Giáo trình Thực Hành Vi sinh | Trường Đại học Kinh Doanh và Công Nghệ Hà Nội

THỰC HÀNH VI SINH
Bài 1: Phương pháp khử trùng tiệt trùng trong phòng xét nghiệm
1. Các định nghĩa:
-Tiệt trùng (sterilization) là các biện pháp loại bỏ hoàn toàn hoặc phá hủy mọi
dạng sống của vi sinh vật (kể cả nha bào của VK).
- Khử trùng (disinfection) là quá trình loại bỏ hoàn toàn hoặc gần như hoàn toàn
vi sinh vật, trừ các dạng nha bào.
- Vô trùng (asepic) là một quá trình ngăn chặn hay dự phòng sự xâm nhập của
VSV đến các dụng cụ chuyên môn, tới phòng mổ, buồng tiêm, buồng thay băng,
buồng pha chế thuốc hoặc vết thương, vết mổ...
-Tẩy ếu là các biện pháp dùng hóa chất nhằm phá hủy VSV có trên đồ vật hoặc ngoại cảnh.
-Sát trùng (antiseptic) là dùng các hóa chất để diệt VSV, nhưng thực hiện trên tổ
chức sống (trên da, răng, miệng) và các hóa chất này tương đối ít độc hơn chất dùng để tẩy ếu.
- Làm sạch là quá trình loại bỏ hoàn toàn các chất ngoại lai ra khỏi dụng cụ,
thường được thực hiện bằng nước và xà phòng. Làm sạch được thực hiện trước
mọi quá trình khử trùng và tiệt trùng.
2. Tiệt trùng và các kỹ thuật tiệt trùng:
- Tiệt trùng là các biện pháp loại bỏ hoàn toàn hoặc phá hủy mọi dạng sống
của vsv (kể cả nha bào của vk)
- Các kỹ thuật tiệt trùng:
+ khí nóng khô (tủ sấy): dùng để tiệt trùng các dụng cụ mà ko thể cháy
được, thường là dụng cụ thủy tinh như ống nghiệm, ống hút...
+ nhiệt ướt dưới áp lực cao: là biện pháp thường được dùng tại các bệnh
viện, các phòng thí nghiệm và các cơ sở y tế để khử trùng dụng cụ kim
loại, cao su, nhựa, băng gạc, môi trường, hóa chất.
+ tia gamma: tiệt trùng các dụng cụ bông băng trong các túi đóng sẵn, chỉ katgu, catheter.
+ lọc vô trùng: dùng cho vacxin, huyết thanh và các dung dịch nhạy cảm nhiệt độ.
3. Các dụng cụ có thể dùng tủ sấy
• Là các dụng cụ không thể cháy được, thường là dụng cụ thủy tinh như:
ống nghiệm ống hút ….
4. Đường kính đĩa petri ? : đĩa petri dùng để nuôi cấy vi khuẩn , có các đường kính là 8cm , 10cm và 12cm
5. Ống đong có mấy loại dung tích ? : 100ml , 500ml và 1000ml
6. Có mấy loại que cấy ? Kể tên ? 3 loại
+ Que cấy móc : dùng cấy các loại nấm men , nấm mốc , xạ khuẩn
+ Que cấy thẳng : dùng cấy sâu hay thu lấy vsv trên môi trường đặc
+ Que cấy vòng : dùng cấy ria vsv trên mặt
7. Ống nghiệm có mấy loại dung tích?
+ Ống nghiệm dùng để chứa môi trường nuôi cấy và nuôi cấy vsv
+ Ống nghiệm có thể có đường kính 12mm, 14mm, 18mm
8. Có mấy cách cầm đĩa petri , ống nghiệm ?
- Đĩa petri: có 2 cách để đĩa petri :
+ Trên bàn: khi đĩa petri ko được gói để trên bàn thì nắp phải ở trên. Nếu để
đĩa lật ngược bụi hoặc vsv trong ko khí sẽ rơi vào khe giữa nắp và đĩa, vì
vậy có thể rơi vào môi trường nuôi cấy
+ Trong tủ ấm: đĩa petri được đặt ngược trong tủ ấm (nắp ở phía dưới) để
hạn chế sự bay hơi nước từ môi trường thạch
- Ống nghiệm : cách cầm ống nghiệm có 2 cách
+ Cầm ống bằng 3 ngón tay 1, 2, 3; thân ống nghiệm được giữ bằng 3 ngón
tay, đáy ống nghiệm đặt giữa lòng bàn tay.
+ Cầm bằng giữa 2 ngón tay 1 và 2, thân ống nghiệm kẹp giữa 2 ngón tay.
