Đánh Giá Hàm Lượng Lipid và Đạm | Thực tập hóa học phân tích | Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

BÀI 1
ĐÁNH GIÁ SỰ OXY HÓA CHẤT BÉO BẰNG PHƯƠNG PHÁP SO MÀU QUANG PHỔ I. Đường chuẩn PV A. Chuẩn bị hóa chất
1. Pha HCL 0.24 M từ HCL đậm đặc: Hút 40 µL dd HCL đđ cho vào 1960 µL nước cất.
2. NH4SCN 30%: Cân 0.9 g NH SCN 4
cho vào 3 ml nước cất. (Lưu ý: Cân trực tiếp vào cốc thủy tinh).
3. Dung dịch sắt III: Fe3+ (1mg/mL). 1mL Fe3+ = 4.83 mg FeCl3.6H O 2
Sau đó, pha loãng dd Fe3+ trên ra 100 lần để được dd Fe3+ (10µg/mL).
Hút 50µL Fe3+ (1mg/mL) cho vào 4950 µL dd Chlorofom: Methanol (2:1). Ta được 5 mL dd Fe3+ (10µg/mL).
B. Làm đường chuẩn
1. Chuẩn bị 7 ống nghiệm + nắp.
2. Hút dung dịch cho đường chuẩn theo bảng sau: µg Fe3+/mL V Fe3+ V Chlorofom: V HCL V NH SCN 30% 4
(10µg/mL) µL Methanol (2:1) 0.24M 0 0 µL 4900 µL 50 µL 50 µL 0.2 100 4800 50 50 0.4 200 4700 50 50 0.8 400 4500 50 50 1 500 4400 50 50 1.5 750 4150 50 50 2 1000 3900 50 50 4 2000 2900 50 50
3. Đem đi Vortex khoảng 15s và đo độ hấp thu quang phổ ở bước sóng 480 nm. II. Chuẩn bị mẫu
1. Cân 5g cá đã xay nhỏ cho vào ống Fancol 50 mL, cho thêm 20 mL dd Chlorofom :
Methanol (2:1), và lắc mẫu 3h bằng máy lắc.
2. Sau khi lắc mẫu xong, dùng muỗng vớt bỏ phần cái, phần dd chuyển sang ống Fancol
15 mL để ly tâm với tốc độ 4000 vòng/ phút ở 25 C trong 5p. o 1
3. Hút lấy phần dd phía dưới ống sang ống Fancol 15 mL khác để chuẩn bị cho các phân tích sau.
III. Phân tích mẫu 1.
Chuẩn bị hóa chất. Pha dd Fe2+:
Hòa tan 50 mg FeSO4 trong 5 mL nước cất trong ống Fancol 5 mL
Hòa tan 40 mg BaCL cho vào ống Fancol trong 5 mL nước cất. 2
Sau đó, đổ ống BaCL2 vào
ống FeSO4, hút 200 µL HCL cho
vào ống, Vortex khoảng 20s
rồi ly tâm 4000 rpm ở 25oC trong 5p. 2. Phân tích
Bước 1: Hút 1 mL mẫu vào từng ống nghiệm.
Bước 2: Hút 3.9 mL dd Chloroform: Methanol (2:1) cho vào từng ống nghiệm. Riêng đối
với mẫu trắng thì hút 4.9 mL.
Bước 3: Hút 50 µL dd Fe2+ vừa pha cho vào từng ống nghiệm.
Bước 4: Hút 50 µL dd NH4SCN 30% cho vào từng ống nghiệm. Dd có màu hồng.
Bước 5: Vortex 15s và đo độ hấp hu quang phổ ở 480 nm.
Lưu ý: Dd Fe2+ chỉ pha và sử dụng trong ngày.
Bước 6: Xác định hàm lượng béo giống như đối với TBA. IV. Tính kết quả
Khi có giá trị OD, thay vào pt đường chuẩn tìm x (ug Fe3+/mL)
Sau khi tính x, ta tính PV như sau:
PV (mmol Fe3+/kg) = (x*5)/(55.84*béo*2)
BÀI 2 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITƠ FORMOL I. NGUYÊN LÝ: 2
Các axit amin trong dung dịch nước thì trung tính, không những do 2 nhóm hóa chức
axit (-COOH) và amin (-NH2) trung hoà lẫn nhau mà còn do cả 2 nhóm hóa chức ấy đều
yếu, qúa trình điện ly rất kém. Khi gặp formol nhóm NH kết hợp với formol thành nhóm 2
metylenic N-CH2 mất tính kiềm, do đó tính axit của COOH nổi bật lên và được định
lượng bằng một kiềm với phenolphtalein làm chỉ thị màu.
