Giáo Trình Thực Tập - Thực hành Hóa Đại Cương | Trường Đại học Nam Cần Thơ

Giáo Trình Thực Tập - Thực hành Hóa Đại Cương | Trường Đại học Nam Cần Thơ được sưu tầm và soạn thảo dưới dạng file PDF để gửi tới các bạn sinh viên cùng tham khảo, ôn tập đầy đủ kiến thức, chuẩn bị cho các buổi học thật tốt. Mời bạn đọc đón xem!

Trường:

Đại học Nam Cần Thơ 96 tài liệu

Thông tin:
10 trang 5 tháng trước

Bình luận

Vui lòng đăng nhập hoặc đăng ký để gửi bình luận.

Giáo Trình Thực Tập - Thực hành Hóa Đại Cương | Trường Đại học Nam Cần Thơ

Giáo Trình Thực Tập - Thực hành Hóa Đại Cương | Trường Đại học Nam Cần Thơ được sưu tầm và soạn thảo dưới dạng file PDF để gửi tới các bạn sinh viên cùng tham khảo, ôn tập đầy đủ kiến thức, chuẩn bị cho các buổi học thật tốt. Mời bạn đọc đón xem!

67 34 lượt tải Tải xuống
Giáo Trình Th p Sinh Hóa c T
26
Tiến hành
Cân chính xác khong 0,3 gam du vào bình tam giác 250 mL, cho vào đó 6mL
KOH 0,5N trong alcol (đng thi tiến hành song song vi bình th không: 0,3 mL
nưc thay vì du). Lc đều.
Đem 2 bình đun cách thy qua ng sinh hàn, cho sôi nh trong 45 phút. Như
vy cht béo trong bình đ đã th y phân hoàn toàn (ph n ngphòng hóa ã kết thúc).
Để cho bình ngui, thêm vào đ ó 2 mL nước ct, 2-3 gi t phenolphtalein chun độ
bng HCl 0,5N trong alcol cho đến khi màu hng mt.
Lưu ý: Cn chun độ mu th không trước.
Tính kết qu
Chúng ta biết rng 1mL KOH 0,5N tương đương vi 28,05mg KOH
Ch s xà phòng được tính theo công thc sau:
28,05 x (a-b)
C
xp =
m
Trong đó: - C
xp
: Ch s xà phòng
- a: S mL HCl 0,5N dùng để chun độ bình th không
- b: S mL HCl 0,5N dùng để chun độ bình th tht (bình có mu).
- m: S gam cht béo ly làm thí nghim
3.3.2. Xác nh chđị s iod
Định nghĩa: Ch ế s iod là s gam iod k t h p vi 100 gam cht béo
Nguyên tc
Trong nhng điu kin thí nghi đm xác định nh ng ni ôi -CH=CH- cho vi
halogen phn ng cng ch không cho phn ng thế.
Cho mt lượng tha ICl (iodine monochloride) tác dng vi cht béo cn phân
tích trong bóng ti để phn ng cng x y ra hoàn toàn. Lượng iod đã phn ng được
xác định da vào phn n ng chu độ lượng iod gi i phóng ra (sau khi thêm KI) b ng
dung dch Na
2
S
2
O
3
chun vi tinh bt làm ch th.
Như v sy ch iod xác định tng quát các acid béo không no trong cht béo.
Các phương trình phn ng được trình bày như sau:
C
C +
ICl
H
C
H
C
Cl I
HH
ICl + KI KCl + I
2
Na
2
S
2
O O
3
+ I
2
2 NaI + Na
2
S
4 6
Hoá cht
- Dung dch ICl 0,2M
- Dung dch KI 0,1%
- Dung dch Na
2
S
2
O
3
0,1N
- Cloroform
- Dung dch h tinh bt 1%
Giáo Trình Th p Sinh Hóa c T
27
Tiến hành
Cân chính xác 0,2 gam du cho vào bình tam giác 250 mL (có nút nhám), thêm
vào 10 mL cloroform, tiếp tc cho thêm 25 mL dung dch ICl 0,2M. Lc k bình, để
yên 1 gi n hành chu trong bóng ti. Tiế n b mu đối chng t ng tươ như mu tht.
Tráng np c bình tam giác vi kho ng 50 mL nước c t, thêm 10 mL dung
dch KI 0,1% (w/v) và định lượng iod gii phóng ra bng dung dch Na
2
S
2
O
3
0,1N đến
khi màu vàng sm ri thêm 1 mL h tinh bt 1%. Nếu màu xanh xut hin thì
tiếp tc chun độ cho ch mđến khi dung d t màu.
Tính kết qu
Ta biết 1mL Na
2
S
2
O
3
0,1N tương ng 0,01269 g I
2
C
i
=
0,01269 x 100 x (a - b)
m
Trong đó: - C
i
: Ch s iod
- a: S mL Na
2
S
2
O
3
0,1 N dùng chun độ bình th không
- b: S mL Na
2
S
2
O
3
0,1 N dùng chun độ bình thí nghim
- m: Lượng du dùng thí nghim (tính bng gam)
- 100: Để tính trong 100 gam cht béo
3.3.3. Xác nh chđị s acid
Định nghĩa: Ch s acid s miligam KOH c ến thi t để trung hòa hế t nh ng
acid béo t do có trong 1 gam cht béo.
Nguyên tc: Người ta dùng KOH 0,01N để trung hòa các acid béo t do
trong cht béo dùng để phân tích vi phenolphtalein làm ch th màu.
Hóa cht
- KOH 0,01N trong alcol
- Alcol tuyt i đố
- Ether ethylic
Tiến hành
Dùng 1 bình tam giác 100 mL cho vào 5 mL alcol tuyt đối và 5 mL ether (theo
t l 1:1) cho thêm vào bình này 2-3 git phenolphtalein dùng KOH 0,01N trong
alcol để trung hòa hn hp đến khi xut hin màu hng lt. Sau đó thêm vào hn hp
va trung hòa 0,5 gam du. Đem hn hp này trung hòa bng KOH 0,01N trong alcol
cho đến khi có màu hng b n v ng sau 30 giây. Đọc th tích KOH đã dùng trên buret.
Tính kết qu
Ta biết 1 mL KOH 0,01N tương ng vi 0,56 mg KOH
Ch s acid được tính theo công thc sau:
C
a
=
m
a x 0,56
Trong đó: - Ca: Ch s acid
- a : S đ mL KOH 0,01N ã dùng để trung hòa hn hp có du
- m: Khi lượng du ly làm thí nghim (tính bng gam)
Giáo Trình Th p Sinh Hóa c T
28
3.3.4. Xác nh chđị s peroxid
Định nghĩa: Ch s peroxid s gam iod được gi i phóng ra b i peroxid
trong 100 gam mu.