9. Kỹ thuật khử trùng
 Biện pháp vật lý:
+ Hơi nước nóng (luộc sôi) + Đốt + Tia cực tím UV
 Biện pháp hóa học + Cồn
+ Phenol và các dẫn xuất của phenol + Nhóm Halogen + Muối kim loại nặng + Aldehyd + Các chất oxy hóa + Acid và bazơ
10. Tầm quan trọng của thao tác vô trùng
Thao tác vô trùng là kĩ thuật quan trọng trong xét nghiệm VSV.
+ Không làm hỏng vật liệu xét nghiệm
+ Đánh giá được kết quả và làm đúng xét nghiệm
+ Không làm mất hoặc biến đổi VSV đang lưu giữ
+ Không làm ô nhiễm môi trường
+ Đảm bảo an toàn, không gây nhiễm trùng cho cán bộ y tế hoặc bệnh nhân
Bài 2: Các phương pháp chẩn đoán VSV bệnh nhiễm khuẩn
Có 2 phương pháp chẩn đoán VSV bệnh nhiễm khuẩn: chẩn đoán trực tiếp/ gián tiếp
1. Nguyên tắc: Là phương pháp tìm vi khuẩn gây bệnh trong cơ thể người bệnh
2. Các bước chính trong chẩn đoán trực tiếp: 4 bước + B1: Lấy bệnh phẩm
+ B2: Nhuộm, soi (chẩn đoán nhanh) + B3: Nuôi cấy + B4: Xác định
3. Bệnh phẩm là gì?
+ Bệnh phẩm là những vật phẩm có chứa vi khuẩn gây bệnh lấy từ người bệnh
+ Bệnh phẩm có thể là phân (ở các nhiễm khuẩn đường ruột), nước tiểu (ở các
nhiễm khuẩn đường tiết niệu), mủ (ví dụ ở vết thương), máu (ở các nhiễm khuẩn
máu), các chất dịch (VD dịch não tủy trong viêm màng não mủ ...)
4. Nguyên tắc khi lấy bệnh phẩm: 5 nguyên tắc
+ Đúng chỗ: Đúng vị trí có nhiều VK. Muốn vậy phải nắm được đường lan truyền
và đào thải của mầm bệnh, để quyết định lấy một hoặc một số bệnh phẩm.
+ Đúng lúc: Là thời điểm có nhiều VK trong bệnh phẩm
+ Trước khi dùng kháng sinh hoặc sau khi sử dụng kháng sinh 24h
+ Đảm bảo kĩ thuật vô trùng (Không gây nhiễm trùng cho người bệnh và không
đưa VK lạ vào bệnh phẩm)
+ Bệnh phẩm cần được chuyển nhanh nhất tới phòng xét nghiệm. Nếu cần phải
bảo quản bệnh phẩm ở môi trường và nhiệt độ thích hợp.
5. Ý nghĩa của nhuộm, soi (chẩn đoán nhanh)
+ Làm tiêu bản nhuộm từ bệnh phẩm để tìm VK, dựa vào: hình thể, tính chất bắt
màu, kích thước và cách sắp xếp; đánh giá các loại tế bào và mối quan hệ giữa
VK với các tế bào này (VK nằm trong hay ngoài tế bào)
Thường nhuộm đơn và nhuộm Gram.
+ Làm tiêu bản soi tươi bệnh phẩm để tìm VK dựa vào tính chất di động của nó.
 KQ nhuộm soi thường chỉ có giá trị chẩn đoán sơ bộ và định hướng cho nuôi cấy.
6. Trình bày bước nuôi cấy trong chẩn đoán trực tiếp
 Phân lập: Là tách biệt Vk gây bệnh từ bệnh phẩm. Tùy loại bệnh phẩm và
loại vi khuẩn mà người ta sử dụng môi trường phân lập thích hợp (thường là môi trường thạch)
Dựa vào tính chất khuẩn lạc (hình dáng, màu sắc, độ lớn) hoặc/và tính chất
nuôi cấy khác mà nhận biết, tách biệt được VK cần tìm thành dòng và vi khuẩn thuần nhất.
 Tăng sinh: Đối với bệnh phẩm có ít VK (Vd: Máu), người ta phải tăng sinh
bằng cấy vào môi trường kích thích sự phát triển.