R - CH - COOH + HCHO R -CH -COOH + H 2 O NH2 N= CH2 II. HÓA CHẤT: - Formalin - NaOH 0,1 N - Phenolphtalein 1% III.TIẾN HÀNH
Do dung dịch formol để lâu thường bị oxy hóa có tính axit nên ta cần điều chế dung dịch formol trung tính.
Điều chế dung dịch formol trung tính. Cho vào bình tam gíac : 30 ml formol 30 ml nước cất 3 giọt phenolphthalein 3
Thêm từng giọt NaOH 0,1 N lắc đều đến khi dung dịch có màu hồng nhạt.
Chuẩn bị mẫu và định phân (chuẩn độ).
Cho vào bình tam giác (100 mL) 0.2 ml
nước mắm 100% (chưa pha) 4 giọt phenolphtalein 20 ml formol vừa trung hòa
Lắc đều và định phân bằng NaOH 0,1 N cho đến màu đỏ tươi
e. Tính kết quả
Hàm lượng nitơ formol tính bằng g/l 0,0014 * * 1000 v 100 X= * = 0.2 100
v: Thể tích NaOH 0,1 N dùng để định phân (chuẩn độ). IV. PHÚC TRÌNH: - Các bước tiến hành - Kết quả thu được BÀI 8
PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TVB-N (TỔNG NITƠ BASE BAY HƠI)
Cân 5 g± 0,1g mẫu cho vào ống chưng cất (ống nghiệm Kjeldah) của thiết bị chưng
cất. Cho vào ống 2 g MgO (Magnesium oxide) và 50 mL nước cất vào ống (cho nước vào từ
từ để tránh đóng cục cơ thịt cá lại). Lắp ống Kjeldah vào hệ thống chưng cất. Cho 25 mL 4
acid Boric 1% vào bình tam giác 250 mL và lắp hệ thống vào máy chưng cất. Sau đó tiến
hành chưng cất ngay trong thời gian là 5 phút. Chuẩn độ:
Cho từng giọt dung dịch H2SO4 0,1N từ ống buret vào bình tam giác và lắc đều, nhẹ
đến khi dung dịch chuyển từ màu xanh sang màu xám.
Tính kết quả: mg N/100g = [(ml * N * 14.01) / g] * 100 Trong đó:
ml = ml H2SO4 dùng để chuẩn độ
N = nồng độ của H2SO4 dùng để chuẩn độ g
= khối lượng của mẫu (10g)
14.01: khối lượng phân tử của Nitrogen
Bài 9 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA nguyên liệu chế biến thủy sản
và sản phẩm BÀI 9: XÁC ĐỊNH ẨM ĐỘ VÀ TRO 1. Mục đích :
Tạo điều kiện cho sinh viên làm quen với các thao tác và dụng cụ ở phòng thí nghiệm
cũng như hiểu rỏ và làm quen với phương pháp xác định thành phần ẩm độ và tro của sản phẩm thủy sản. 2.
Dụng cụ -Hoá chất:
- Tủ sấy điều chỉnh được nhiệt độ (1000C - 1050C)
- Cân phân tích chính xác đến 0,0001 g - Cốc cân - Tủ nung
- Cốc chịu nhiệt, các dụng cụ thuỷ tinh khác 3.
Nguyên vật liệu:
Mẫu Cá, tôm và mực tươi nguyên liệu. 5 A. XÁC ĐỊNH ĐỘ ẨM 1. Định nghĩa
Độ ẩm (thuỷ phần) là phần trăm nước tự do có trong thực phẩm. Định lượng nước
bằng phương pháp sấy khô 2. Nguyên lý
Dùng nhiệt làm bay hết hơi nước trong thực phẩm. Cân trọng lượng thực phẩm trước
và sau khi sấy khô, từ đó tính ra phần trăm nước có trong thực phẩm. 3. Tiến hành thử
Cho vào cốc nhôm cân 2-10 g mẫu đã chuẩn bị sẵn, nghiền nhỏ. Tất cả được cân bằng cân phân tích.