Nguyên tc: Trong không khí, các acid béo trong cht béo, đặc bit các
acdi béo không no d dàng b oxy hóa mt phn to thành peroxid, gây ra hin tượng
ôi hóa cht béo. Xác định ch s peroxid d ng sau: a trên phn
Lượng iod gi i phóng ra được chu n độ b ng dung d ch Na
2
S
2
O
3
vi tinh bt
làm ch th màu.
Na
2 2 2
S O
3
+ I 2 NaI + Na
2 4
S O
6
Hoá cht
- Acid acetic đậm đặc
- Cloroform
- Dung dch KI bão hòa
- Dung dch Na
2
S
2
O
3
0,1 N
- Dung dch h tinh bt 1%
Tiến hành
Cân chính xác khong 2 gam du cho vào bình tam giác 250 mL, thêm vào 10
mL dung dch hn hp acid acetic : cloroform (t l 2: 1) 1 mL dung d ch KI bão
hòa mi pha. Đậy n p, l c k bình để yên trong bóng ti 10 phút. Tiến hành chun
b mu đối chng tương t như mu tht, dùng 2 mL nưc ct thay vì du.
Cho thêm 25 mL nước c ết ti n hành định lượng iod gi i phóng ra b ng dung
dch Na
2
S
2
O
3
0,1N đến khi màu vàng sm ri thêm 1 mL h tinh bt 1%. Nếu
màu xanh xut hin thì tiếp tc chun độ cho đến khi dung dch mt màu.
Tính kết qu
Ta biết 1mL Na
2
S
2
O
3
0,1N tương ng 12,69 mg I
2
Ch s peroxid được tính theo công thc sau:
Cp =
0,01269 x ( a - b) x 100
m
Trong đó: - Cp: Ch s peroxid
- a: S mL Na
2
S
2
O
3
0,1 N dùng chun độ bình th không
- b: S mL Na
2
S
2
O
3
0,1 N dùng chun độ bình thí nghim
- m: Lượng du dùng thí nghim (tính bng gam)
- 100: Để tính trong 100 gam cht béo
3.4. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LIPID THÔ BNG MÁY SOXHLET
Nguyên tc
Da trên kh năng hòa tan ca lipid trong dung môi hu cơ không phân cc,
dùng dung môi hu cơ để trích lipid ra khi nguyên liu đã được nghin nh. Trong
quá trình trích, các hp cht tan được trong cht béo như các sc t, các vitamin tan
trong cht béo... cũng b tách ra khi nguyên liu. Do ln các tp cht khác, nên
thành phn trích ly được gi là lipid tng s hay lipid thô.
R
1
H
C
H
C
O
R
2
O
+
KI
+ 2 CH
3
COOH
R
1
H
C
H
C
R
2
+
I
2
+ 2 CH
3
COOK
O
+ H O
2
Giáo Trình Th p Sinh Hóa c T
29
Có 2 phương pháp xác định:
- Phương pháp trc tiếp: Trích lipid ra khi nguyên liu cân lượng lipid được
trích ly.
- Ph nh chênh l ch khương pháp gián tiếp: Xác đị i lượ ướng nguyên liu khô tr c và
sau khi chi u, tết xut lipid ra khi nguyên li đó suy ra khi lượng lipid trong mu
phân tích.
Dng c, hóa cht
- Bếp cách thy
- T s y
- Cân phân tích
- Ether ethylic hoc ether du ha.
- B Soxhlet [gm: bình cu (a), tr chiết (b) và ng sinh hàn (c)]. (Xem hình 3.1)
Hình 3.1. H thng Soxhlet
Tiến hành
- Sy khô nguyên liu n đã được nghi n nhuy đến khi lượng không đổi. Cân
chính xác khong 5 gam nguyên liu (s d ng cân phân tích), cho vào túi gi y l đc ã
được s ếy khô và bi t khi lượng (Túi gi y ph i có đường kính nh hơ n đường kính tr
chiết và chiu dài ngn hơn chiu cao ca ông chy tràn).
- Đặt túi giy có cha mu vào tr chiết.
- Lp tr chiết vào bình cu (đã được s y khô và xác định khi lượng) và l p ng
sinh hàn.
- Cho dung môi vào tr chiết sao cho mt lượng dung môi ch y xu ng kho ng ½
bình c u. u và còn mt lượng trên phu chiết còn đủ ngp m
- M n ước vào ng sinh hàn.
- Đặt h thng Soxhlet lên bế p cách th y và điu chnh nhit độ sao cho chu k
hoàn l u cư a dung môi đạt t 5 đến 8 ln trong mt gi. Chiết trong 8 –12 gi cho đến
khi trích ly hoàn toàn cht béo. Th thi đim kết thúc quá trình trích bng cách ly
vài git ether t đầu cui tr chiết cho lên đĩa kính đồng h sch. Sau khi dung môi
ng sinh hàn (c)
Tr chiết (b)
Dung môi
Bình cu (a)
Giáo Trình Th p Sinh Hóa c T
30
bay hơi hết, trên mt kính đồng h không để l ế i v t d u loang thì xem như lipid đã
được chiết hoàn toàn.
- Sau khi chiết xong, ly bình cu và túi đựng mu ra, lp ng sinh hàn vào bình
cu mi và ct thu hi ether.
Tính toán kết qu
Sy bình cu cha lipid đế địn khi lượng không đổi, cân xác nh khi lượng.
Nếu chiết bng ether ethylic thì sy khô nhit độ 60- 70
o
C trong 30 phút, nếu chiết
bng ether du ha thì sy nhit độ 80- 90
o
C trong 45- 50 phút.
Hàm lượng lipid có trong 100gam nguyên liu được tính theo công thc sau:
X =
(a - b) x 100
m
Trong đó: - X: hàm lượng lipid tính theo %
- a: khi lượng bình có cha cht béo (g)
- b: khi lượng bình cu ban đầu (g)
- c: khi lượng m c ban u khan nướ đầu (g)
3.5. CHIT TÁCH LECITHIN T LÒNG ĐỎ TRNG
Lecithin lipid cha gc phosphate (phospholipid), trong thành phn
nhóm phân cc alcol amincholine.
Công th sau: c cu t o c a lecithin như
CH O C (CH
2
)
7
CH CH (CH
2
)
7
CH
3
O
CH
3
(CH
2
)
14
O
COCH
2
O
N
+
CH
2
CH
2
O
O
-
POCH
2
CH
3
CH
3
CH
3
Tiến hành
Dùng 2 mL lòng đỏ trng đã đánh nhuyn cho vào 1 ng nghim 25 mL, thêm
vào ng nghim 10 mL alcol tuyt đối, khuy đều. Đặt ng nghim vào ni đun cách
thy 75 - 80
O
C, tiếp tc khuy đều trong 10 phút (là thi gian để rút tách lecithin)
(Nếu lượng alcol b b c hơi thì ta cho tiế đ p vào úng th tích ban đầu). L c h n h p
trên qua ng nghim khô, dùng dung dch chiết tiến hành thí nghim sau:
ng nghim
Dung d
ch
1 2
Dch chiết
Aceton
Nước ct
1 mL
2 mL
0 mL
1 mL
0 mL
2 mL
Nhn xét hin tượng, gi ếi thích và k t lun.