7. Bước xác định: Phải dựa vào nhiều đặc điểm khác nhau để xác định vi khuẩn
+ Xác định tính chất sinh vật hóa học
+ Xác định tính chất kháng nguyên
+ Xác định tính chất ly giải bởi phage
+ Xác định khả năng gây bệnh thực nghiệm
8. Chẩn đoán gián tiếp: Là phương pháp tìm kháng thể trong huyết thanh người bệnh
9. Nguyên tắc chẩn đoán gián tiếp: Dựa vào kháng nguyên (mẫu) đã biết trước
và bằng các phản ứng kết hợp kháng nguyên – kháng thể. Thông qua sự có mặt
của kháng thể mà KL sự có mặt của kháng nguyên – VK gây bệnh.
10. Các bước tiến hành chẩn đoán gián tiếp: 2 bước
+ Bước 1: Lấy bệnh phẩm: lấy máu tĩnh mạch (khoảng 3ml) cho vào ống nghiệm
khô; để máu đông; ly tâm lấy huyết thanh, xử lý 56 độ/30ph
Lấy mẫu 2 lần: Lần I vào những ngày đầu của bệnh; lần II sau lần I từ 7-10 ngày
+ Bước 2: Làm phản ứng huyết thanh
11. Tại sao phải lấy máu 2 lần , lần 2 cách lần 1 : 7 – 10 ngày ?
Phải lấy máu 2 lần để xác định sự gia tăng HGKT lần 2 so với lần 1 , nếu
HGKT2/HGKT1 >= 2 thì mắc bệnh
12. Ý nghĩa của HGKT (hiệu giá KT)? ĐLKT (động lực KT)
+ HGKT : được tính là độ huyết thanh pha loãng nhất mà ở đó phản ứng kết
hợp kháng nguyên – kháng thể còn xảy ra ( + )
+ ĐLKT : so sánh HGKT của 2 mẫu huyết thanh lần 1 và lần 2 để tìm ĐLKT.
ĐLKT là sự gia tăng HGKT lần II so với lần I, ít nhất là gấp 2 lần. Khi có ĐLKT
thì kết luận ng bệnh bị nhiễm khuẩn
13. Thế nào là hiệu giá giới hạn ?
+ Hiệu giá giới hạn là hiệu giá mà với nồng độ phản ứng dương tính bằng
hoặc/và cao hơn được khẳng định bệnh nhân bị bệnh
Bài 3: Sử dụng kính hiển vi trong nghiên cứu VSV
1. Có mấy loại vật kính
Vật kính có nhiều loại nhưng thông thường có 2 loại
• Vật kính thường : độ phóng đại nhỏ ( 4x, 10x,...) khi dùng vật kính
thường không cần dầu soi
• Vật kính dầu: độ phóng đại lớn ( 90x, 100x, 150x) khi sd cần có dầu soi kính
2. Tại sao phải nhỏ dầu khi soi vật kính dầu
• Vì dầu có độ chiết quang n=1.51( dầu bách hương ) ( bt ko có dầu thì ánh
sáng đi qua lam kính có độ chiết quang n=1.52 sau đó ra không khí lại có n=1
nên tia sáng bị khúc xạ nên mắt ta ko quan sát được tiêu bản ) => ánh sáng ko
bị khúc xạ nên ta nhìn thấy tiêu bản ( giải thích cho việc soi vật kính dầu mà không nhỏ dầu)
• Vật kính dầu có độ phóng đại lớn
Bài 4: Hình thể vi khuẩn
1. Các bước tìm vi trường
- Nhỏ 1 giọt dầu lên tiêu bản đặt lên mâm kính , tiêu bản phải nằm sát mặt
mâm kính và được giữ chắc
- Xoay vật kính dầu về đúng hãm
- Nhẹ nhàng hạ vật kính ( hoặc nâng mâm kính , tùy loại kính hiển vi ) để vật
kính và tiêu bản sát nhau . Trong lúc làm công việc này, mắt ko nhìn vào thị
kính mà nhìn vào khoảng cách giữa vật kính và tiêu bản để tránh làm vỡ tiêu
bản. Tuy nhiên để biết vật kính đã chạm vào tiêu bản hay chưa , chủ yếu dựa vào cảm giác của tay
- Điều chỉnh ánh sáng :