Cho tất cả vào tủ sấy ở nhiệt độ 100 C - 105 0
0C , sấy khô đến trọng lượng không
đổi, thời gian tối thiểu là 6 giờ. Trong suốt thời gian sấy, có thể dùng đũa thuỷ tinh nghiền
nhỏ các phần vón cục, sau đó lại dàn đều và tiếp tục sấy.
Sấy xong đem làm nguội ở bình hút ẩm 25-30 phút và đem cân bằng cân phân tích.
Cho lại vào tủ sấy 100 C - 105 0
0C trong thời gian 30 phút, lấy ra để nguội trong bình
hút ẩm và cân như trên cho đến khi khối lượng không đổi. Kết quả giữa hai lần cân liên tiếp
không được cách nhau 0,005 g cho mỗi gam mẫu thực phẩm. Tính kết quả: X =
(G1−G2)*100 (%) G1−G Trong đó:
G: trọng lượng của cốc nhôm cân tính bằng gam
G1: trọng lượng của cốc cân và mẫu trước khi sấy, tính bằng gam
G2: trọng lượng của cốc cân và mẫu sau khi sấy, tính bằng gam 6
Sai lệch kết quả giữa hai lần cân xác định song song không được lớn hơn 0,5 %. Ghi chú:
- Đối với mẫu có nhiều chất béo, HÀM lượng nước nhiều (>30%), sấy mẫu ở 600C trong 24 giờ
hoặc phương pháp sấy chân không ở nhiệt độ thấp (60 C) hay sấy lạnh Cốc cân có thể là cốc 0
sứ, cốc thuỷ tinh hay cốc nhôm
Bài 10 XÁC ĐỊNH TRO TOÀN PHẦN
Một vài khái niệm:
Tro là thành phần còn lại của thực phẩm sau khi nung cháy hết các hợp chất hữu cơ.
Tro thật sự là muối khoáng của thực phẩm. Vì vậy khi cần xác định muối khoáng của
thực phẩm ta phải loại trừ các tạp chất đất, cát và những chất không phải là muối khoáng
nhưng không bị nung cháy ở nhiệt độ qui định. Tro toàn phần (tro tổng số) bao gồm tro thật
sự và tro tạp chất (cát sạn không phải là muối khoáng)
a. Nguyên lý: đun 550-600 C nung cháy hoàn toàn các hợp chất hữu cơ phần còn lại 0
đem cân và tính ra hàm lượng tro toàn phần của thực phẩm. b. Tiến hành
Cho vào cốc nhôm cân 2- 10 g mẫu đã chuẩn bị sẵn, nghiền nhỏ. Tất cả được cân
bằng cân phân tích. Đốt mẫu ở 270oC để loại bỏ bớt một phần vật chất hữu cơ. Sau đó cho
tất cả vào tủ sấy ở nhiệt độ 550-600 C, đến trọng lượng không đổi. Thời gian tối thiểu là 0
6-7 giờ. Có thể lấy mẫu đã sấy khô và thực hiện nung tro
c. Tính toán kết quả:
Hàm lượng tro toàn phần tính theo công thức 7 G −G 2 100 (%) Ttf =  G1 −G
Trong đó: G: khối lượng của cốc nung(g)
G1: khối lượng của cốc nung và mẫu trước khi nung (g)
G2: khối lượng của cốc nung và tro trắng sau khi nung đến khối lượng không đổi. Phúc trình:
- Nêu các yếu tố dẫn đến sai số trong phân tích ẩm và tro
- Tính toán kết quả thu được
Chú ý: Khi cốc nung còn nóng để nguội trong bình hút ẩm, nhớ để hé nấp vài giấy hoặc
mở nồi thoáng không khí trên nắp bình, tránh hiện tượng không khí nóng giản nở đẩy nắp làm vỡ. BÀI 11
XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LIPID TRONG SẢN PHẨM THỦY SẢN 1. Mục đích :
Tạo điều kiện cho sinh viên làm quen với các thao tác và dụng cụ ở phòng thí nghiệm cũng
như hiểu rỏ và làm quen với phương pháp xác định hàm lượng lipid trong các sản phẩm
thủy sản (mẫu cá). Phương pháp Shoxlet chỉ chiết được lipid dự trữ triglyceride 2.
Dụng cụ -Hoá chất: - Giấy lọc
- Cân phân tích chính xác đến 0,0001 g
- Cốc cân đáy bẹt có nắp kín 8
- Đũa thuỷ tinh một đầu dẹp, dài 5 cm
- Dung dịch Eter dầu hoả - Hệ thống Soxhlet 3.