Giáo Trình Th p Sinh Hóa c T
31
CHƯƠNG 4. KHO SÁT VITAMIN
4.1. KHÁI QUÁT
Vitamin là nh ng phân t h cu cơ ơ n cho c th sinh v t vi mt lượng r t nh.
Tên gi vitamin xut hin ln đầu tiên vào năm 1911 khi thiamine (vitamin B1) được
nhn dng.
Vitamin được chia thành 2 nhóm chính:
- Vitamin tan trong nước: Vitamin nhóm B, vitamin C, vitamin H
- Vitamin tan trong cht béo: Vitamin nhóm A, D, E, K, Q...
4.2. ĐỊNH TÍNH VITAMIN D
Các vitamin D dn sut ca các sterol. Khi được chiếu tia t ngoi các sterol
s có hot tính ca vitamin D.
Nguyên tc: Khi đun nóng hn hp vitamin D vi hn hp anilin acid HCl
đậ đặm c thu được cht lng có màu đỏ.
Tiến hành: Cho vào ng nghim dung dch trích t 2 viên du cá, thêm vào 2
mL hn hp anilin : HCl đm đặc (theo t l th tích 15:1). Đun sôi m u na phút trên
đèn cn. Quan sát s chuyn đổi màu, gi ếi thích, k t lun.
4.3. ĐỊNH TÍNH VITAMIN B1
Chun b dung dch vitamin B1: Giã 1 viên vitamin B1, pha vi 5 mL nước
ct, lc qua giy lc khô. Ly dung dch lc tiến hành 2 thí nghim sau.
4.3.1. Phn ng to thiocrome
Nguyên tc: Khi oxy hóa cn thn trong môi trường ki ếm, vitamin B1 s bi n
đổi thành thiochrome, trong quá trình biế n đổi d ng keto ca thiamine, coi như
sn phm trung gian.
N
NH
3
C
CH
2
NH
2
CH
3
S
N
+
OHCH
2
CH
2
K
3
Fe(CN)
6
NaOH
N
NH
3
C
CH
2
NH
2
CH
3
S
N
O
CH
2
CH
2
OH
N
NH
3
C
CH
2
N
CH
3
S
N
OHCH
2
CH
2
-H
2
O
Thiocrome được tách bng rượu isoamyl alcohol (isoamylic, isobutylic) to
võng hunh quang màu xanh tím phát quang khi chiếu tia t ngoi. Cường độ ca
hunh quang t l vi hàm lượng ca thiocrome. Do đó phn ng này còn được s
dng để định lượng vitamin B1 theo phương pháp hunh quang.
Hóa cht
- Dung dch NaOH 15%
Thiochrome
Thiamine
Giáo Trình Th p Sinh Hóa c T
32
- Dung dch K
3
Fe (CN)
6
1%
- Isoamylic
Tiến hành
Chun b các ng nghim theo bng sau:
ng nghim
Hóa ch
t
1 2
Dung dch vitamin B1
Nước ct
Dung dch NaOH 15%
K
3
Fe (CN)
6
isoamyl alcohol
2 mL
0
1 mL
0,5 mL
2 mL
0
2 mL
1 mL
0,5 mL
2 mL
Để yên khong 5 phút ri quan sát. Sau đ ó tiếp t c quan sát dưới ánh sáng mt
tri. Ghi nhn hi n t ượng và kết lun.
4.3.2. Phn ng vi thuc th diazo
Nguyên tc: Trong môi trường kim thiamine phn ng vi thuc th diazo
(hn hp acid sulfanilic và natri nitric) s cho màu vàng cam hoc đỏ. Màu là mt hp
cht phc tp hình thành gia thiamine và thuc th diazo.
Hoá cht
- Dung dch acid sulfanilic 1%
- Dung dch natri nitric 5%
- Dung dch natri carbonate 10%
Tiến hành
Cho các hoá ch m theo trình tt ln lượt vào ng nghi sau: 0,5 mL dung dch
vitamin B1 + 0,5 mL dung dch acid sulfanilic 1% + 0,5 mL dung dch natri nitric 5%
+ 10 git dung dch natri carbonate 10%.
L c đều ng nghi m, quan sát màu, gii thích và kết lun.
4.4. ĐỊNH TÍNH VITAMIN B2
Nguyên tc: Vitamin B2 dn xut ribitol ca isoalloxazine, kh năng
phn ng oxy hóa kh thu n ngh ch. Vitamin B2 dng oxy hóa (riboflavin) màu
vàng, dng kh (dihydroriboflavin) thì không màu. Người ta s dng phn ng này
để phát hin vitamin B2. Phương trình ph n ng được trình bày như sau:
N
N
NH
N
O
O
H
3
C
H
3
C
CH
2
(CHOH)
3
CH
2
OH
N
N
NH
N
H
3
C
H
3
C
O
O
H
H
CH
2
CH
2
OH(CHOH)
3
+2H
-2H
Riboflavin Dihydroriboflavin
(khäng maìu)
(maì ìu va ng)
Giáo Trình Th p Sinh Hóa c T
33
Khi cho HCl đậm m đặc (hoc acid acetic đậ đặc) và km vào dung dch vitamin
B2 thì hydro bay lên và dung dch màu vàng s mt màu.
Tiến hành
Giã mt viên B2 cho vào 5 mL nước ct lc. Dùng 2 mL dung dch lc cho
vào ng nghim, cho thêm 1 mL HCl đm đc mt ít bt km cho đến khi dung
dch mtu
- Viết các phương trình phn ng xy ra.
- Gi ếi thích và k t lun.
4.5. ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN C
4.5.1. Định lượng vitamin C theo phương pháp Muri
Vitamin C (acid ascorbic) C
6
H
8
O
6
2 dng đồng phân quang hc D L,
dng D không hot tính sinh hc. Bài này kho sát v L- acid ascorbic, acid này có
th thy dng kh và oxy hóa.
O
C
C
C
C
C
CH
2
OH
HO
HO
HO
O
H
H
- 2H
O
C
C
C
C
C
CH
2
OH
O
O
HO
O
H
H
+2H
Nguyên tc: Định lượng vitamin C da trên tính kh ca đối vi thuc th 2,6
dichlorophenol indophenol (DIP). Dng oxy hóa ca thu c th DIP màu xanh b
kh bi acid ascorbic trong dch chiết ca nguyên li u thc v t thành dung d ch
không màu. t c đim cân bng t acid ascorbic thì thuc th màu dư tha không b
kh có màu hng.