+ Nâng tụ quang lên hết mức + Mở hết chắn sáng + Bỏ lọc sáng
+ Dùng gương lõm và điều chỉnh để ánh sáng tập trung vào tụ quang
- Mắt nhìn vào thị kính , xoay ốc đại cấp, làm thật chậm và đều khi thấy hình
ảnh thì dừng ngay rồi điều chỉnh ốc vi cấp
2. Các bước soi tiêu bản – cách soi tiêu bản ?
- Mắt nhìn vào thị kính
- Một tay cầm ốc vi cấp để điều chỉnh cho hình ảnh luôn nét, tay kia vặn xe đẩy
để chuyển dịch vị trí quan sát
- Soi một cách tuần tự theo đường “ dích dắc ”
- Khi nhìn thấy vi khuẩn, xác định : hình thể , tính chất bắt màu , sắp xếp. 3. Nhuộm gram
 Tại sao bắt màu
+ Do cấu trúc và thành phần hóa học của vách TB vi khuẩn
+ Nhờ bản chất lý hóa của vách ,phức hợp tím-iodine(có trong dung dịch
Lugol) gắn rất chặt vào vách TB vi khuẩn gram +, nhưng lại gắn không chặt vào vi khuẩn gram –
+ Vách của TB vi khuẩn gram+ bị giảm tính thấm đối với các phân tử nhỏ
sau khi được xử lý bằng cồn có nồng độ cao, điều đó ngăn cản tác dụng tẩy màu của cồn.
+ Vách TB vi khuẩn gram- chứa nhiều lipid nên cồn đi qua dễ dàng.  Cố định
+ cố định bằng hóa chất: nhỏ dd cố định phủ lên nơi dàn đồ phiến hoặc
ngâm lam kính vào trong dd cố định với thời gian thích hợp.
+ cố định bằng nhiệt: lam kính được đưa qua đưa lại cắt ngang ngọn đèn
cồn 3-4 lần cho nhiệt độ lên khoảng 80° C
 Tác dụng của cố định
+ gắn chặt vk vào lam kính + giết chết vk
+ chuẩn bị cho vk bắt màu tốt hơn
4. Tại sao lại làm khô tự nhiên?
Làm khô tự nhiên thì vk sẽ gắn vào lam kính mà ko bị biến dạng. Nếu tiêu bản
chưa khô mà làm bước tiếp theo thì vk sẽ bị trôi mất (nếu cố định bằng hóa
chất) hoặc bị biến dạng(nếu cố định bằng nhiệt).
5. Có mấy hóa chất nhuộm đơn,nhuộm gram: - Nhuộm đơn: + xanh methylen + đỏ fuchsin + tím gentian - Nhuộm gram: + tím gentian + dd Lugol + cồn 90° + đỏ fuchsin
6. Chỉ tiêu tiêu bản đẹp là gì?
- Mật độ vk vừa phải,đều
- Hình thể vk rõ ràng, ko bị biến dạng - Vk bắt màu đúng
- Tiêu bản ko có cặn bẩn, sáng, dễ xem.
7. Tại sao phải nhuộm đơn trước
Vì nhuộm đơn để cố định hình thể, kích thước và cách sắp xếp của các VK
8. Các bước nhuộm đơn và nhuộm gram ?
- Nhuộm đơn : sau khi đã cố định tiêu bản :
+ Nhỏ thuốc nhuộm ( xanh methylene , đỏ fuchsin .. ) phủ kín dàn đồ phiến
+ Sau 1 phút đổ thuốc nhuộm , rửa tiêu bản bằng nước
+ Chờ khô , nhỏ dầu , soi
- Nhuộm gram : sau khi tiêu bản đã cố định
+ Nhỏ dd tím gentian , phủ kín nơi dàn đồ phiến , duy trì 1 – 2 phút
+ Đổ dd tím gentian , rửa tiêu bản bằng nước sạch
+ Nhỏ dd lugol , để 30 giây
+ Đổ dd lugol , rửa nước
+ Tẩy cồn 90° , 3 – 5 giây , rửa nước
+ Nhỏ dd đỏ fuchsin , để 1 – 2 phút
+ Rửa nước , đợi khô , nhỏ dầu , soi
9. Các bước xác định kích thước vi khuẩn ?
Đơn vị đo độ lớn của vi khuẩn thường dùng là micromet
- Nếu KHV có gắn thước đo : ta điều chỉnh chiều cần đo của vi khuẩn nằm dọc
theo thước, sẽ biết kích thước chính xác của hình ảnh vi khuẩn
- Nếu KHV ko có thước đo :
+ Phải ước lượng kích thước đúng của hình ảnh vi khuẩn hoặc vật thể trên vi trường
+ Khi đã biểt kích thước hình ảnh vi khuẩn , ta tính kích thước thật như sau :
Kích thước thật = Kích thước h/ả vi khuẩn trên vi trường / ( Độ phóng đại của thị
kính × Độ phóng đại của vật kính )
10. Lau vật kính dầu và điều chỉnh các bộ phận về tư thế nghỉ
- Nâng vật kính hoặc hạ mâm kính để tiêu bản tách ra khỏi vật kính
Chú ý không nâng vật kính lên quá cao hay hạ mâm kính xuống quá thấp
- Nhấc tiêu bản ra khỏi mâm kính
- Xoay vật kính đến vị trí dễ lau nhất, dùng khăn sạch tẩm xylen vừa ẩm, lau
khẩu kính đến khi có cảm giác trơn là được.