Nguyên vật liệu: Mẫu cá đã sấy khô 4. Tiến hành 4.1. Nguyên lý
Chiết xuất lipid bằng eter dầu hỏa. Làm bay hơi hết dung môi, cân lipid, từ đó tính ra hàm
lượng lipid có trong 1 g thực phẩm. 4.2. Tiến hành - Cân giấy lọc
- Cân mẫu cá: 0.5-2 g - Gói mẫu và giấy.
- Sấy gói mẫu, cân nóng
- Lắp vào hệ thống Soxhlet để chiết béo bằng eter dầu hỏa trong 4-5h.
- Lấy mẫu ra sấy trong 5-24h, cân nóng và tính kết quả KẾT QUẢ:
Hàm lượng chất béo trong thực phẩm (P1- P2) 100 X = G 9
P1: Khối lượng giấy lọc + mẫu trước khi qua Sohxlet (g)
P2: Khối lượng giấy lọc + mẫu sau khi qua Sohxlet (g)
G: Trọng lượng chất thử (g) Phúc trình:
- Nêu các lưu ý dẫn đến sai số trong khi phân tích chất béo
- Tính toán kết quả thu được
………………………………………………………… BÀI 12
XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐẠM TỔNG TRONG NGUYÊN
LIỆU CHẾ BIẾN THỦY SẢN.
1. Mục đích:
Tạo điều kiện cho sinh viên làm quen với các thao tác và dụng cụ ở phòng thí nghiệm cũng
như hiểu rỏ và làm quen với phương pháp xác định hàm lượng đạm tổng trong các sản phẩm thủy sản.
2.Dụng cụ và hóa chất
- Máy công phá và chưng cất đạm.
- Ống Kjeldahl, dung tich100, 250mL.
- Bình định mức dung tích 100 mL.
- Ống đong dung tích 10, 100 mL. - Thìa nhựa. - Bếp điện. 10
- Cân phân tích có độ chính xác 0,001g.
- Acid sunfuric (H2SO4) đậm đặc và dung dịch 0.1N.
- Natri hydroxit (NaOH), dung dịch 40%. - Acid boric
- Chỉ thị hỗn hợp: 200mg đỏ metyl và 100mg xanh metylen hòa tan trong 200ml etanol (C2H5OH) 96%.
3.Nguyên vật liệu: Nguyên liệu cá, tôm
4.Cách tiến hành
4.1 Nguyên tắc chung
Vô cơ hóa mẫu thử bằng acid sunfuric đậm đặc, nitơ có trong mẫu thử chuyển thành
amon sunfat (NH4)2SO4. Dùng kiềm đặc đẩy amoniac ra khỏi amon sunfat trong máy cất
đạm, tạo thành amon hydroxit hấp thu vào acid boric, rồi định lượng bằng acid H2SO4 0,1N. 4.2
Tiến hành thử.
Cân chính xác 0,3-0,5g mẫu thử vào ống Kjeldahl sao cho mẫu không dính vào thành
bình, cho tiếp 10ml acid sunfuric đậm đặc và 10 mL H2O2.
Lắp và hệ thống công phá mẫu.
Chỉnh nhiệt đến 110oC và giữ trong 20 phút.
Chỉnh nhiệt đến 200oC và giữ trong 20 phút.
Chỉnh nhiệt đến 300oC và giữ trong 20 phút.
Chỉnh nhiệt đến 370oC và giữ trong 20 phút 11
Hoàn tất công phá, dung dịch có màu trắng, nếu dung dịch vẫn còn màu đen thì nâng
nhiệt lên 110 oC và cho vào 5 mL H2O2 để dung dịch chuyển hoàn toàn sang màu trắng.
Nếu dung dịch vẫn không đổi sang màu trắng thì cho thêm 5mL H2O2 vào tiếp và thực hiện công phá lần 2.
Sau khi công phá mẫu xong thì tiến hành chưng cất mẫu trong máy chưng cất đạm.
Lắp ống Kjeldahl sau khi công phá vào hệ thống chưng cất, lắp bình tam giác có chứa 10
mL acid boric 2%, chỉnh máy cấp 60 mL NaOH 40% và tiến hành chưng cất trong 5-10
phút. Sau khi chưng cất, dung dịch acid boric (H3BO3) hấp thu NH4OH tạo thành
(NH4)2B4O7 có màu xanh. Chưng cất xong lấy bình tam giác chứa (NH4)2B4O7 có màu
xanh ra ngoài và chuẩn độ với acid H2SO4 0.1N cho đến khi dung dịch trở về màu hồng, màu của acid boric.
