhắt thường được dùng
• phương pháp xác định liều gen: là phương pháp xác định số lượng
bản sao của một gen, cụ thể là xác định số lượng bản sao của một
gen hay cả một trình tự nucleotid chưa rõ bằng một loại mẫu dò
duy nhất đặc hiệu và so sánh mật độ tín hiệu của gen đích đã
được lai với mật độ của tín hiệu được dùng làm đối chứng ( mật
độ tín hiệu do bằng phương pháp tự chụp hình phóng xạ )
• phương pháp dùng các NST nấm nem nhân tạo ( YACYeast
Artificial Chromosome) là phương pháp đặc biệt hữu hiệu để lập bản đồ hình thể
• phương pháp phân tích hình thái NST : có thể giúp xác định vị trí của gen
c) ý nghĩa của lập bản đồ gen người
- lập bản đồ gen người cho chúng ta biết được sơ đồ tổng thể bộ gen người, từ đó:
+ giải thích cơ chế phát sinh và biểu hiện của tính trạng, bệnh tật
+ tìm kiếm và phát triển các phương pháp phát hiện , đề phòng và điều trị bệnh tật
+ cung cấp vị trí chính xác của các gen-> tách dòng gen sản xuất sản
phẩm protein -> chẩn đoán , đề phòng và điều trị bệnh tật
+ dự đoán nguy cơ mắc bệnh di truyền -> biện pháp dự phòng, hạn
chế tác hại của gen bệnh
II) BỘ NHIỄM SẮC THỂ NGƯỜI 1) Khái niệm
- Bộ NST người là lưỡng bội gồm 46 NST .Trong 23 cặp tương đồng, đó
có 22 cặp NST thường và 1 cặp NST giới tính.
+ cặp NST thường giống nhau ở nam và nữ , thường ký hiệu A
+ cặp NST giới tính nữ gồm 2 cái giống nhau XX và nam XY(Y- Bộ NST người thay đổi hình thái trong chu kỳ tế bào . ở mức độ hiển
vi quan sát rõ trong các kỳ phân bào đặc biệt kỳ giữa và kỳ sau (kỳ
trung gian không thấy được) lOMoAR cPSD| 61301459
- Dưới kính hiển vi, các NST người có hình que, có độ dài khác nhau.
Giữa mỗi NST có tâm động chia thành 2 nhánh : nhánh ngắn (p) và nhánh dài (q)
Thống nhất định danh NST thông qua bộ tiêu chuẩn để phân loại bộ NST người
2) Tiêu chuẩn phân loại bộ NST người
- 3 tiêu chuẩn chính
+Kích thước NST giảm dần : từ số1-22, cặp NST giới tính
(Y+ Vị trí phần tâm
Tiểu số phần tâm =chiềutổngdàichiềunhánhdàingắn(p+q()p)
• nhóm tâm giữa (metacentic): nhánh dài=nhánh ngắn
• nhóm tâm lệch (submetacentic): nhánh ngắn< nhánh dài
• nhóm tâm đầu ( acrocentric) : nhánh ngắn rất ngắn
+ Chiều dài tương đối của NST
- ngoài ra, còn một số đặc điểm như sự có mặt của eo thắt thứ cấp và vệ tinh 3) Karyotype người
- Lập karyotyp là quá trình tạo ra một karyotyp các nhân, gồm các bước như: + nuôi cấy tế bào + làm tiêu bản
+ quan sát đánh giá bằng kính hiển vi
+ chụp ảnh một cụm NST đại diện, in ảnh , cắt rời và sắp xếp hình ảnh
từng NST theo quy ước và dán chúng trên một tờ giấy
- Karyotyp có thể thể hiện bằng ký tự theo danh pháp
- Karyotyp giúp xác định một số các rối loạn cấu trúc NST
3.1. đặc điểm bộ NST người
- 46 NST : 44 NST thường, 2 NST giới tính -> chia thành 7 nhóm : A,B,C,D,E,F,G - Nhóm A : + các cặp NST số 1,2,3 + kích thước lớn nhất + NST 1 và 3 là tâm giữa lOMoAR cPSD| 61301459 +NST 2 tâm lệch - Nhóm B :
+ gồm hai cặp NST số 4 và 5
+ 2 cặp này đều tâm lệch + chiều dài tương đối giống nhau - Nhóm C:
+ gồm cặp NST từ 6 – 12
+ chiều dài trung bình, tâm lệch , khó phân biệt được bằng chiều dài
+ NST X có kích thước giống NST số 6 và 7 -> được xếp vào nhóm này - Nhóm D : + gồm cặp NST 13,14,15 + kích thước trung bình + tâm đầu - Nhóm E :
+ gồm các cặp NST số 16,17,18
+ kích thước tương đối ngắn +tâm lệch
+ tâm động NST số 16 gần tâm hơn còn tâm động NST số 18 gần đầu mút hơn - Nhóm F:
+ gồm hai cặp NST số 19 và 20 + kích thước
nhỏ thuộc loại tâm giữa - Nhóm G :
+ gồm hai cặp NST số 21 và 22 + là các NST tâm đầu
+ kích thước nhỏ nhất trong bộ NST người
NST Y là NST tâm đầu cũng xếp vào nhóm . NST Y thường có kích thước
lớn hơn so với NST nhóm G
3.2 danh pháp NST người
a. nội dung chính của danh pháp NST người -
Danh pháp NST người được quy định bởi các nhà khoa học thông qua
các hội nghị quốc tế và xuất bản thành tài liệu có tên là “ An Internatinal
System for Human Cytogenetics Nomenclature” viết tắt ISCN. lOMoAR cPSD| 61301459 -
nội dung chính của ISCN gồm các quy định về việc mô tả các NST bình thường và bất thường -
NST bình thường : mô tả số lượng và hình thái các NST ở trạng thái bình
thường và bất thường bằng kỹ thuật nhuộm quy ước và bằng kỹ thuật nhuộm băng -
các biểu tượng và thuật ngữ tắt - định tên karyotyp -
trường hợp không xác định được tên NST hoặc băng -
thứ tự các NST bất thường trong karyotyp -
các biến thể bình thường của NST -
các bất thường số lượng NST - sự tái cấu trúc NST - đứt gãy NST - khối u - NST trong giảm phân -
trường hợp lai tại chỗ huỳnh quang
b. viết karyotrp người theo ISCN: sau đây là một số quy định chính - thứ tự viết karyotyp:
+ đầu tiên là tổng số NST có trong tế bào rồi (,) -> NST giới tính -> NST
bình thường viết trước-> NST bất thường giữa các bất thường là dấu
phẩy ( X trước Y ) + tiếp theo là các bất thường ở NST thường :
• bất thường của NST nhỏ hơn viết trước
• NST đồng dạng : số lượng trước cấu trúc sau
• cấu trúc khác nhau trên một NST hoặc 2 NST thì thứ tự viết theo bảng chữ cái -
một số ký hiệu và chữ viết tắt Ký hiệu Ý nghĩa p Nhánh ngắn q Nhánh dài + Thừa NST - Thiếu NST t Chuyển đoạn Del / dup Mất đoạn/ lặp đoạn -
cách viết ký hiệu vùng , các băng và băng phụ: số thứ tự của NST -> ký
hiệu nhánh-> số thứ tự của vùng> số thứ tự của băng . có băng phụ thì
giữa số thứ tự của băng và số thứ tự băng phụ phải có 1 dấu chấm(.) ,
băng dưới phụ thì viết liền