- Điều chỉnh các bộ phận của kính hiển vi về tư thế hợp lý (Tư thế nghỉ)
- Lau bụi hoặc hơi nước rồi chụp khăn phủ kính hoặc đặt kính vào hộp có chất hút ẩm
11. Trong nhuộm gram bước quan trọng nhất là: tẩy màu(nhỏ cồn 90°)
Giải thích: tẩy màu ko đúng thì màu của vk Gram+ và Gram- có thể giống nhau
Bài 5: Điều chế môi trường nuôi cấy vi khuẩn. Các kĩ thuật cấy cơ bản
1. Định nghĩa môi trường nuối cấy VK
- Là hỗn hợp các chất đạm, đường, muối khoáng và các vitamin thích hợp
nhằm đảm bảo cho sự phát triển của VK
2. Các loại môi trường 2.1. Dựa vào thành phần
+ MT tự nhiên: là môi trường chứa các chất tự nhiên không xác định được
số lượng thành phần như: cao thịt, pepton, cao nấm men
+ MT tổng hợp: là môi trường được điều chế từ các chất hóa học tinh
khiết, xác định và được lấy với những nồng độ cho trước
+ Mt bán tổng hợp: là môi trường trong đó có một số chất tự nhiên không
xác định được thành phần, số lượng và các chất hóa học đã biết thành phần và số lượng. 2.2.
Dựa vào trạng thái vật lý
+ MT lỏng: VD môi trường canh thang, nước pepton
+ MT nửa lỏng nửa đặc (Môi trường thạch mềm): có 0.3-0.5% thạch và
thường được sử dụng để quan sát khả năng di động của VSV.
+ MT đặc: có 1.5 – 2% thạch, tùy vào chất lượng thạch, ví dụ môi trường
thạch thường, thạch máu. 2.3. Dựa vào công dụng
+ MT cơ bản: là mt mà phần lớn các vk có thể phát triển trong mt này và
là nguyên liệu cơ bản để điều chế các mt khác
VD: thạch thường, canh thang
+ MT vận chuyển và bảo quản bệnh phẩm: bệnh phẩm ko có điều kiện
cấy ngay vào mt nuôi cấy mà phải vận chuyển đi xa với một tgian nhất
định,bệnh phẩm phải đc bảo quản trong mt vận chuyển để chuyển về phòng xét nghiệm.
VD: MT vận chuyển đối với vi khuẩn đường ruột là MT Cary-Blair
+ MT tăng sinh: sử dụng trong TH vi khuẩn trong bệnh phẩm quá ít VD: MT Mueller – Kauffman
+ MT phân lập: phân lập nhằm mục đích tách vk cần tìm ra khỏi bệnh
phẩm có lẫn các tạp khuẩn.
VD: MT Endo, McConkey, DLC phân lập VK đường ruột; Chapman phân
lập tụ cầu, Schoer phân lập VK bạch hầu
+ MT xác định tính chất sinh vật hóa học: sử dụng để phân biệt giữa loài VK này với loài VK khác VD: MT Ure Indol, Kligler
3. Phân biệt môi trường thạch thường , thạch mềm và canh thang
- Thạch thường : là môi trường đặc , có 1,5 – 2% thạch
- Thạch mềm : nửa lỏng nửa đặc , có 0,3 – 0,5% thạch
- Canh thang : là môi trường lỏng
4. Các bước điều chế môi trường nuôi cấy: 10 bước
- Bước 1: Chuẩn bị dụng cụ - Bước 2: Cân đong - Bước 3: Hòa tan
- Bước 4: Điều chỉnh pH - Bước 5: Làm trong
- Bước 6: Đóng môi trường vào ống hoặc bình nhỏ
- Bước 7: Tiệt trùng môi trường
- Bước 8: Đổ ra đĩa môi trường
- Bước 9: Kiểm tra vô trùng
- Bước 10: Bảo quản môi trường
5. Điều chỉnh pH môi trường
- Mỗi loại Vk chỉ phát triển tối ưu ở độ pH nhất định, vì vậy khi điều chế môi
trường phải điều chỉnh pH thích hợp
- Việc điều chỉnh pH của môi trường được tiến hành ở nhiệt độ 45-50 độ C
nhằm mục đích: pH môi trường sau khi hấp và để nguội không bị thay đổi nhiều
- Hóa chất sử dụng để điều chỉnh pH là dung dịch NaOH 10-12% và HCl 10- 12%
6. Tiệt trùng môi trường nuôi cấy
- Phải tiệt trùng ngay sau khi đóng môi trường vào ống hoặc vào bình, vì nếu