O
C
C
C
C
C
CH
2
OH
HO
HO
HO
O
H
H
O
C
C
C
C
C
CH
2
OH
O
O
HO
O
H
H
O
ClCl
N
O
-
(Na
+
)
+
+HCl
+
OH
ClCl
NH
OH
L – acid ascorbic L – acid dehydroascorbic
(dng kh) (dng oxy hóa)
L – acid ascorbic 2,6 - dichlorophenol 2,6 - dichlorophenol
(dng kh) indophenol sodium (màu xanh) indophenol (không màu)
Giáo Trình Th p Sinh Hóa c T
34
Trong môi trường acid thì thuc th 2,6 dichlorophenol indophenol màu
hng.
O
ClCl
N
O
-
(Na
+
)
HCl
+
ClCl
N
OH
NaCl
+
O
Hoá cht
- Dung dch DIP 0,001N
- Dung dch acid oxalic 1%
- Dung dch HCl 1%
Tiến hành
Cân khong 5g trái cây (trái cc, bưởi...) cha acid ascorbic đã được thái
nh, chuyn sang ci s cùng vi 20 mL HCl 1%, cht ly dch ngâm gi li trong
cc, đem phn tht nghin m n, xong chuy n sang bình định mc 100 mL cùng vi
dung dch HCl 1% va chiết ra. Ra ci và tráng dng c ít nht 3 ln, mi ln vi mt
ít acid oxalic 1% và cũng dn vào bình đị để đưnh mc. Dùng acid oxalic a th tích lên
vch 100 mL. Lc k, chuyn qua cc khô 100 mL, để yên 15 phút ri lc qua giy lc
khô.
- Tiến hành định phân m u đối chng: L y 8 mL acid oxalic 1% 2 mL HCl 1%
cho vào bình tam giác dung tích 100 mL, dùng microburet vi DIP 0,001N để chun
độ đế n lúc xu t hi n màu hng bn sau ba mươi giây.
Lưu ý: Cn tiến hành đnh phân m u đối chng và m u th t vi 3 l n l p l i để l ếy k t
qu trung bình.
- Chun độ m u th t: Dùng pipet l y 10 mL d ch lc cha vitamin C cho vào
bình tam giác dung tích 100 mL, tiến hành chun u độ như m đối chng.
Tính kết qu
S mg vitamin C trong 100g m u v t được tính như sau:
vxm
xVxxba
X
100088,0)(
=
a: S mL trung bình khi định chun m u v t
b: S mL trung bình khi định chun mu đối chng.
0,088: s mg acid ascorbic t ch chuương đương vi 1 mL dung d n DIP 0,001N
đã được định chun bng acid ascorbic chun.
V: Th tích dch chiết ban đầu ( đây là 100 mL)
v: Th tích dung dch chiết ly để định chun (10 mL)
m: Trng lượng mu vt cân lúc đầu (tính bng gam).
Lưu ý:
- Khi chun b mu v t, cân m u v t, c t m u v t (b ng dao inox) nghin
mu vt cn tiến hành nhanh chóng trong mt ci s HCl 1% (hoc vi HPO
3
-
Giáo Trình Th p Sinh Hóa c T
35
CH
3
COOH). vitamin C rt d b oxy hóa trong không khí, nh t khi s hin
din ca các ion kim loi (Fe, Cu).
- S n ph m cha Fe
2+
, Sn
2+,
Cu
2+
s ế cho ta nhng k t qu v s lượng acid
ascorbic cao hơn s lượng tht nếu ta dùng phương pháp này.
Ta có th trc nghim đơn gin để xem nhng ion có tính kh này hin din
vi nhng s lượng đủ để làm sai kết qu thc nghim :
+ Thêm 2 git dung dch xanh methylene 0,05% (hòa tan trong nước) vào 10
mL ca hn hp m u chi đi ế gm m t th tích dung d ch m u vt (cha acid
ascorbic) và mt th tích dung dch HCl 1% (hoc H
2
PO
3
- CH
3
COOH). Lc đều, nếu
dung dch xanh methylene b mt màu trong 5-10 giây cho thy s hi n di n ca
các cht có tính kh trên.
+ Sn
2+
không cho phn ng vi trc nghim này và có th được th nghi ưm nh
sau: Cho 10 mL dung dch HCl: nước theo t l 1:3 vào 10 mL dung dch mu vt.
Thêm vào đó 5 git dung dch carmin indigo 0,05% (pha vi nước). Khuy, nếu hn
hp dung dch b m t màu trong 5-10 giây cho th y s hi n di n ca Sn
2+
hay nhng
cht có tính kh khác nói trên.
4.5.2. Định lượng vitamin C bng enzyme peroxidase
Vitamin C có th b oxy hóa bi enzyme peroxidase. Da trên nguyên l ý này
th phát trin m nh lt phương pháp đị ượng vitamin C bng enzyme peroxidase.
4.5.2.1. Trích vitamin C
Cân 10g trái cây hoc rau ci d như chanh ri cho vào trong 20 mL dung
dch đệm (pH 6,8) metaphosphoric acid 5%, sau đó nghin mn và lc. Dung d ch ch a
vitamin C sau đó được nâng lên đến 100 mL trong bình định mc bng dung dch đệm
trên.
4.5.2.2. Định lượng vitamin C
- Chun b dung d ch enzyme: 0,01g enzyme peroxidase được pha trong 5 mL
dung dch đệm pH 6,8 và gi trong nước đá.
- Chun b dung d ch vitamin C chun 5mg/ 100 mL: 10 mg vitamin C (tinh
khiết) được pha trong dung dch đệm pH 6,8 và nâng lên 200 mL trong bình định mc.
Sau đó đượ đểc pha loãng thành 1, 2, 3, 4 mg/ 100 mL thiết lp đường chun.
Trước khi tiến hành đo mu chun và mu th th t, m u không s được đo bng
dung dch đệm vi bước sóng 265 nm. Mu chun đưc chun b t 1, 2, 3, 4, 5
mg/100 mL. Mu d ch trích có th được pha loãng thành 10, 20 hoc 50 ln để d kho
sát. Phn ng đưc tiế n hành theo trình t cho các ch t vào cuvette như sau:
- Tiến nh đo: Cho vào ng nghim 2,5 mL dung dch đệm + 0,5 mL dung
dch vitamin C chun hoc mu + 0,1 mL dung dch enzyme peroxidase đo độ hp
th bước sóng 265 nm ta được giá tr Ai. Khi kết qu th hi n s n định trên đường
biu din thì thêm vào 0,1 mL H
2
0
2
cho n o định sau 1 phút, tiếp tc đ được giá tr
Af. Độ hp th ca mu khi đo là:
A =
265
Ai - Af
Hàm lượng mu tht s th được tính theo ng chuđườ n và suy ra giá tr t.
| 1/10

Preview text:

Giáo Trình Thc Tp Sinh Hóa
Tiến hành
Cân chính xác khoảng 0,3 gam dầu vào bình tam giác 250 mL, cho vào đó 6mL
KOH 0,5N trong alcol (đồng thời tiến hành song song với bình thử không: 0,3 mL
nước thay vì dầu). Lắc đều.
