Thực Hành Vi Sinh Vật Học: Phương Pháp Kiểm Soát VSV trong PTN Môn Hóa sinh học | Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh

1. Trình bày các phương pháp vật lý, hóa học để kiểm soát VSV trong PTN PP Vật Lý: NHIỆT ĐỘ CAO:
+ Nhiệt ẩm: Xử lý ở nhiệt độ thấp hơn, thời gian ngắn hơn pp nhiệt khô => Làm đông tụ và biến tính protein.
Tro hóa: Đốt bằng lửa hoặc thiết bị điện => Đốt cháy.
Lò nung/Tủ sấy: 180oC - 30 min => Đông tụ protein.
+ Nhiệt khô: Nhiệt độ trung bình đến cao => Làm mất nước, biến đổi cấu trúc protein, tro hóa, phá vỡ màng tb.
Nồi cao áp: Hơi nước ở áp suất cao => tiệt trùng 121oC - 15psi - 1,055kgf/cm2 - 15 phút.
PP Tyndal: Hơi nước không áp suất, dùng cho các vật không chịu hấp áp cao. Hấp 30-60P, 70-80oC, ủ 24h, lặp lại 3 ngày. Đun sôi: Khử trùng.
Thanh trùng: 65oC - 30 min LTLT (Low Temperature Long Time) => Thanh trùng theo mẻ.
70oC - 15 sec HTST ( High Temperature Short Time) => Thanh trùng nhanh. NHIỆT ĐỘ THẤP:
Kìm hãm VSV => Làm chậm các quá trình sinh học của tế bào => Ức chế sự sinh trưởng.
Làm lạnh/Mát: 0-15oC hoặc đông lạnh < 0oC.
=> Được sử dụng để bảo quản. LÀM KHÔ:
Loại bỏ dần nước khỏi tế bào => Ức chế chuyển hóa => Ức chế sinh trưởng.
Sấy thăng hoa: Loại nước ở điều kiện đông lạnh => ứng dụng để bảo quản (Trái cây sấy,…). CHIẾU TIA BỨC XẠ: + Bức xạ ion hóa:
Tia gamma, tia X, tia âm cực: Năng lượng cao, xuyên thấu mạnh, làm electron rời khỏi quỹ đạo.
=> Tiệt trùng dụng cụ, hóa chất,… + Bức xạ không ion hóa:
Tia UV: Khả năng xuyên thấu kém, cần tiếp xúc trực tiếp bề mặt => Cản trở quá trình sao chép. LỌC:
Loại bỏ VSV dựa vào kích thước lỗ lọc.
Thẩm thấu ngược - Nồng độ chất tan cao (nước dơ) => Thấp (nước sạch) => Lọc chủ động. PP Hóa học:
- Chất sát khuẩn ngoài da: xà phòng, cồn, iode, phẩm màu (phần lớn phẩm màu có tác dụng sát khuẩn như: xanh methylene).
- Chất diệt khuẩn và tẩy uế: phenol, formol, hợp chất clor…
2. Các bước sử dụng nồi hấp cao áp:
B1: Kiểm tra và cho nước cất vào nồi ngoài đến ~2/3 cột thủy tinh.
B2: Khóa van cấp nước, van thông hai nồi và van xả.
B3: Bật công tắc điện và chờ áp suất nồi ngoài đạt 15psi ≈ 1.034bar ≈ 1.055kgf/cm2 (121°C).
B4: Xếp vật cần khử trùng vào nồi inox và cho vào autoclave.
B5: Đậy kín nắp nồi (vặn khoá theo từng cặp đối xứng).
B6: Mở từ từ van thông hai nồi để dẫn hơi nước vào nồi trong.
B7: Khi áp suất nồi trong đạt 15psi, mở từ từ van xả đến mức ≈1/3 để đẩy không khí từ nồi trong ra ngoài.
B8: Quan sát, ghi nhận quá trình đuổi khí trong khoảng 3-5 phút, sau đó đóng van xả.
B9: Khi áp suất nồi trong đạt 15psi ≈ 1.034bar ≈ 1.055kgf/cm2, 121°C, bắt đầu tính thời gian theo từng yêu cầu tiệt trùng cụ thể.
B10: Khi đã đủ thời gian → khóa van thông hai nồi → mở từ từ van xả đến mức 1/2.
B11: Khi áp suất nồi trong trở về 0psi ≈ 0bar ≈ 0kgf/cm2, mở khóa nồi theo từng cặp đối xứng để lấy sản phẩm đã tiệt trùng.
B12: Tắt công tắc điện nếu không dùng tiếp.
3. Nguyên tắc phối chế và các bước tạo môi trường nuôi cấy rắn/lỏng trong đĩa/bình/ống nghiệm.
❖Đĩa Petri chứa môi trường dinh dưỡng VÔ TRÙNG.
Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: Cao thịt-Peptone (CP), pH ~7.0.
Môi trường nuôi cấy nấm: Potato Glucose/Dextrose Agar (PGA), pH ~6.0.
• Bình chứa môi trường → HẤP TIỆT TRÙNG 121oC - 15psi - 15 phút.
• Đĩa Petri gói giấy báo → SẤY TIỆT TRÙNG 180oC - 30 phút.
• Phân phối môi trường vào Petri (Thao tác vô trùng – PP đổ đĩa).
❖Ống nghiệm chứa môi trường dinh dưỡng (thạch nghiêng) VÔ TRÙNG.
• Nấu môi trường sao cho agar tan hoàn toàn.
• Phân phối vào ống nghiệm (~7ml/ON).