để lâu, các tạp khuẩn gặp nhiệt độ thích hợp sẽ phát triển làm ảnh hưởng
đến chất lượng môi trường
- Các môi trường có urê, hyposulfit dễ bị phân hủy bởi nhiệt độ cao, phải tiệt
trùng bằng lọc Seitz hoặc hấp cách thủy ở nhiệt độ 60-70 độ C
- Các môi trường thông thường khác thường được tiệt trùng ở nhiệt độ 120 độ C trong 30 phút
Sau khi tiệt trùng, áp suất trong lò giảm xuống bằng áp suất bên ngoài thì
chuyển môi trường ra khỏi lò, không nên để môi trường hâm nóng lâu trong
lò, vì như vậy môi trường sẽ bị sẫm màu và kém chất lượng
7. Kiểm tra vô trùng: Môi trường được để vào tủ ấm qua đêm để kiểm tra vô trùng
(3-5% số lượng đã sản xuất)
8. Bảo quản môi trường
Nếu môi trường chưa được sử dụng, chúng ta có thể bảo quản trong túi chất
dẻo để ở nhiệt độ 4 đến 10 độ C và dùng dần trong 1 đến 2 tháng (Nếu ở nhiệt
độ phòng thì chỉ để được 1-2 tuần)
Bài 6: Kháng sinh đồ 1. Định nghĩa:
- Kháng sinh đồ là kĩ thuật xác định độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh
nhằm giúp thầy thuốc chọn được kháng sinh thích hợp và biết liều lượng
thích hợp dùng trong điều trị.
2. Có mấy kỹ thuật kháng sinh đồ
Có 2 kỹ thuật: + Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán (Định tính)
+ Kỹ thuật kháng sinh pha loãng (Định lượng)
3. Điều kiện thực hiện kháng sinh đồ  Vi khuẩn:
+Chủng phải thuần nhất, đã được phân lập từ người bệnh và xác định là tác nhân gây bệnh
+ Đang trong giai đoạn phát triển mạnh và được pha thành huyền dịch có mật
độ nhất định và được dàn đều trên mặt thạch
 Môi trường: Thạch Mueller – Hinton
Yêu cầu + Độ dày 4,0 ± 0,5 mm.
+ Đảm bảo dinh dưỡng và vô trùng
+ Mặt thạch phải khô trước khi cấy vi khuẩn
 Khoanh giấy kháng sinh
Yêu cầu + Phải đủ hoạt tính
+ Được bảo quản lạnh 2-8 độ C để dùng hàng ngày, -20 độ C để sử dụng lâu hơn
4. Cách chọn kháng sinh
- Chọn được KS thích hợp cho điều trị cần phải đặt nhiều khoanh giấy , mỗi
khoanh giấy thấm 1 KS với hàm lượng nhất định. Mỗi nhóm VK cần đặt những KS ưu tiên
Chọn kháng sinh: mỗi loại kháng sinh có phổ tác dụng nhất định với từng loại vi
khuẩn. Vì vậy mỗi loại vi khuẩn sẽ được thử với một số loại kháng sinh nhất
định. Các kháng sinh này được chọn theo tài liệu hướng dẫn của CLSI (Bảng
hướng dẫn lựa chọn kháng sinh)
5. Mục đích làm KS đồ
Là xác định độ nhạy cảm của VK với KS nhằm giúp thầy thuốc chọn được KS
thích hợp và biết liều lượng thích hợp dùng trong điều trị
6. Môi trường làm KS đồ là mt nào : Thạch Mueller- Hinton là mt tốt nhất để làm KS đồ
7. Đk để làm khoanh giấy kháng sinh chú ý điều gì
- Mỗi nhóm vk cần đặt những kháng sinh ưu tiên (hàng đầu) và 1 số kháng sinh
khác thay thế hoặc nhằm mục đích nghiên cứu. - Yêu cầu: + phải đủ hoạt tính
+ được bảo quản lạnh 2-8°C để dùng hàng ngày,-20°C để dùng lâu hơn
- điều kiện nuôi cấy: thường ở 35°C,khí trường thường và 18-24h (đối với vk
hiếu khí hoặc hiếu kị khí tùy tiện,dễ nuôi cấy)
8. Cách thực hiện KGKSKT
- Ria vi khuẩn: Trong vòng 15 phút sau khi điều chỉnh độ đục, dùng que tăm
bông vô trùng nhúng vào canh khuẩn, xoay tròn tăm bông vài lần rồi vắt bớt
nước bằng cách ép vào thành ống. Dùng tăm bông vạch ngang 2 lần vuông
góc trên mặt đĩa thạch. Sau đó ria tăm bông đều lên mặt thạch.