Đem 2 bình đun cách thủy qua ống sinh hàn, cho sôi nhẹ trong 45 phút. Như
vậy chất béo trong bình đã thủy phân hoàn toàn (p ả
h n ứng xà phòng hóa đã kết thúc).
Để cho bình nguội, thêm vào đó 2 mL nước cất, 2-3 giọt phenolphtalein và chuẩn độ
bằng HCl 0,5N trong alcol cho đến khi màu hồng mất.
Lưu ý: Cần chuẩn độ mẫu thử không trước.
Tính kết qu
Chúng ta biết rằng 1mL KOH 0,5N tương đương với 28,05mg KOH
Chỉ số xà phòng được tính theo công thức sau: 28,05 x (a-b) Cxp = m Trong đó: - Cxp: Chỉ số xà phòng
- a: Số mL HCl 0,5N dùng để chuẩn độ bình thử không
- b: Số mL HCl 0,5N dùng để chuẩn độ bình thử thật (bình có mẫu).
- m: Số gam chất béo lấy làm thí nghiệm
3.3.2. Xác định ch s iod
Định nghĩa: Chỉ số iod là ố s gam iod kết ợ
h p với 100 gam chất béo
Nguyên tc
Trong những điều kiện thí nghiệm xác định n ữ
h ng nối đôi -CH=CH- cho với
halogen phản ứng cộng chứ không cho phản ứng thế.
Cho một lượng thừa ICl (iodine monochloride) tác dụng với chất béo cần phân
tích trong bóng tối để phản ứng cộng xảy ra hoàn toàn. Lượng iod đã phản ứng được
xác định dựa vào phản ứng chuẩn độ lượng iod giải phóng ra (sau khi thêm KI) ằ b ng
dung dịch Na2S2O3 chuẩn với tinh bột làm chỉ thị.
Như vậy chỉ số iod xác định tổng quát các acid béo không no trong chất béo.
Các phương trình phản ứng được trình bày như sau: H H C C + ICl C C Cl I H H ICl + KI → KCl + I2
Na2S2O3 + I2 → 2 NaI + Na2S4O6
Hoá cht - Dung dịch ICl 0,2M - Dung dịch KI 0,1%
- Dung dịch Na2S2O3 0,1N - Cloroform
- Dung dịch hồ tinh bột 1% 2 6
Giáo Trình Thc Tp Sinh Hóa
Tiến hành
Cân chính xác 0,2 gam dầu cho vào bình tam giác 250 mL (có nút nhám), thêm
vào 10 mL cloroform, tiếp tục cho thêm 25 mL dung dịch ICl 0,2M. Lắc kỹ bình, để
yên 1 giờ trong bóng tối. Tiến hành chuẩn bị mẫu đối chứng tư n ơ g tự như mẫu thật.
Tráng nắp và cổ bình tam giác với khoảng 50 mL nước ấ c t, thêm 10 mL dung
dịch KI 0,1% (w/v) và định lượng iod giải phóng ra bằng dung dịch Na2S2O3 0,1N đến
khi có màu vàng sậm rồi thêm 1 mL hồ tinh bột 1%. Nếu có màu xanh xuất hiện thì
tiếp tục chuẩn độ cho đến khi dung dịch mất màu.
Tính kết qu
Ta biết 1mL Na2S2O3 0,1N tương ứng 0,01269 g I2 0,01269 x 100 x (a - b) Ci = m Trong đó: - Ci: Chỉ số iod
- a: Số mL Na2S2O3 0,1 N dùng chuẩn độ bình thử không
- b: Số mL Na2S2O3 0,1 N dùng chuẩn độ bình thí nghiệm
- m: Lượng dầu dùng thí nghiệm (tính bằng gam)
- 100: Để tính trong 100 gam chất béo
3.3.3. Xác định ch s acid
Định nghĩa: Chỉ số acid là ố s miligam KOH cần th ế
i t để trung hòa hết n ữ h ng
acid béo tự do có trong 1 gam chất béo.
Nguyên tc: Người ta dùng KOH 0,01N để trung hòa các acid béo tự do có
trong chất béo dùng để phân tích với phenolphtalein làm chỉ thị màu.
Hóa cht - KOH 0,01N trong alcol - Alcol tuyệt đối - Ether ethylic
Tiến hành
Dùng 1 bình tam giác 100 mL cho vào 5 mL alcol tuyệt đối và 5 mL ether (theo
tỷ lệ 1:1) cho thêm vào bình này 2-3 giọt phenolphtalein và dùng KOH 0,01N trong
alcol để trung hòa hỗn hợp đến khi xuất hiện màu hồng lợt. Sau đó thêm vào hỗn hợp
vừa trung hòa 0,5 gam dầu. Đem hỗn hợp này trung hòa bằng KOH 0,01N trong alcol
cho đến khi có màu hồng bền vững sau 30 giây. Đọc thể tích KOH đã dùng trên buret.
Tính kết qu
Ta biết 1 mL KOH 0,01N tương ứng với 0,56 mg KOH
Chỉ số acid được tính theo công thức sau: a x 0,56 C a = m Trong đó: - Ca: Chỉ số acid - a : Số mL KOH 0,01N đ
ã dùng để trung hòa hỗn hợp có dầu
- m: Khối lượng dầu lấy làm thí nghiệm (tính bằng gam) 2 7
Giáo Trình Thc Tp Sinh Hóa
3.3.4. Xác định ch s peroxid
Định nghĩa: Chỉ số peroxid là số gam iod được giải phóng ra ở b i peroxid có trong 100 gam mẫu.
Nguyên tc: Trong không khí, các acid béo có trong chất béo, đặc biệt là các
acdi béo không no dễ dàng bị oxy hóa một phần tạo thành peroxid, gây ra hiện tượng
ôi hóa chất béo. Xác định chỉ số peroxid dựa trên phản ứng sau: H H H H R + KI + 2 CH C C R + I2 + 2 CH + H O 1 C C R2 3COOH R1 2 3COOK 2 O O O
Lượng iod giải phóng ra được ch ẩ
u n độ bằng dung dịch Na2S2O3 với tinh bột làm chỉ thị màu. Na2S2O3 + 2 I → 2 NaI + Na2S4O6
Hoá cht - Acid acetic đậm đặc - Cloroform - Dung dịch KI bão hòa - Dung dịch Na2S2O3 0,1 N
- Dung dịch hồ tinh bột 1%
Tiến hành
Cân chính xác khoảng 2 gam dầu cho vào bình tam giác 250 mL, thêm vào 10
mL dung dịch hỗn hợp acid acetic : cloroform (tỉ lệ 2: 1) và 1 mL dung dịch KI bão
hòa mới pha. Đậy nắp, lắc kỹ bình và để yên trong bóng tối 10 phút. Tiến hành chuẩn
bị mẫu đối chứng tương tự như mẫu thật, dùng 2 mL nước cất thay vì dầu.