• HẤP TIỆT TRÙNG 121℃- 15psi - 15 phút. CÁC BƯỚC:
- Cân (5g-PGA, 3,3g-CP cho 100mL) => Hòa tan với nước trong bình chứa => Đậy nút bông, buộc thun miệng
bình => HẤP TIỆT TRÙNG.
Đĩa peptri gói giấy báo => SẤY TIỆT TRÙNG.
Thao tác vô trùng (đèn cồn), ghi thông tin. Phân phối.
- Ống nghiệm: Cân => Hòa tan => Phân phối vào ống nghiệm => HẤP TIỆT TRÙNG => Để nghiêng.
4. Trình bày các phương pháp nuôi cấy VSV:
 Cấy vào môi trường lỏng.
 Cấy vào môi trường ống nghiệm nghiêng.
 Cấy vào môi trường ống nghiệm đứng.
 Cấy vào môi trường đĩa peptri.
5. Trình bày vai trò của các thành phần cấu tạo KHV quang học. Hệ thống giá đỡ: - Bệ đỡ.
- Bàn tiêu bản là nơi đặt mẫu vật.
- Kẹp tiêu bản giữ mẫu vật cố định trên bàn để quan sát.
Hệ thống phóng đại:
- Thị kính là thấu kính hội tụ có tiêu cự ngắn, dùng để quan sát ảnh thật được tạo ra bởi vật kính. Thị kính có
thể là ống đơn hoặc ống đôi.
- Vật kính, quay về phía mẫu vật, là thấu kính hội tụ có tiêu cự ngắn, tạo ra ảnh thật của mẫu vật. Vật kính
thường có ba mức độ phóng đại chính: x10, x40 và x100.
Hệ thống chiếu sáng:
- Nguồn sáng: đèn LED
- Màn chắn, đặt trong tụ quang, điều chỉnh lượng ánh sáng đi qua mẫu vật.
- Tụ quang tập trung ánh sáng vào mẫu vật và có thể được điều chỉnh lên xuống để thay đổi độ sáng.
Hệ thống điều chỉnh:
- Núm chỉnh tinh (ốc vi cấp) và núm chỉnh thô (ốc vĩ cấp) điều chỉnh khoảng cách giữa vật kính và mẫu vật.
- Núm điều chỉnh tụ quang và núm điều chỉnh độ tập trung ánh sáng tối ưu hóa hệ thống chiếu sáng.
- Núm điều chỉnh màn chắn sáng kiểm soát lượng ánh sáng đi qua mẫu vật.
- Núm di chuyển bàn sa trượt (theo bốn hướng: trước, sau, trái, phải) giúp người dùng dễ dàng quan sát toàn bộ mẫu vật.
Sử dụng vật kính x100 cần lưu ý: Khi quan sát xong cần dùng vải mềm hoặc giấy lau kính hiển vi chuyên dụng
chùi sạch lớp dầu soi trên vật kính x100. Không để dầu soi dính vào các vật kính còn lại. Ánh sáng sử dụng phù hợp.
Kính nên để ở một vị trí cố định và hạn chế di chuyển
Chỉ bật đèn sử dụng khi cần thiết. Hạ tụ quang kính xuống khi không dùng.
6. Trình bày phương pháp làm tiêu bản giọt ép.
Dùng miếng Lam sạch cho 1 giọt nước cất lên mặt Lam => Cho mẫu vào giọt nước và tán đều => Đậy Lamen.
(Tránh bọt khí, dùng que cấy hoặc ống hút).
- Đặc điểm có thể đánh giá: Khả năng di động, hình dạng tế bào, cách sắp xếp - Tế bào nảy chồi, chồi, phân
nhánh, vách ngăn, bào tử, cuống sinh bào tử.
7. Trình bày mục đích và cơ sở phương pháp nhuộm Gram.
Mục đích: Phân loại vi khuẩn Gram (+) và Gram (-). Cơ sở:
 Vi khuẩn Gram dương: Có vách tế bào dày, chủ yếu là các lớp peptidoglycan.
 Vi khuẩn Gram âm: Có vách tế bào mỏng, nằm giữa 2 lớp màng ngoài và màng trong.
8. Những biến đổi sau từng bước nhuộm Gram. Các Bước: TẠO VỆT BÔI
B1: nhuộm tím tinh thể -1 phút. Rửa H2O.
Cả hai vách tế bào đều bắt màu tím của thuốc nhuộm.
B2: Cố định màu với Lugol - 1 phút. Rửa H2O.
Giúp cố định màu, giữ tím tinh thể dính chặt với vách tế bào. (tím đen)
B3: Tẩy màu với cồn 96o - 10 giây. Rửa H2O.
Thuốc nhuộm bị rửa trôi.
Gram (+) do vách tb dày => màu nhuộm bám chặt, nhiều. (tím)
Gram (-) bị cồn hòa tan mất lớp màng ngoài lipid, lipopolysacharide - Vách mỏng, không giữ màu => mất màu.
B4: Nhuộm Safranin - 1 phút. Rửa H2O.
Gram (+) Không bắt màu vì peptidoglycan đã liên kết hết với tím tinh thể. (Tím).
Gram (-) Peptidoglycan không màu, bắt màu với Safranin => màu hồng, cam,…
Làm khô-Nhỏ dầu soi-Quan sát ở x1000.
Có thể đánh giá: TK G(+), TK G(-), CK G(+). Cách sắp xếp.
9. Các bước phân lập VSV.
- Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật ban đầu
- Phân lập các vi sinh vật thuần khiết
- Kiểm tra độ tinh khiết của vi sinh vật