Tài liệu Thực hành Hóa Sinh Học | Đại học Nguyễn Tất Thành

SVTH: Văn Sỷ Tài; Nguyễn Thị Ngọc Quyên
BÀI 2: HÓA HỌC CHUYỂN HÓA LIPID VÀ ỨNG DỤNG
Thí nghiệm 2.1: Khảo sát tính hòa tan của lipid………………………...………….3
Thí nghiệm 2.2: Phản ứng xà phòng hóa……………………………….…………..4
Thí nghiệm 2.3: Sự nhũ tương hóa……………….……….………………….…….6
Thí nghiệm 2.6: Tìm các thể ceton trong nước tiểu…………………………..…….8
BÀI 3: HÓA HỌC CHUYỂN HÓA GLUCID VÀ ỨNG DỤNG
Thí nghiệm 3.1: Phản ứng Molish………………………...……………………....11
Thí nghiệm 3.2:Phản ứng Fehling…………………………….…………….…….13
Thí nghiệm 3.3: Phản ứng Seliwanoff (Đặc hiện cho cetose)……………….……16
Thí nghiệm 3.4: Thủy phân Saccharose……………………………………….….18
Thí nghiệm 3.5: Phản ứng màu polysacchrid (Tác dụng của Iod trên tinh bột)
………………………………………………………………………………...21
Thí nghiệm 3.7: Phản ứng Glucose trong nước tiểu (Phản ứng BENEDICT)…....23
BÀI 4: HÓA HỌC CHUYỂN HÓA PROTID VÀ ỨNG DỤNG
Thí nghiệm 4.1: Phản ứng Ninhydrin………………………………………….….26
Thí nghiệm 4.2: Phản ứng Biuret (Xác nhận các liên kết peptid)……….………..28
Thí nghiệm 4.3: Phản ứng tủa protein bởi nhiệt và môi trường acid yếu……..…..29
Thí nghiệm 4.4: Phản ứng tủa bởi acid mạnh và không đun nóng………………..31
Thí nghiệm 4.5: Tìm protein trong nước tiểu………………………..…………....32
Thí nghiệm 4.6: Định lượng Albumin trong huyết thanh (Phương pháp BIURET)
………………………………………………………………………….35
BÀI 5: HÓA HỌC CHUYỂN HÓA HEMOGLOBIN VÀ MỘT SỐ XÉT
NGHIỆM CHẨN ĐOÁN, THEO DÕI BỆNH GAN MẬT Page 1
SVTH: Văn Sỷ Tài; Nguyễn Thị Ngọc Quyên
Thí nghiệm 5.2: Phản ứng tìm sắc tố mật trong nước tiểu (Kỹ thuật FOUCHET)
……………………..………………………………………………...37
Thí nghiệm 5.3: Phản ứng tìm muối mật trong nước tiểu (Phản ứng HAY)
…………………………….…………………………………………….….40
Thí nghiệm 5.4: Phản ứng tìm máu trong nước tiểu (Phản ứng MAYER)……….41
Thí nghiệm 5.5: Định lượng GTP trong máu…………………………………..…43
BÀI 7: ĐỊNH LƯỢNG ACID URIC, URE, CREATININ TRONG MÁU VÀ
NƯỚC TIỂU SỬ DỤNG GIẤY NHÚNG NƯỚC TIỂU
Thí nghiệm 7.5: Phân tích nước tiểu bằng que thử 10 thông số trên máy tự động
CLINITEK 50……………………………………..………………………………46 Page 2
SVTH: Văn Sỷ Tài; Nguyễn Thị Ngọc Quyên
BÀI 2: HÓA HỌC CHUYỂN HÓA LIPID VÀ CÁC ỨNG DỤNG
THÍ NGHIỆM 2.1: KHẢO SÁT TÍNH HÒA TAN CỦA LIPID  Ý Nghĩa:
Khảo sát tính hòa tan của lipid trong dung môi phân cực và không phân cực.  Nguyên tắc:
Lipid thuộc nhóm các hợp chất không tan hoặc ít tan trong nước và dung môi
phân cực, dễ tan trong các dung môi hữu cơ (không phân cực) như: choloroform, methanol, benzene…
 Cách tiến hành: Cho vào 2 ống nghiệm các dung dịch sau: Dầu ăn Nước cất Ether (hay alcol) Ống 1 5 giọt 1ml - Ống 2 5 giọt - 1ml Lắc kỹ
 Hiện tượng, giải thích:
- Ống 1: dầu ăn không tan trong nước tạo thành các hạt nhũ tương.