Cho thêm 25 mL nước cất và t ế
i n hành định lượng iod giải phóng ra ằ b ng dung
dịch Na2S2O3 0,1N đến khi có màu vàng sậm rồi thêm 1 mL hồ tinh bột 1%. Nếu có
màu xanh xuất hiện thì tiếp tục chuẩn độ cho đến khi dung dịch mất màu.
Tính kết qu
Ta biết 1mL Na2S2O3 0,1N tương ứng 12,69 mg I2
Chỉ số peroxid được tính theo công thức sau: 0,01269 x ( a - b) x 100 Cp = m Trong đó: - Cp: Chỉ số peroxid
- a: Số mL Na2S2O3 0,1 N dùng chuẩn độ bình thử không
- b: Số mL Na2S2O3 0,1 N dùng chuẩn độ bình thí nghiệm
- m: Lượng dầu dùng thí nghiệm (tính bằng gam)
- 100: Để tính trong 100 gam chất béo
3.4. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LIPID THÔ BNG MÁY SOXHLET
Nguyên tc
Dựa trên khả năng hòa tan của lipid trong dung môi hữu cơ không phân cực,
dùng dung môi hữu cơ để trích lipid ra khỏi nguyên liệu đã được nghiền nhỏ. Trong
quá trình trích, các hợp chất tan được trong chất béo như các sắc tố, các vitamin tan
trong chất béo... cũng bị tách ra khỏi nguyên liệu. Do có lẫn các tạp chất khác, nên
thành phần trích ly được gọi là lipid tổng số hay lipid thô. 2 8
Giáo Trình Thc Tp Sinh Hóa
Có 2 phương pháp xác định:
- Phương pháp trực tiếp: Trích lipid ra khỏi nguyên liệu và cân lượng lipid được trích ly.
- Phương pháp gián tiếp: Xác định chênh lệch khối lượng nguyên liệu khô trước và
sau khi chiết xuất lipid ra khỏi nguyên liệu, từ đó suy ra khối lượng lipid trong mẫu phân tích.
Dng c, hóa cht - Bếp cách thủy - Tủ sấy - Cân phân tích
- Ether ethylic hoặc ether dầu hỏa.
- Bộ Soxhlet [gồm: bình cầu (a), trụ chiết (b) và ống sinh hàn (c)]. (Xem hình 3.1) Ống sinh hàn (c) Trụ chiết (b) Dung môi Bình cầu (a)
Hình 3.1. Hệ thống Soxhlet
Tiến hành
- Sấy khô nguyên liệu đã được nghiền nhuyển đến khối lượng không đổi. Cân
chính xác khoảng 5 gam nguyên liệu (sử dụng cân phân tích), cho vào túi giấy lọc đã
được sấy khô và biết khối lượng (Túi giấy phải có đường kính nhỏ hơn đường kính trụ
chiết và chiều dài ngắn hơn chiều cao của ông chảy tràn).
- Đặt túi giấy có chứa mẫu vào trụ chiết.
- Lắp trụ chiết vào bình cầu (đã được sấy khô và xác định khối lượng) và ắ l p ống sinh hàn.
- Cho dung môi vào trụ chiết sao cho một lượng dung môi chảy xuống khoảng ½
bình cầu và còn một lượng trên phểu chiết còn đủ ngập mẫu.
- Mở nước vào ống sinh hàn.
- Đặt hệ thống Soxhlet lên bếp cách thủy và điều chỉnh nhiệt độ sao cho chu kỳ
hoàn lưu của dung môi đạt từ 5 đến 8 lần trong một giờ. Chiết trong 8 –12 giờ cho đến
khi trích ly hoàn toàn chất béo. Thử thời điểm kết thúc quá trình trích bằng cách lấy
vài giọt ether từ đầu cuối trụ chiết cho lên đĩa kính đồng hồ sạch. Sau khi dung môi 2 9
Giáo Trình Thc Tp Sinh Hóa
bay hơi hết, trên mặt kính đồng hồ không để lại ế v t ầ
d u loang thì xem như lipid đã được chiết hoàn toàn.
- Sau khi chiết xong, lấy bình cầu và túi đựng mẫu ra, lắp ống sinh hàn vào bình
cầu mới và cất thu hồi ether.
Tính toán kết qu
Sấy bình cầu có chứa lipid đến khối lượng không đổi, cân xác định khối lượng.
Nếu chiết bằng ether ethylic thì sấy khô ở nhiệt độ 60- 70oC trong 30 phút, nếu chiết
bằng ether dầu hỏa thì sấy ở nhiệt độ 80- 90oC trong 45- 50 phút.
Hàm lượng lipid có trong 100gam nguyên liệu được tính theo công thức sau: (a - b) x 100 X = m Trong đó:
- X: hàm lượng lipid tính theo %
- a: khối lượng bình có chứa chất béo (g)
- b: khối lượng bình cầu ban đầu (g)
- c: khối lượng mẫu khan nư c ớ ban đầu (g)
3.5. CHIT TÁCH LECITHIN T LÒNG ĐỎ TRNG
Lecithin là lipid có chứa gốc phosphate (phospholipid), trong thành phần có
nhóm phân cực alcol amincholine.
Công thức cấu tạo của lecithin như sau: O CH O C (CH CH 2 2)14 3 O CH O C (CH2)7 CH CH (CH2)7 CH3 O CH3 CH O P O CH N+ CH 2 2 2 CH3 - O CH3
Tiến hành
Dùng 2 mL lòng đỏ trứng đã đánh nhuyễn cho vào 1 ống nghiệm 25 mL, thêm
vào ống nghiệm 10 mL alcol tuyệt đối, khuấy đều. Đặt ống nghiệm vào nồi đun cách
thủy ở 75 - 80OC, tiếp tục khuấy đều trong 10 phút (là thời gian để rút tách lecithin)
(Nếu lượng alcol bị bốc hơi thì ta cho tiếp vào đúng thể tích ban đầu). ọ L c hỗn hợp
trên qua ống nghiệm khô, dùng dung dịch chiết tiến hành thí nghiệm sau: Ống nghiệm Dung dịch 1 2 Dịch chiết 1 mL 1 mL Aceton 2 mL 0 mL Nước cất 0 mL 2 mL
Nhận xét hiện tượng, giải thích và kết luận. 3 0
Giáo Trình Thc Tp Sinh Hóa
CHƯƠNG 4. KHO SÁT VITAMI N 4.1. KHÁI QUÁT
Vitamin là những phân tử hữu cơ cần cho cơ t ể h sinh ậ
v t với một lượng rất nhỏ.