5. Tính toán kết quả.
Hàm lượng nito tổng số (X) tính bằng % theo công thức: X=
(V1−V2)*0.0014*100 m
Hàm lượng đạm cá: lấy hàm lượng nitơ nhân cho 6.25 12
BÀI 13 CHIẾT TÁCH MẤU PHA RẮN VÀ PHA LỎNG
Mục tiêu: giúp sinh viên hiểu được phương thức tách chiết mẫu qua các phương pháp khác
nhau áp dụng trong phân tích thực phẩm thủy sản Nội dung:
1. Chiết tách mẫu pha rắn thông qua cột SPE (solid phase extraction).
2. Chiết tách mẫu pha lỏng sử dụng các dung môi không hòa tan.
3. Chiết tách mẫu pha rắn và lỏng BÀI 14
PHÂN TÍCH ENROFLOXACIN VÀ CIPROFLOXACIN TRÊN HPLC-FLUORESENCE. 1. Pha chuẩn sắc ký 2. Pha pha động.
3. Chạy chuẩn trên HPLC-fluoresence và giải thích nguyên lý. BÀI ĐỌC THÊM
QUY TRÌNH CHIẾT TÁCH Fluoroquinolone – ELISA – Bioo scientific
Mẫu cơ cá tôm-quy trình chiết tách
- Đồng hóa mẫu phân tích
- Cân 1 g mẫu cho vào ống Falcon 15ml hay ống thủy tinh.
- Thêm vào 4mL MeOH:H2O (70:30), lắc mạnh và trộn đều trong 10 phút bằng máy lắc.
- Ly tâm 5 phút, 4000 g, ở nhiệt độ phòng.
- Hút 0,5 mL dịch chiết cho vào ống Falcon mới được đánh dấu.
- Thêm 0,5 mL 1X Sample Extraction bufer, lắc đều
- Hút 50 μL dịch chiết cho vào giếng phân tích (well) sau khi giếng đã chuẩn bị xong.
Chuẩn bị hóa chất: 13
Chuẩn bị 1X HRP-Conjugate Antibody \\ 2 : trộn 1 thể tích của 100 X RHP-conjugate
Antibody \\ 2 với 99 thể tích antibody \\ 2 Diluent
Chuẩn bị 1X Wash Solution: hòa tan 1 thể tích 20X Wash Solution với 19 thể tích nước QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Fluoroquinolone – EIA –
1. Chiết tách mẫu (đã thực hiện phía trên).
2. Pipette 50 μL dung dịch Enrofloxacin chuẩn standard solution vào các well
3. Hút 50 μL dung dịch chiết tách mẫu vào các well khác đường chuẩn, lặp lại 2 lần.
4. Thêm vào 100 μL Antibody 1 vào tất cả các well, lắc 1 phút.
5. Ủ các well 30 phút trong điều kiện nhiệt độ phòng
6. Loại bỏ tất cả dung dịch trong các well, rửa các well 3 lần bằng dung dịch rửa 1X Wash Solution (250 uL).
7. Hút 150 μL 1X HRP-Conjugated Antibody \\ 2
8. Ủ các well 30 phút trong điều kiện nhiệt độ phòng
9. Loại bỏ tất cả dung dịch trong các well, rửa các well 3 lần bằng dung dịch rửa 1X Wash Solution (250 uL).
10. Thêm 100 μL TMB substrate solution vào tất cả các well, lắc đều 1 phút và ủ trong
15 phút ở nhiệt độ phòng.
11. Pipette 100 μL dụng dịch stop solution vào tất cả các well để dừng phản ứng
12. Đo các giá trị hấp thu ở bước sóng 450nm ngay sau khi thêm vào dung dịch dừng
phản ứng, trong vòng 15 phút. 1 2 3 4 5 6 7 8 9, 10,11,12.. A B C D E 14 F G H 13. Dung dịch thử
Một số dung dịch thử cần được pha loãng trước khi sử dụng, cần tính toán chính xác
lượng dung dịch cần sử dụng trước khi pha loãng nhằm hạn chế hao phí hóa chất.
Bộ test kit phải được lưu trữ trong tủ mát 2-8 C o
Rising buffer: pha loãng 20 lần trước khi sử dụng.
Sample extract buffer: pha loãng 10 lần Tính toán kết quả: 15