 Vì dầu ăn (lipid) là chất không phân cực mà nước là dung môi phân cực nên dầu
ăn không tan trong nước tạo thành nhũ tương.
- Ống 2: dầu ăn tan trong alcol (ether).
 Vì dầu ăn (lipid) là chất không phân cực mà alcol (ether) là dung môi không
phân cực nên dầu ăn tan được trong alcol (ether). Page 3
SVTH: Văn Sỷ Tài; Nguyễn Thị Ngọc Quyên Nhũ tương Ống 1 Ống 2
THÍ NGHIỆM 2.2: PHẢN ỨNG XÀ PHÒNG HÓA  Ý Nghĩa:
Điều chế và tinh chế xà phòng  Nguyên tắc:
Khi đun nóng chất béo với dung dịch kiềm (NaOH hoặc KOH) thì tạo ra
glixerol và hỗn hợp muối của các acid béo. Phản ứng của chất béo với dung dịch
kiềm được gọi là phản ứng xà phòng hóa
 Cách tiến hành: * Cho vào bình nón:
- 1ml dầu ăn + 5 ml NaOH 10% trong alcohol. Đậy bằng phễu: Đun trên bếp điện
(có lót lưới amian) khoảng 5-10 phút, thỉnh thoảng lắc đều bình. Khi dầu tan hết
trong NaOH, lấy phễu ra, tiếp tục đun cho đến khô sẽ được xà phòng. Page 4
SVTH: Văn Sỷ Tài; Nguyễn Thị Ngọc Quyên
(Đun hỗn hợp trên bếp điện)
* Hòa tan xà phòng trong 10 ml nước, đun cho tan rồi chia ra 2 phần:
- Lấy 1 nữa (khoảng 5ml) cho vào ống nghiệm đun cách thủy, thêm vào 10 giọt
HCl đậm đặc, tiếp tục đun sẽ có phần đặc nổi lên trên và phần lỏng ở dưới.
(Đun cách thủy)
- Còn 1 nữa (khoảng 5ml) để lại làm phản ứng nhũ tương hóa.
 Hiện tượng và giải thích:
Dung dịch tách thành 2 lớp: phần đặc nổi lên trên là xà phòng và phần lỏng ở
dưới là tạp chất gồm Glycerol, NaCl…Việc cho HCl vào ống nghiệm nhằm trung
hòa lượng NaOH còn dư trong phản ứng xà phòng hóa. Page 5
SVTH: Văn Sỷ Tài; Nguyễn Thị Ngọc Quyên Xà phòng
Tạp chất (Glycerin, NaCl…)
 Phương trình phản ứng: dư
THÍ NGHIỆM 2.3: SỰ NHŨ TƯƠNG HÓA  Ý nghĩa:
Vai trò của muối mật trong tiêu hóa và hấp thu mỡ ở ruột.  Nguyên tắc:
- Nhũ tương là một hệ phân tán cao của hai chất lỏng mà thông thường không hòa tan được vào nhau.
- Nhũ tương dầu trong nước không bền để tạo độ bền cho nhũ tương có thể cho
thêm các chất hoạt tính bề mặt (chất nhũ hóa) như: xà phòng, muối mật, protein,
lecithin, Na2CO3… các chất này ngăn trở hỗn hợp lại tự tách ra thành các thành phần riêng lẻ.
- Các phân tử nước chỉ tạo thành các lực liên kết hiđrô trong khi các phân tử lipid
(mỡ) chỉ tạo thành các lực van der Waals. Chất nhũ hóa như xà phòng có thể liên kết các chất lỏng này. Page 6
SVTH: Văn Sỷ Tài; Nguyễn Thị Ngọc Quyên
 Cách tiến hành: Cho vào 3 ống nghiệm Nước cất Dầu ăn Na2CO3 10% Xà phòng Ống 1 10 ml 1 giọt 10 giọt - Ống 2 10 ml 1 giọt - 10 giọt Ống 3 10 ml 1 giọt - -
Lắc mạnh, để yên trong 5 phút  Hiện tượng:
- Ống 1: tách hạt nhỏ, khi cho Na2CO3 vào làm đục hỗn hợp dầu trong nước, kèm
theo hạt li ti bám vào thành ống nghiệm.