- Đặt khoanh giấy kháng sinh: Dùng kim đầu nhọn đặt khoanh giấy cho tiếp
đều lên mặt thạch. Khoảng cách giữa 2 khoanh tối thiểu 20mm, cách thành
đĩa tối thiểu 10mm. Vậy một đĩa thạch đặt tối đa khoảng 5-6 khoanh
- Đặt vào tủ ấm, để nhiệt độ phù hợp và đọc kết quả sau khoảng 18-24 giờ
9. Nguyên lý kỹ thuật kháng sinh pha loãng
- Kháng sinh được hòa đều vào trong môi trường nên tại bất kỳ điểm nào
nồng độ kháng sinh cũng như nhau
- Kháng sinh được pha loãng thành nhiều nồng độ khác nhau ( thường pha
loãng theo cấp số nhân của 2, vd 1, 2, 4, 8, 16, 32 ...µg/ml; sau đó cấy một
lượng vi khuẩn như nhau cho mỗi nồng độ kháng sinh
- MT nuôi cấy là Mueller – Hinton, có thể sử dụng môi trường lỏng hoặc đặc.
Nếu VK phát triển được trong môi trường có kháng sinh thì chứng tỏ chúng
đề kháng với nồng độ kháng sinh ấy. 10. MIC là gì?
-Là nồng độ kháng sinh thấp nhất ức chế được sự phát triển của 1 lượng vk nhất định
- Đọc kết quả của kĩ thuật kháng sinh pha loãng:
+ Nếu vk phát triển được trong mt có kháng sinh thì chứng tỏ chúng đề
kháng với nồng độ kháng sinh ấy
+ Xác định MIC => biết MIC sẽ biết liều lượng kháng sinh thích hợp để điều trị cho từng vk gây bệnh
11. Tác dụng của MIC:
MIC là nồng độ kháng sinh thấp nhất ức chế được sự phát triển của một lượng
vk nhất định=> biết MIC sẽ biết liều lượng kháng sinh thích hợp để điều trị cho từng vk
12. Loại vk nào cần dùng KSĐ:
- Loại vk mà đề kháng với nhiều kháng sinh=> cần làm kháng sinh đồ để tìm kháng sinh nhạy cảm.
Bài 7: Xét nghiệm phân
1. Chỉ định xét nghiệm phân
- Rối loạn tiêu hóa: sốt, nôn, đau bụng, đi ngoài nhiều lần trong ngày, đi trong nhiều ngày
- Không rối loạn tiêu hóa: nghi ngờ người lành mang chủng
2. Quy trình xét nghiệm phân (Chẩn đoán trực tiếp)
- Bước 1: Lấy, bảo quản và vận chuyển bệnh phẩm phân
- Bước 2: Xét nghiệm trực tiếp + Quan sát đại thể + Nhuộm đơn, gram + Soi tươi
 Chẩn đoán sơ bộ, định hướng nuôi cấy - Bước 3: Nuôi cấy
+ Tìm Vk thuộc họ đường ruột: DCA, EMB, Mac, Endo
+ Tìm tả: thạch kiềm, pepton kiềm, TCBS
37 độ C / 24h -> tìm khuẩn lạc
- Bước 4: Đọc kết quả + TCKN (kháng nguyên) + TCSVHH (sv hh)
3. Lấy bệnh phẩm phân
- Đúng chỗ: lấy phân từ trực tràng/ lấy phân đã đi ra ngoài ra dụng cụ sạch - Đúng lúc:
- Trước khi dùng kháng sinh hoặc sau khi sử dụng kháng sinh 24h
- Đảm bảo kĩ thuật vô trùng (Không gây nhiễm trùng cho người bệnh và
không đưa VK lạ vào bệnh phẩm)
- Bệnh phẩm cần được chuyển nhanh nhất tới phòng xét nghiệm. Nếu thời
gian chờ đợi hoặc vận chuyển bệnh phẩm qua 2h thì phải cho vào môi
trường vận chuyển ( thường dùng là MT Cary – Blair)
4. Trong phân có những loại vk: salmonella, shigella, E.coli, tả
5. Mt nuôi cấy phân tìm vk tả: mt pepton kiềm,thạch kiềm,TCBS
6. Mt cấy phân: DCA, XDL, Endo, EMB, thạch MacConkey, pepton kiềm, thạch kiềm, TCBS
7. Triệu chứng bệnh tả:
- Tiêu chảy, mất nước, buồn nôn và ói mửa
- Bị động kinh, hôn mê sâu - Thay đổi tri giác
8. Môi trường nuôi cấy vsv đường ruột:
- mt ức chế chọn lọc: DCA, XDL, Endo (có đường lactose và chỉ thị màu giúp phân biệt vk lên men)
- mt không có chất ức chế: EMB và thạch MacConkey
9. MacConkey là mt gì
- là mt ko có chất ức chế
- chỉ gồm thạch MacConkey và nước cất
Bài 8: Xét nghiệm máu
1. Chỉ định xét nghiệm máu
- Phải chỉ định cấy máu
- Bệnh nhân có các triệu chứng: sốt, ớn lạnh, lạnh run, tiếng thổi tim nghi ngờ
viêm nội tâm mạc, có xuất huyết ở da hay niêm mạc, xuất huyết dạng sao trên móng tay, choáng.