Tên gọi vitamin xuất hiện lần đầu tiên vào năm 1911 khi thiamine (vitamin B1) được nhận dạng.
Vitamin được chia thành 2 nhóm chính:
- Vitamin tan trong nước: Vitamin nhóm B, vitamin C, vitamin H
- Vitamin tan trong chất béo: Vitamin nhóm A, D, E, K, Q...
4.2. ĐỊNH TÍNH VITAMIN D
Các vitamin D là dẫn suất của các sterol. Khi được chiếu tia tử ngoại các sterol
sẽ có hoạt tính của vitamin D.
Nguyên tc: Khi đun nóng hỗn hợp vitamin D với hỗn hợp anilin và acid HCl đậm đ
ặc thu được chất lỏng có màu đỏ.
Tiến hành: Cho vào ống nghiệm dung dịch trích từ 2 viên dầu cá, thêm vào 2
mL hổn hợp anilin : HCl đậm đặc (theo tỉ lệ thể tích 15:1). Đun sôi ẫ m u nửa phút trên
đèn cồn. Quan sát sự chuyển đổi màu, giải thích, kết luận.
4.3. ĐỊNH TÍNH VITAMIN B1
Chun b dung dch vitamin B1: Giã 1 viên vitamin B1, pha với 5 mL nước
cất, lọc qua giấy lọc khô. Lấy dung dịch lọc tiến hành 2 thí nghiệm sau.
4.3.1. Phn ng to thiocrome
Nguyên tc: Khi oxy hóa cẩn thận trong môi trường kiềm, vitamin B1 ẽ s biến
đổi thành thiochrome, trong quá trình biến đổi có dạng keto của thiamine, coi như là sản phẩm trung gian. CH3 + CH2 N K N 3Fe(CN)6 NaOH CH CH OH 2 2 H S 3C N NH2 Thiamine CH CH 3 3 CH CH N 2 N 2 N -H2O N O CH CH2 CH2 OH 2 CH2 OH H S H C N N S 3C N NH2 3 Thiochrome
Thiocrome được tách bằng rượu isoamyl alcohol (isoamylic, isobutylic) tạo
võng huỳnh quang màu xanh tím phát quang khi chiếu tia tử ngoại. Cường độ của
huỳnh quang tỉ lệ với hàm lượng của thiocrome. Do đó phản ứng này còn được sử
dụng để định lượng vitamin B1 theo phương pháp huỳnh quang.
Hóa cht - Dung dịch NaOH 15% 3 1
Giáo Trình Thc Tp Sinh Hóa - Dung dịch K3Fe (CN)6 1% - Isoamylic
Tiến hành
Chuẩn bị các ống nghiệm theo bảng sau: Ống nghiệm 1 2 Hóa cht Dung dịch vitamin B1 2 mL 0 Nước cất 0 2 mL Dung dịch NaOH 15% 1 mL 1 mL K3Fe (CN)6 0,5 mL 0,5 mL isoamyl alcohol 2 mL 2 mL
Để yên khoảng 5 phút rồi quan sát. Sau đó tiếp tục quan sát dưới ánh sáng mặt
trời. Ghi nhận hiện tượng và kết luận.
4.3.2. Phn ng vi thuc th diazo
Nguyên tc: Trong môi trường kiềm thiamine phản ứng với thuốc thử diazo
(hỗn hợp acid sulfanilic và natri nitric) sẽ cho màu vàng cam hoặc đỏ. Màu là một hợp
chất phức tạp hình thành giữa thiamine và thuốc thử diazo.
Hoá cht
- Dung dịch acid sulfanilic 1% - Dung dịch natri nitric 5%
- Dung dịch natri carbonate 10%
Tiến hành
Cho các hoá chất lần lượt vào ống nghiệm theo trình tự sau: 0,5 mL dung dịch
vitamin B1 + 0,5 mL dung dịch acid sulfanilic 1% + 0,5 mL dung dịch natri nitric 5%
+ 10 giọt dung dịch natri carbonate 10%. Lắc đều ống ngh ệ
i m, quan sát màu, giải thích và kết luận.
4.4. ĐỊNH TÍNH VITAMIN B2
Nguyên tc: Vitamin B2 là dẫn xuất ribitol của isoalloxazine, nó có khả năng
phản ứng oxy hóa khử thuận nghịch. Vitamin B2 ở dạng oxy hóa (riboflavin) có màu
vàng, ở dạng khử (dihydroriboflavin) thì không màu. Người ta ử s dụng phản ứng này
để phát hiện vitamin B2. Phương trình phản ứng được trình bày như sau: CH2 (CHOH) CH 3 2OH CH2 (CHOH)3 CH2OH H N N O N N O H H 3C 3C +2H NH -2H NH H3C N H3C N O H O Riboflavin Dihydroriboflavin (maìu v ì a ng) (khäng maìu) 3 2
Giáo Trình Thc Tp Sinh Hóa
Khi cho HCl đậm đặc (hoặc acid acetic đậm đặc) và kẽm vào dung dịch vitamin
B2 thì hydro bay lên và dung dịch màu vàng sẽ mất màu.
Tiến hành
Giã một viên B2 cho vào 5 mL nước cất và lọc. Dùng 2 mL dung dịch lọc cho
vào ống nghiệm, cho thêm 1 mL HCl đậm đặc và một ít bột kẽm cho đến khi dung dịch mất màu
- Viết các phương trình phản ứng xảy ra.
- Giải thích và kết luận.
4.5.
ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN C
4.5.1.
Định lượng vitamin C theo phương pháp Muri
Vitamin C (acid ascorbic) C6H8O6 có 2 dạng đồng phân quang học D và L,
dạng D không có hoạt tính sinh học. Bài này khảo sát về L- acid ascorbic, acid này có
thể thấy ở dạng khử và oxy hóa. O C O C HO C - 2H O C O O HO C +2H O C H C H C HO C H HO C H CH CH2 OH 2OH
L – acid ascorbic L – acid dehydroascorbic
(dạng khử) (dạng oxy hóa)
Nguyên tc: Định lượng vitamin C dựa trên tính khử của nó đối với thuốc thử 2,6
dichlorophenol indophenol (DIP). Dạng oxy hóa của thuốc thử DIP có màu xanh bị
khử bởi acid ascorbic có trong dịch chiết của nguyên liệu thực ậ v t thành dung dịch
không màu. Ở điểm cân bằng tất cả acid ascorbic thì thuốc thử màu dư thừa không bị khử có màu hồng. OH O C O C O Cl Cl Cl Cl HO C O C O O +HCl HO C + O C + N NH H C H C HO C H HO C H CH2OH OH CH2OH O-(Na+)
L – acid ascorbic 2,6 - dichlorophenol 2,6 - dichlorophenol
(dạng khử) indophenol sodium (màu xanh) indophenol (không màu) 3 3
Giáo Trình Thc Tp Sinh Hóa
Trong môi trường acid thì thuốc thử 2,6 dichlorophenol indophenol có màu hồng. O O Cl Cl Cl Cl N + HCl N + NaCl O-(Na+) OH
Hoá cht - Dung dịch DIP 0,001N - Dung dịch acid oxalic 1% - Dung dịch HCl 1%
Tiến hành
Cân khoảng 5g trái cây (trái cốc, bưởi...) có chứa acid ascorbic đã được thái
nhỏ, chuyển sang cối sứ cùng với 20 mL HCl 1%, chắt lấy dịch ngâm giữ lại trong
cốc, đem phần thịt nghiền mịn, xong chuyển sang bình định mức 100 mL cùng với
dung dịch HCl 1% vừa chiết ra. Rửa cối và tráng dụng cụ ít nhất 3 lần, mỗi lần với một
ít acid oxalic 1% và cũng dồn vào bình định mức. Dùng acid oxalic để đưa thể tích lên
vạch 100 mL. Lắc kỹ, chuyển qua cốc khô 100 mL, để yên 15 phút rồi lọc qua giấy lọc khô.