- Ống 2: dầu ăn không tan trong nước cất, cho xà phòng vào hỗn hợp 1 phần xà
phòng lắng xuống đáy, 1 phần nổi trên mặt nước. Page 7
SVTH: Văn Sỷ Tài; Nguyễn Thị Ngọc Quyên
- Ống 3: Dầu ăn không tan trong nước cất, kết cụm tạo thành các hạt nhũ tương không bền.  Giải thích:
- Dầu ăn (lipid) là chất không phân cực chỉ tan trong dung môi không phân cực, mà
nước là dung môi phân cực  nên dầu ăn không tan được trong nước tạo thành các hạt micelle.
* Muối mật có vai trò quan trọng trong tiêu hóa và hấp thu mỡ bởi vì:
Muối mật có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của các hạt mỡ trong thức ăn.
Các muối mật đóng vai trò như xà phòng (chất nhũ tương hóa) kết hợp với
các phospholipid làm vỡ các giọt mỡ trong quá trình nhũ tương hoá mỡ, tạo thành
các hạt micelle, nhờ đó hỗ trợ hấp thu mỡ.
THÍ NGHIỆM 2.6: TÌM CÁC THỂ CETON TRONG NƯỚC TIỂU  Ý nghĩa:
Ứng dụng phản ứng để tìm thể ceton trong nước tiểu  Nguyên tắc:
Natri nitroprussiat tác dụng với các chất ceton cho phức chất màu tím, phản
ứng này xảy ra trong môi trư H O ờng kiềm. - Ceton + Natri nitroprussiat phức chất có màu tím
 Cách tiến hành: Cho vào 1 ống nghiệm: - 10 giọt nước tiểu
- Acid acetic đậm đặc 2 giọt
- Natri nitroprussiat 10% 2 giọt Page 8
SVTH: Văn Sỷ Tài; Nguyễn Thị Ngọc Quyên
Trộn đều, nghiêng ống nghiệm 45°, nhỏ cẩn thận theo thành ống 15 giọt NH3
đậm đặc ( khoảng 0.5 ml). Sau vài phút, nếu có ceton sẽ thấy phần màu tím ở mặt phân cách hai dung dịch.  Hiện tượng:
-TH1: Không có ceton trong nước tiểu nên không có hiện tượng gì xảy ra
=> Phản ứng âm tính. (Âm tính)
- TH2: có thể ceton trong nước tiểu sẽ phản ứng natri nitroprussiat trong mồi
trường kiềm sẽ tạo ra phức màu tím ở mặt phân cách hai dung dịch
=> Phản ứng dương tính.  Giải thích:
Nguyên nhân chính dẫn đến sự hình thành ceton là do sự thiếu hụt insulin.
Thiếu insulin sẽ làm tăng các hocmon đối kháng với insulin như (glucagon,
cathecolamin, cortisol,…) Mặt khác, khi thiếu insulin sẽ ức chế quá trình tổng hợp
lipid, các glycerol của lipid sẽ chuyển thành glucose dẫn đến đường máu lại càng
tăng đồng thời kéo theo sự bài xuất thể ceton qua nước tiểu.
Trong điều kiện rối loạn chuyển hóa, acetyl coenzyme A cũng có thể tích tụ lại
để tạo thành những sản phẩm acid aceto acetic, acid hydroxybutyric và acetone, 3
chất này có tên chung là cetonic (thể cetone).  Biện luận:
- Bình thường không có các chất ceton trong nước tiểu - Có trong trường hợp: Page 9
SVTH: Văn Sỷ Tài; Nguyễn Thị Ngọc Quyên
+ Bệnh tiểu đường nặng hoặc điều trị bằng insulin không đủ liều, bệnh nhân đe dọa bị hôn mê.
+ Nhịn đói lâu, nôn nhiều
+ Vận động cơ nhiều, Cushing…
 Triệu chứng của bệnh đái tháo đường: - Rối loạn tri giác
- Khó thở, khát dữ dội, sụt cân nhiều - Da khô nhăn nheo
- Vết thương khó lành có thể hoại tử... (Bệnh gai đen) (Xơ cứng ngón tay) (Hoại tử) Page 10
SVTH: Văn Sỷ Tài; Nguyễn Thị Ngọc Quyên
BÀI 3: HÓA HỌC CHUYỂN HÓA GLUCID VÀ ỨNG DỰNG
THÍ NGHIỆM 3.1: PHẢN ỨNG MOLISH  Ý nghĩa:
Dùng để phân loại các nhóm cacbohydrat và phân biệt nhóm carbohydarat với
những chất khác dựa vào cường độ màu của chúng.  Nguyên tắc:
Các loại glucide đều cho phức màu tím với dung dịch naphtol trong acid sulfuric đậm đặc.  Thuốc thử: - Thuốc thử Molish
- Dung dịch naphtol 1% trong alcohol 90% Dung dịch Ống 1 Ống 2 Ống 3 Dung dịch glucide 1ml glucose 1% 1ml fructose 1% 1ml hồ tinh bột 1% Molish 3 giọt 3 giọt 3 giọt Lắc đều H2SO4 đậm dặc 1ml 1ml 1ml
 Cách tiến hành: Cho vào 3 ống nghiệm:  Hiện tượng:
- Ống 1,2,3: đều có phức màu tím.