2. Kể tên các VK là nguyên nhân gây nhiễm khuẩn huyết:
Tụ cầu vàng, liên cầu, phế cầu, não mô cầu, Salmonella, trực khuẩn mủ xanh,...
3. Quy trình xét nghiệm máu
 Bước 1: Lấy bệnh phẩm: máu
- Đúng chỗ: máu tĩnh mạch
- Đúng lúc: khi BN ớn lạnh hay lạnh run trước khi sốt, hoặc lúc đang sốt
- Trước khi BN dùng kháng sinh - Vô khuẩn - Vận chuyển
Thể tích máu chiếm 1/10 tối đa 1/5 thể tích môi trường Người lớn: 5-10 ml Trẻ em: 3-5 ml
Có thể lấy nhiều lần trong ngày, lấy trong nhiều ngày
 Bước 2: Cấy máu tăng sinh (Cấy máu tại giường)
- Tăng sinh vi khuẩn trong bệnh phẩm
- Môi trường: BHI, TSB, columbia -> nhiều dinh dưỡng
- 35-37 độ C / 24h -> 15 ngày -> Quan sát chai cấy máu hàng ngày
- Có dấu hiệu khuẩn mọc tiến hành cấy phân lập ngay
 Bước 3: Cấy phân lập trên môi trường đặc: MT thạch máu, socola, Mac 37 độ /24h
 Bước 4: Nhuộm gram từ khuẩn lạc mọc được
 Bước 5: Xác định + TCKN + TCSVHH
4. Theo dõi chai cấy máu:
- Chai cấy máu được ủ trong tủ ấm 35-37°C và theo dõi mỗi ngày trong 5-7
ngày xem có dấu hiệu vk mọc không:
+ có hạt đóng trên mặt hồng cầu + đục đều hay có màng + tan huyết + đông huyết tương + có gas
+ có hạt trắng trong lớp hồng cầu
- Đối với chai cấy máu 2 pha:
+ Trước khi ủ và mỗi ngày sau khi quan sát mặt thạch của pha đặc xem có khóm vk mọc hay không
+ nếu ko có khóm vk mọc trên pha đặc=> tráng pha lỏng lên pha đặc.
+ Bất cứ lúc nào có dấu hiệu vk mọc hay nghi ngờ vk mọc thì tiến hành cấy
phân lập ngay đồng thời nhuộm gram khảo sát trực tiếp.
• nếu kq nhuộm gram thấy có vk,có thể làm KSĐ trực tiếp từ chai cấy máu. • nếu
trên pha đặc có vk mọc thì tiến hành định danh và làm KSĐ ngay
- Sau 5 ngày theo dõi chai cấy máu,phải cấy truyền mù một lần nữa để chắc chắn không có vk mọc.
5. Khi ăn xong có nên lấy máu? Có
Giải thích: lấy máu có thể là làm chẩn đoán gián tiếp hoặc cấy máu. Cả 2 kỹ
thuật đều ko bị ảnh hưởng gì.
6. Tại sao lại cấy máu tại giường
• Tránh nhiễm trùng chéo (môi trường bệnh viện có nhiều nguy cơ gây nhiễm trùng )
• Sức khỏe bệnh nhân yếu
7. Mt cấy máu: BHI,TSB,thạch máu,thạch nâu