- Tiến hành định phân mẫu đối chứng: ấ
L y 8 mL acid oxalic 1% 2 mL HCl 1%
cho vào bình tam giác dung tích 100 mL, dùng microburet với DIP 0,001N để chuẩn
độ đến lúc xuất hiện màu hồng bền sau ba mươi giây.
Lưu ý: Cần tiến hành định phân mẫu đối chứng và mẫu thật với 3 ầ
l n lặp lại để lấy kết quả trung bình.
- Chuẩn độ mẫu thật: Dùng pipet ấ
l y 10 mL dịch lọc chứa vitamin C cho vào
bình tam giác dung tích 100 mL, tiến hành chuẩn độ như mẫu đối chứng.
Tính kết qu
Số mg vitamin C trong 100g mẫu ậ v t được tính như sau:
(a b) x 0 , 0 88xVx100 X = vxm
a: Số mL trung bình khi định chuẩn mẫu vật
b: Số mL trung bình khi định chuẩn mẫu đối chứng.
0,088: số mg acid ascorbic tương đương với 1 mL dung dịch chuẩn DIP 0,001N
đã được định chuẩn bằng acid ascorbic chuẩn.
V: Thể tích dịch chiết ban đầu (ở đây là 100 mL)
v: Thể tích dung dịch chiết lấy để định chuẩn (10 mL)
m: Trọng lượng mẫu vật cân lúc đầu (tính bằng gam).
Lưu ý:
- Khi chuẩn bị mẫu vật, cân mẫu vật, ắ c t ẫ m u vật ( ằ b ng dao inox) và nghiền
mẫu vật cần tiến hành nhanh chóng trong một cối sứ HCl 1% (hoặc với HPO3 - 3 4
Giáo Trình Thc Tp Sinh Hóa
CH3COOH). Vì vitamin C rất dễ bị oxy hóa trong không khí, nhất là khi có sự hiện
diện của các ion kim loại (Fe, Cu).
- Sản phẩm có chứa Fe2+, Sn2+, Cu2+ sẽ cho ta những kết quả về số lượng acid
ascorbic cao hơn số lượng thật nếu ta dùng phương pháp này.
Ta có thể trắc nghiệm đơn giản để xem những ion có tính khử này có hiện diện
với những số lượng đủ để làm sai kết quả thực nghiệm :
+ Thêm 2 giọt dung dịch xanh methylene 0,05% (hòa tan trong nước) vào 10
mL của hỗn hợp mới điều chế gồm một t ể h tích dung dịch ẫ m u vật (chứa acid
ascorbic) và một thể tích dung dịch HCl 1% (hoặc H2PO3 - CH3COOH). Lắc đều, nếu
dung dịch xanh methylene bị mất màu trong 5-10 giây cho thấy có sự hiện diện của
các chất có tính khử trên.
+ Sn2+ không cho phản ứng với trắc nghiệm này và có thể được thử nghiệm n ư h
sau: Cho 10 mL dung dịch HCl: nước theo tỷ lệ 1:3 vào 10 mL dung dịch mẫu vật.
Thêm vào đó 5 giọt dung dịch carmin indigo 0,05% (pha với nước). Khuấy, nếu hỗn
hợp dung dịch bị mất màu trong 5-10 giây cho thấy sự hiện diện của Sn2+ hay những
chất có tính khử khác nói trên.
4.5.2. Định lượng vitamin C bng enzyme peroxidase
Vitamin C có thể bị oxy hóa bởi enzyme peroxidase. Dựa trên nguyên l ý này có
thể phát triển một phương pháp đ n
ị h lượng vitamin C bằng enzyme peroxidase. 4.5.2.1. Trích vitamin C
Cân 10g trái cây hoặc rau cải ví dụ như chanh rồi cho vào trong 20 mL dung
dịch đệm (pH 6,8) metaphosphoric acid 5%, sau đó nghiền mịn và lọc. Dung dịch chứa
vitamin C sau đó được nâng lên đến 100 mL trong bình định mức bằng dung dịch đệm trên.
4.5.2.2. Định lượng vitamin C
- Chuẩn bị dung dịch enzyme: 0,01g enzyme peroxidase được pha trong 5 mL
dung dịch đệm pH 6,8 và giữ trong nước đá.
- Chuẩn bị dung dịch vitamin C chuẩn 5mg/ 100 mL: 10 mg vitamin C (tinh
khiết) được pha trong dung dịch đệm pH 6,8 và nâng lên 200 mL trong bình định mức.
Sau đó được pha loãng thành 1, 2, 3, 4 mg/ 100 mL đ
ể thiết lập đường chuẩn.
Trước khi tiến hành đo mẫu chuẩn và mẫu thử thật, mẫu không sẽ được đo bằng
dung dịch đệm với bước sóng 265 nm. Mẫu chuẩn được chuẩn bị từ 1, 2, 3, 4, và 5
mg/100 mL. Mẫu dịch trích có thể được pha loãng thành 10, 20 hoặc 50 lần để dễ khảo
sát. Phản ứng được tiến hành theo trình tự cho các c ấ h t vào cuvette như sau:
- Tiến hành đo: Cho vào ống nghiệm 2,5 mL dung dịch đệm + 0,5 mL dung
dịch vitamin C chuẩn hoặc mẫu + 0,1 mL dung dịch enzyme peroxidase và đo độ hấp
thụ ở bước sóng 265 nm ta được giá trị Ai. Khi kết quả thể hiện sự ổn định trên đường
biểu diễn thì thêm vào 0,1 mL H đị đượ 202 và cho ổn
nh sau 1 phút, tiếp tục đo c giá trị
Af. Độ hấp thụ của mẫu khi đo là: ∆ A265 = Ai - Af
Hàm lượng mẫu thật sẽ được tính theo đư n
ờ g chuẩn và suy ra giá trị thật. 3 5