- Cường độ màu của 3 ống fructose > glucose > hồ tinh bột. Page 11
SVTH: Văn Sỷ Tài; Nguyễn Thị Ngọc Quyên
(Thứ tự ống nghiệm từ trái qua phải) 
Giải thích và phương trình phản ứng:
- Do các glucose, fructose và hồ tinh bột dưới tác dụng của acid H2SO4 đậm đặc
chúng sẽ bị khử nước cho ra 5-hydroxymethyl furfural và các chất này trong môi
trường acid sẽ phản ứng thế thân điện tử trên α-Napthol và cho ra phức màu tím.
- Do fructose có cấu trúc vòng 5 cạnh nên trong môi trường acid đậm dặc dễ bị phá
vỡ tạo thành furfural, glucose có cấu trúc vòng 6 cạnh nên bền hơn còn hồ tinh bột
khá bền vì có liên kết α-1,4 glycozit. Page 12
SVTH: Văn Sỷ Tài; Nguyễn Thị Ngọc Quyên
THÍ NGHIỆM 3.2: PHẢN ỨNG FEHLING  Ý nghĩa
Được ứng dụng trong sinh hóa lâm sàng để kiểm tra nhanh lượng đường có
trong nước tiểu của bệnh nhân tiểu đường.  Nguyên tắc
Môi trường kiềm mạnh, các monosacarit ở dạng endiol không bền, dễ dàng khử
các kim loại nặng như Cu2+ , Ag+, Hg2+. Các nối đôi bị cắt đứt tạo những hỗn hợp đường - acid.  Thuốc thử:
Thuốc thử Fehling gồm 2 dung dịch Dung dịch A - CuSO4 kết tinh 35g - H2SO4 đậm đặc 5ml - Nước cất vừa đủ 1000ml Dung dịch B - KOH hoặc NaOH 135g - Natri kali tartrat 150g - Nước cất vừa đủ 1000 ml
 Cách tiến hành: Chuẩn bị 5 ống nghiệm: Page 13
SVTH: Văn Sỷ Tài; Nguyễn Thị Ngọc Quyên Dung Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5 dịch Fehling 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml lactose 0.5ml hồ saccharose glucose 1% fructose 1% 1% tinh bột 1% 1%
Đun sôi cách thủy 3 phút
 Hiện tượng, giải thích và phương trình phản ứng:
Khi trộn 2 dung dịch Fehling A và Fehling B với thể tích bằng nhau, natri kali
tartrat sẽ hòa tan tủa Cu(OH)2 do CuSO4 trong môi trường kiềm sinh ra. Tạo một
phức chất Cu2+ alcolat màu xanh thẫm, lần lượt cung cấp Cu2+ cho phản ứng oxy hóa khử nói trên.
- Ống 1,2: đều xảy ra kết tủa đỏ gạch nhưng ống 1 có kết tủa đậm hơn.
Glucose và frutose đều là monosacharid có –OH bán acetal  có tính khử. Mặt
khác, glucose có nhóm -CHO có tính khử mạnh hơn nhóm -C=O trong fructose
nên ống của Glucose có màu đậm hơn. Page 14
SVTH: Văn Sỷ Tài; Nguyễn Thị Ngọc Quyên
- Ống 3: có kết tủa đỏ gạch nhưng chậm hơn ống 1, 2 do lactose bị thủy phân
tạo ra 2 phân tử β-D-galactose và D-glucose có tính khử do có nhóm -OH bán acetal tự do ở C1. Lactose + H2O Galactose + Glucose β-D-Galactopyranose β-D-Glucopyranose
(Công thức cấu dạng của Lactose)
-Ống 4: không hiện tượng. Do saccharose không có nhóm –OH bán acetal để
chuyển thành aldehyde. Do đó không tác dụng được với thuốc thử Fehling.
(Công thức cấu dạng của saccharose)
- Ống 5: không hiện tượng. Do tinh bột là polysacchraide không có tính khử.
(Thứ tự ống nghiệm từ trái qua phải) Page 15
SVTH: Văn Sỷ Tài; Nguyễn Thị Ngọc Quyên
THÍ NGHIỆM 3.3: PHẢN ỨNG SELIWANOFF (Đặc hiệu cho cetose)  Ý nghĩa:
Phản ứng dùng để nhận biết đường aldose và đường cetose  N guyên tắc :
Fructose và những cetohexose khác tạo thành hydroxymethyl - furfural, khi đun
nóng với acid vô cơ, chất này tác dụng với resorcionl cho phức màu đỏ.
Các aldose cũng có thể tạo thành hydroxymetyl - furfural khi đún nóng với
acid, nhưng phản ứng xảy ra rất chậm, nên phản ứng Seliwanoff có tính đặc hiệu cho cetose.  Thuốc thử: Thuốc thử Seliwanoff
- Resorcinol (hay resorcin) 0,05 g - HCl pha loãng 1/3 100 ml
 Cách tiến hành: Lần lượt cho vào 2 ống nghiệm Seliwanoff Dung dịch đường Ống 1 1ml 0.5ml fructose 1% Ống 2 1ml 0.5ml glucose 1%
Đun sôi cách thủy 10 phút Page 16
SVTH: Văn Sỷ Tài; Nguyễn Thị Ngọc Quyên  H
iện tượng và giải thích:
- Ống 1: xuất hiện màu đỏ anh đào. Vì dưới tác dụng của HCl đặc và t° các cetol
hexose & ceto pentose tạo thành hydroxy methyl fufural & fufural. Các chất này
ngưng tự với resorxinol tạo sản phẩm ngưng tụ có màu đỏ anh đào.
- Ống 2: không hiện tượng. Các aldose cũng có thể tạo thành hydroxymetyl-
furfural khi đun nóng với acid, nhưng phản ứng xảy ra rất chậm.
 Phương trình phản ứng: Đỏ anh đào Page 17
SVTH: Văn Sỷ Tài; Nguyễn Thị Ngọc Quyên
Thí nghiệm 3.4: THỦY PHÂN SACCHAROSE  Nguyên tắc:
Saccharose không có tính khử, nhưng khi thủy phân bằng acid thì saccharose
biến thành D-glucose và D-fructose đều có tính khử.
(Công thức cấu dạng của saccharose)
 Cách tiến hành:
Tạo dung dịch thủy phân: Cho vào ống nghiệm 2 ml dung dịch saccharose 1%
và 4 giọt HCN 1N, đun sôi cách thủy 5 phút lấy dịch thủy phân này làm phản ứng Fehling và Seliwanoff
Tiến hành trên 4 ống nghiệm: Dung dịch thuốc thử Phản ứng Fehling Phản ứng Seliwanoff Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Thuốc thử Fehling 1ml 1ml - - Page 18
SVTH: Văn Sỷ Tài; Nguyễn Thị Ngọc Quyên Thuốc thử Seliwanoff - - 1ml 1ml Dịch thủy phân saccharose 0,5 ml - 0,5 ml - Dung dịch saccharose 1% - 0,5 ml - 0,5 ml Đun cách thủy 3 phút 10 hút
 Hiện tượng và giải thích:
- Ống 1: Tạo kết tủa màu đỏ gạch do khi thủy phân saccharose bằng acid tạo
thành Glucose và Frutose đều có tính khử nên phản ứng được với thuốc thử Fehing.
- Ống 2: Không hiện tượng. Do saccharose không có OH bán acetal nên không có
tính khử  Không phản ứng được với thuốc thử Fehling.
- Ống 3: Tạo kết tủa màu đỏ anh đào. Do khi saccharose khi thủy phân có tạo
thành Fructose (có gốc cetose).
- Ống 4: Tạo kết tủa màu đỏ anh đào. Do trong thuốc thử Saliwanoff có chứa 1/3
HCl pha loãng, trong điều kiện đung cách thủy 10 phút =>sacchrose bị thủy phân =>Tạo Fructose.
(Thứ tự ống nghiệm từ trái sang phải)
 Phương trình phản ứng:
 Thủy phân sacchrose: H+, to C12H22O11 + H2O C6H12O6 + C6H12O6 Saccharose Glucose Fructose Page 19
SVTH: Văn Sỷ Tài; Nguyễn Thị Ngọc Quyên
 Chuyển từ cetol
aldol trong mt kiềm
 Oxy hóa với thuốc thử Fehling: Đỏ gạch
 Phản ứng Saliwanoff:
THÍ NGHIỆM 3.5: PHẢN ỨNG MÀU POLYSACCHARID
(Tác dụng của Iod trên tinh bột)  Nguyên tắc: Page 20